Clase HPLC

INTRODUCCION A LA
CROMATOGRAFIA DE
ALTA EFICACIA - HPLC
INTRODUCCION A LA CROMATOGRAFIA DE ALTA EFICACIA - HPLC
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE
ALTA EFICACIA
En la cromatografía liquida de
alta eficacia, un liquido (fase
móvil) entra en contacto con
un sólido u otro líquido
inmiscible (fase estacionaria),
al introducir al sistema una
mezcla de analitos, migran por
la corriente de la fase móvil
con una velocidad diferente
que dependerá de la afinidad
de los analitos por cada una
de las fases.
Las reglas básicas en HPLC son cuatro:

1. Fase móvil y estacionaria han de ser de polaridad opuesta.
2. Todos los solutos han de ser solubles en la fase móvil (es decir,
polaridad similar).
3. Todo soluto que entra en la columna ha de salir de ella
(propagación).
4. Y, de ser posible, con los distintos solutos separados (migración
diferencial).
HPLC ideal para muestras con:
Presión de vapor baja.

Compuestos iónicos.
Compuestos de peso molecular elevado.
Compuestos Termolábiles.
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE
ALTA EFICACIA
Cromatografía Cromatografía
de adsorción de intercambio
iónico
HPLC
Cromatografía
Cromatografía de exclusión
de reparto molecular
ESQUEMA DEL SISTEMA DE HPLC
Fase estacionaria
ESQUEMA DEL SISTEMA DE HPLC

BOMBAS
Las bombas tienen la función de suministrar la

fase móvil al sistema de manera constante,
ejerciendo presiones altas para poder
movilizar los analitos a través del equipo.
Características que deben cumplir:

- Construidas con materiales químicamente
inertes frente a la fase móvil.
- Flujos constantes, libres de pulsaciones.
- Caudal adecuado para diferentes tipos de
columnas (entre 1 y 10 mL/min).
SISTEMAS DE INYECCION
DETECTORES
RESPUESTA RUIDO
CARACTERISTICAS
DERIVA SENSIBILIDAD
DETECTORES
- Detector de ultravioleta y/o visible.

- Detector de fluorescencia.
- Detector de conductividad eléctrica.
- Detector electroquímico.
- Detector de índice de refracción
Propiedad de la solución Propiedad del soluto
Índice de refracción Absorbancia (UV-Vis)
Conductividad Fluorescencia
Densidad Electroquímicos
Detector HPLC LD (masa)

Absorbancia 100 pg-1 ng
Fluorescencia 1-10 pg
Electroquímico 10 pg-1 ng
Índice de refracción 100 ng- 1 µg
Conductividad 500 pg-1 ng
Espectrometría de masas 100 pg- 1 ng
FT-IR 1 µg
DETECTOR UV-VIS
ANALÍTICAS
Longitud Diámetro interno Material de relleno
5 a 30 cm 1 a 5 mm Tamaño de partícula
3 a 5 μm
COLUMNAS
Parámetros que influyen en las columnas:
- Diámetro interno.
- Longitud de la columna.
- Conexiones.
- Material de relleno.
- Tamaño de la partícula de relleno

COLUMNAS
Elimina materia en suspensión
Composición de relleno semejante a la columna analítica

Precolumnas
Elimina contaminantes de los solventes
Tamaño de partícula de relleno mayor
Elimina los componentes de la muestra que se unen a la columna
Se sacrifica para proteger a la columna analítica

FASES ESTACIONARIAS DE LAS

COLUMNAS PARA HPLC
Gel de sílice (sílica)
Alúmina
Tierra de diatomáceas (celita)
Poliamida
Celulosa
FASE ESTACIONARIA
El soporte más común es la sílica, que son partículas micro
porosas, esféricas y altamente puras.
Micrografía de las partículas de sílica usadas en fases estacionarias comunes.

a) Partículas esféricas agregadas con un 50% de porosidad y área superficial de 150
m2/g.
b) Estructura porosa de sílica con 70% de porosidad y área superficial de 300 m 2/g.
En ambos casos, los tamaños de poros alcanzan los 10 nm de tamaño.
¿Por qué la sílica?

- Posee gran resistencia mecánica
- Diversidad de formas, tamaños y diámetros de poro.
- Gran variedad de superficies especificas.
Estructura esquemática de las partículas

de sílica.
Soporte de sílica puede ser usado como fase estacionaria por

cromatografía de adsorción o cromatografìa de partición líquido-líquido. Las
fases estacionarias se enlazan covalentemente a la superficie de la sílica
por reacción química:
La fase estacionaria octadecil (C18),

es de lejos la más comúnmente usada
en HPLC. ODS=Octa-Decil-Silano:
Tamaño de partícula de la fase

estacionaria
Gráfica de Van Deemter. Altura de plato equivalente en

función de la velocidad de flujo, variando el tamaño de
partícula de la fase estacionaria.
En a) y b) los cromatogramas tienen la misma muestra a la misma

velocidad lineal, en una columna de sílice C18. En c) se utiliza un
solvente de más polaridad para eluir más rápidamente los analitos.
Tamaño de partícula
Micropartículas porosas de
Esferas de vidrio o polímero
Partículas porosas de sílica, alúmina o polímero
no porosas (30-40 µm)
sílica, alúmina o (3-10 µm)
Cubierta con capa delgada y
Cubierta con películas org.
polímero (40-60 µm) porosa de sílica, alúmina,
(unidas química o
polímero
físicamente a la superficie)
Eficiencia de la columna en función del diámetro de

partícula de la fase estacionaria.
Fase móvil
- Reactivos de alta pureza
- Ser compatible con el detector utilizado.
- Ser miscible con el agua en un amplio margen de proporciones.
- No reaccionar ni con la fase estacionaria ni con la muestra a separar.
- Ser poco tóxico.
- Sus vapores no deben producir mezclas inflamables con el aire.
- No deben impedir la detección de los solutos.

El proceso de elución
Fase normal (NP) Fase reversa (RP)

• FE: polar (sílica) • FE: no polar
• FM: no polar • FM: polar (acetonitrilo, agua, acetato de etilo, acetona y
alcoholes alifáticos)
• Solutos: polar (esteroides, lípidos, fosfolípidos, ácidos
grasos) • Solutos: no polares (pequeñas proteínas, péptidos,
nucleótidos)
• El componente menos polar se eluye primero
• Los componentes más polares eluyen primero
• El aumento de polaridad de la FM disminuye del
tiempo de elución • El aumento de polaridad de la FM aumenta el tiempo de
elución
El proceso de elución
Serie elutrópica Ɛº
Fase Normal:
FE polar - FM No-polar
Fase Reversa:
FE No-polar - FM polar
Elución por gradiente y elución isocrática

Elución isocrática: Un solvente o mezcla de solventes.
Separación isocrática HPLC de una mezcla de compuestos aromáticos a 1,0 mL/min.

Columna 0,46x25cm Hypersyl ODS (C18 sobre 5-um de sìlica) a 22ºC:
1) Alcohol bencílico; 2) Fenol; 3) 3,4-dimetoxi-acetofenona; 4) benzoína; 5) benzoato de
etilo; 6) Tolueno, 7) 2,6-Dimetóxitolueno; 8) o-metoxibifenilo.
A= Buffer acuoso. B= Acetonitrilo.
Elución por gradiente: cambios continuos de la composición del solvente en HPLC para aumentar la fuerza de
elución.
Elución por gradiente de la misma mezcla de

compuestos aromáticos, utilizando la misma columna,
velocidad de flujo y solventes. 1) Alcohol bencílico; 2)
Fenol; 3) 3,4-dimetoxi-acetofenona; 4) benzoína; 5)
benzoato de etilo; 6) Tolueno, 7) 2,6-Diemtóxitolueno;
8) o-metoxibifenilo.
A= Buffer acuoso. B= Acetonitrilo.
Selección del método de separación

Selección del método de separación

Ejercicio de aplicación
El aldehído cinámico es el compuesto del que depende el sabor de la

canela. También es un antimicrobiano potente, que forma parte de ciertos
aceites esenciales. La respuesta de la cromatografía de gases (CG) con
una muestra artificial que contiene seis componentes de aceites La siguiente figura es una ampliación de la región cerca del pico del
esenciales y metilbenzoato como patrón interno se muestra en la siguiente aldehído cinámico.
figura:
Calcular:
a) El número de platos teóricos para el compuesto de estudio.
b) La columna de sílice fundida tiene 0.25 mm x 30 cm de diámetro y longitud de columna respectivamente, y con un
tamaño de partícula de 0.25 μm. Determinar la altura de plato teórico.
c) Se obtienen datos cuantitativos empleando metilbenzoato como patrón interno (1,00 ug mL-1) para los compuestos
aldehído cinámico y timol, tal y como se muestra en la siguiente tabla. Sabiendo que los valores de área relativas para
cada compuesto se calculan dividiendo el área del pico del componente/área del patrón interno, calcular: el área relativa
para los dos compuestos anteriormente mencionados, determine las ecuaciones de la curva de calibrado para cada
componente y a partir de los datos del apartado anterior determinar qué componente tiene mayor sensibilidad.
d) Para la determinación de aldehído cinámico en una muestra de canela, previamente tratada, se encontraron los
siguientes valores de áreas de pico absoluta. Metil benzoato: 18466; Aldehído cinámico: 55450; Timol: 98652. Hallar la
concentración de Timol y aldehído cinámico en la muestra de canela.

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INTRODUCCION A LA

Las reglas básicas en HPLC son cuatro:

HPLC ideal para muestras con:

Presión de vapor baja.

ESQUEMA DEL SISTEMA DE HPLC

ESQUEMA DEL SISTEMA DE HPLC

Las bombas tienen la función de suministrar la

Características que deben cumplir:

- Detector de ultravioleta y/o visible.

Propiedad de la solución Propiedad del soluto

Índice de refracción Absorbancia (UV-Vis)

Detector HPLC LD (masa)

Longitud Diámetro interno Material de relleno

Parámetros que influyen en las columnas:

- Tamaño de la partícula de relleno

Elimina materia en suspensión

Composición de relleno semejante a la columna analítica

Elimina contaminantes de los solventes

Tamaño de partícula de relleno mayor

Elimina los componentes de la muestra que se unen a la columna

Se sacrifica para proteger a la columna analítica

FASES ESTACIONARIAS DE LAS

Gel de sílice (sílica)

Tierra de diatomáceas (celita)

Micrografía de las partículas de sílica usadas en fases estacionarias comunes.

¿Por qué la sílica?

- Diversidad de formas, tamaños y diámetros de poro.

- Gran variedad de superficies especificas.

Estructura esquemática de las partículas

Soporte de sílica puede ser usado como fase estacionaria por

La fase estacionaria octadecil (C18),

Tamaño de partícula de la fase

Gráfica de Van Deemter. Altura de plato equivalente en

En a) y b) los cromatogramas tienen la misma muestra a la misma

Eficiencia de la columna en función del diámetro de

- Reactivos de alta pureza

- Ser compatible con el detector utilizado.

- Ser miscible con el agua en un amplio margen de proporciones.

- No reaccionar ni con la fase estacionaria ni con la muestra a separar.

- Ser poco tóxico.

- Sus vapores no deben producir mezclas inflamables con el aire.

- No deben impedir la detección de los solutos.

Fase normal (NP) Fase reversa (RP)

Elución por gradiente y elución isocrática

Separación isocrática HPLC de una mezcla de compuestos aromáticos a 1,0 mL/min.

Elución por gradiente de la misma mezcla de

Selección del método de separación

Selección del método de separación

El aldehído cinámico es el compuesto del que depende el sabor de la

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