HPLC

El término cromatografía procede de la palabra griega chroma- que significa color y -

graphein que significa escribir. El primer uso registrado de la cromatografía en
columna se le otorga al científico ruso Mikhail Tsvet que trituró carbonato de calcio en
un tubo y posteriormente agregó hojas de una planta verde homogeneizadas,
seguido de un solvente orgánico. Tsvet observó bandas de colores separadas a medida
que el solvente pasaba a través del tubo. Así es como la cromatografía práctica
comenzó al principio, separando con éxito varios pigmentos de las hojas. En el mundo
de hoy, hay muchos analitos que son incoloros y están separados por técnicas
cromatográficas, todavía se le conoce con el mismo nombre.

Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC)

Es un tipo de cromatografía en columna en el que por acción de una bomba, se hace

pasar una mezcla de compuestos o analitos en un sistema disolvente comúnmente
conocido como fase móvil. La fase móvil pasa a través de una columna
cromatográfica, que contiene la fase estacionaria a un flujo especificado. La separación
de los compuestos ocurre en base a la interacción de éstos con la fase móvil y la fase
estacionaria.

Cromatografía líquida de Ultra-Alta eficacia (UHPLC)

Es una tecnología basada en el principio de que un tamaño de partícula menor

conlleva una mayor eficiencia, rápidas separaciones con mayor resolución y
sensibilidad. Sin embargo, para resistir la presión extrema de las partículas más
pequeñas de 2 µm, el equipo necesita ser capaz de trabajar a alta contrapresión. La
eficiencia de estas columnas no debe perderse en el resto del equipo, debido al
volumen muerto, por ello se diseñaron equipos capaces de trabajar a altas presiones.

Debido a que los instrumentos de UHPLC tienen un coste elevado, a finales del 2000,
Phenomenex lanzó las columnas Kinetex 2,6 μm con tecnología Core-Shell, que
proporciona un rendimiento UHPLC en un equipo HPLC tradicional. De esta forma se
puede utilizar el instrumento de HPLC tradicional que se posee en el laboratorio y
lograr un rendimiento equivalente de UHPLC.

Modos de separación.

Hay muchos modos de separación en cromatografía y cada uno tiene sus propios
principios.

A continuación presentamos una guía de selección de columnas de HPLC para ayudar

a los lectores a elegir el modo de análisis correcto. Aunque hay muchos modos de
separación disponibles para resolver las mezclas en un cromatógrafo la separación
mediante Fase Reversa (RP) es el modo más común en cromatografía líquida.

“¿Por qué la fase reversa se llama fase reversa?”

La respuesta es simple:

La cromatografía evolucionó a partir del uso de la fase estacionaria polar y de un

eluyente no polar como componente principal de la fase móvil, por ello se consideró la
práctica normal, de ahí el nombre de fase normal. Si bien este modelo separó
componentes basados en su naturaleza polar, hubo una gran cantidad de mezclas de
analitos que no eran polares y tenían características hidrofóbicas que necesitaban
separación.

El uso de una fase estacionaria no polar, con una fase móvil polar ayudó a separar
estos analitos hidrofóbicos. Dado que esta práctica es inversa a la fase normal, se
utiliza el término fase reversa. Esto es similar a llamar a un jugador de ping-pong
derecho como normal y un jugador de ping-pong zurdo como el original.
Proceso de separación en Fase Reversa

Ahora que sabemos que el modo más popular de cromatografía líquida es la fase
reversa, vamos a explorar cómo funciona.

A continuación se muestra un esquema del proceso de separación. La mezcla de

analitos se representa por puntos azules, morados y rojos, que se introducen de
manera conjunta en la columna que contiene una fase estacionaria de fase reversa no
polar. Las flechas rojas representan la dirección del flujo de la fase móvil. Cuando la
mezcla de analitos mixtos entran en la columna, la fase móvil empuja los analitos por
la columna. A medida que avanzan entran en contacto con la fase estacionaria. Los
analitos que tengan una mayor afinidad por la fase estacionaria (puntos azules) serán
retenidos más fuertemente y eluirán más tarde en la carrera. Por lo tanto, puede
separar los analitos basándose en la intensidad con la que interactúan con la fase
estacionaria.

En el siguiente ejemplo se representa una fase estacionaria, hidrofóbica no polar, más

concretamente una C18. La fase móvil consiste en un componente acuoso polar,
hidrófilo, usualmente agua y acetonitrilo o metanol. Los analitos se separarán
basándose en su afinidad relativa por estas dos fases. Los compuestos hidrófobos,
tales como el benzopireno, tendrán una fuerte afinidad por la fase estacionaria
hidrófoba, y estarán fuertemente unidos. Los compuestos hidrófilos tales como sulfato
de etilo tendrán poca afinidad por la fase estacionaria y permanecerán principalmente
en la fase móvil y se transportarán rápidamente a través de la columna.
Aunque la separación en fase reversa se produce por la interacción hidrofóbica, existen
tres mecanismos primarios de interacción que dictan el comportamiento
cromatográfico global.

Esto incluye:

1. Interacciones hidrofóbicas
2. Interacciones polares
3. Interacciones iónicas

A parte de esas tres interacciones, la selectividad estérica y la forma de la molécula en

ocasiones también pueden contribuir a la interacción. Usando el ejemplo del
tapentadol, una molécula farmacéutica típica de pequeño tamaño, podemos mostrar
mejor estos tres tipos de interacción, ya que posee componentes polares, hidrofóbicos
y también iónicos.

Interacciones Hidrofóbicas

Es el mecanismo primario en RP-HPLC y que determina el comportamiento de

retención. Es decir la interacción hidrófoba entre el ligando de fase estacionaria no
polar (por ejemplo C18) y la naturaleza hidrófoba de la molécula de muestra (por
ejemplo, el esqueleto de carbono).

Ésta es una interacción débil y transitoria entre una fase estacionaria no polar y las
moléculas, que incluye interacciones hidrofóbicas y de van Der Waals. Se puede
predecir una estimación razonable de la retención basada en el valor Log P, o
coeficiente de coeficiente de reparto octanol-agua. El Log P es la Relación entre
octanol y agua en una extracción líquido-líquido. En otras palabras, cuanto más
hidrofóbica es una molécula, mayor es el valor de Log P que tiene, lo que se traduce
en mayor retención en RP-HPLC.

Interacciones Polares

Estas son interacciones que ocurren entre los grupos funcionales polares de los
analitos. También se producen entre silanoles residuales, grupos polares incrustados,
grupos polares superficiales o grupos terminales polares en la fase estacionaria.
Interactúan con el analito a través de enlaces de hidrógeno y dipolo-dipolo. Estas
interacciones son relativamente débiles y transitorias en comparación con la
interacción de intercambio iónico.
Interacciones de Intercambio Iónico

La mayoría de las fases estacionarias en RP se basa en un soporte de sílice a la que se

le ancla una fase no polar tal como C18. Los fabricantes de columnas cromatográficas
como Phenomenex, tratan de lograr la inactivación completa de todos los grupos
silanol de la sílice, sin embargo este proceso no puede eliminar el 100% de los grupos,
dando lugar a grupos silanol residuales en superficie (Si-OH) que están ocultos. Estos
silanoles pueden desprotonarse y adquirir una carga negativa, e interaccionar
iónicamente con moléculas básicas de analito cargadas positivamente. Estas
interacciones de intercambio iónico son muy fuertes y lentas, en contraste con las
interacciones hidrofóbicas y polares. Por lo tanto, cuando ocurre intercambio de iones,
los analitos experimentan diferentes tasas de interacción (lento vs rápido), y esto
puede conducir a la distorsión de pico. Este es un ejemplo clásico de analitos básicos
que interactúan con silanoles residuales, que pueden ser controlados neutralizando el
silanol o neutralizando el analito analizándolos a pH alto.
Para más información sobre HPLC/UHPLC y las diferentes columnas que pueden
utilizarse, por favor visite nuestra web.

Estándar añadido

1) Adicionar un Vx constante de concentración desconocida a cada frasco

2) Adicionar VS variables del patrón a todos los frascos menos el 1
3) Se llenan los frascos hasta su volumen total Vt

La respuesta instrumental S es directamente proporcional a la concentración Ca

 S = K Ca
𝑛𝑎
𝐶𝑎 = 𝑦 𝑛𝑎 = 𝐶𝑠 𝑉𝑠 + 𝐶𝑥 𝑉𝑥
𝑉𝑡

De donde

𝐶𝑠 𝑉𝑠 + 𝐶𝑥 𝑉𝑥
𝐶𝑎 =
𝑉𝑡

Juntando las dos ecuaciones

𝑘𝐶𝑠 𝑉𝑠 𝑘𝐶𝑥 𝑉𝑥
𝑆= +
𝑉𝑡 𝑉𝑡

Ya que el segundo sumando es una constante, tiene la forma

y = mx + b

donde

y = S y x = Vs
Método 1: por cálculo

𝑘𝐶𝑥 𝑉𝑥
𝑏=
𝑉𝑡

𝑘𝐶𝑠
𝑚=
𝑉𝑡

𝑘𝐶𝑥 𝑉𝑥
𝑏 𝑉𝑡
=
𝑚 𝑘𝐶𝑠
𝑉𝑡

De donde

𝑏𝐶𝑠
𝐶𝑥 =
𝑚𝑉𝑥

Método 1: por extrapolación

𝑘𝐶𝑠 𝑘𝐶𝑥 𝑉𝑥
𝑆=( ) 𝑉𝑠 +
𝑉𝑡 𝑉𝑡
Se extrapola la recta hasta el x-intercepto, donde y = 0

𝑘𝐶𝑠 (𝑉𝑠 )0 𝑘𝐶𝑥 𝑉𝑥

0= +
𝑉𝑡 𝑉𝑡

Así

𝑘𝐶𝑠 (𝑉𝑠 )0 𝑘𝐶𝑥 𝑉𝑥

=−
𝑉𝑡 𝑉𝑡

De donde

(𝑉𝑠 )0 × 𝐶𝑠
𝐶𝑥 = −
𝑉𝑥