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Primer cuatri 2018

Genética Bacteriana

El ADN puede ser transferido entre bacterias por conjugación, transformación

o transducción.

Conjugación Bacteriana

Descubrimiento
Estudiaban dos cepas con distintos sets de mutaciones auxotróficas. Dos que eran
+ o - para distintos aa. Se mezclaron y plaquearon en un medio mínimo donde una
auxotrófica no podía crecer. Algunas bacterias crecieron. Los resultados sugerían
que ​alguna forma de recombinación de genes había ocurrido entre los genomas de
ambas cepas para producir bacterias prototróficas.
¿Y si en lugar de intercambiar genes liberan sustancias que otras células pueden
absorber y usar para crecer?

Se descartó esta posibilidad construyendo un

tubo en U cuyos brazos estaban separados
por un filtro. Los poros eran demasiado finos
para evitar que lo pasen las bacterias pero
suficientemente grande para que pudieran
pasar sustancias.
Se puso una cepa de cada lado. No se
encontraron cepas prototróficas. ​Se
necesitaba el contacto físico entre las cepas
para que se formaran células wt.

¿Que es la conjugaciòn?
Unión de dos bacterias en la que se transfiere material cromosómico simple cadena
de la célula donora, que forma el sex pilus, a la receptora donde la simple cadena,
sirviendo como molde, se convierte en doble cadena. Dos casos:
● Transferencia de plásmidos
Se produce entre una bacteria conteniendo un plásmido Factor F llamada F+ y una
que no lo tiene F-.
En este caso, sólo se transfiere una copia (en general completa) del plásmido (ej.
factor F) por lo que la célula receptora (F-) se convierte en F+. NO hay transferencia
de genes cromosómicos.

● Transferencia de genes bacterianos: Cepas Hfr (“High frequency

recombination”)
Como el plásmido F puede tener secuencias homólogas al cromosoma bacteriano,
puede ocurrir recombinación, donde el plásmido F se integra a este. El ​oriT ​y los
genes ​tra ​siguen siendo funcionales, y promueven la transferencia del cromosoma
desde la cepa Hfr a una F-, que puede llegar incluso a ser completa, siendo lo último
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que se transfiere el elemento F. La transferencia cromosómica es la causa de la alta

frecuencia de recombinación de estas cepas y de allí su nombre Hfr.

La inserción de F crea una cepa Hfr. O es el punto en donde comienza la

transferencia. Las regiones homólogas se derivan de IS. En este ejemplo se
transferirán en orden a, d, c, b.

Mecanismo

Primero se ​nickea​ una de las cadenas, en el ​oriT ​(origen de transferencia). Una

helicasa comienza a separar ambas cadenas, y comienza la transferencia de una.
Termina cuando se transfiere la secuencia completa (plásmido) o cuando se
interrumpe el contacto entre la bacteria aceptora y la dadora (transferencia
cromosómica). En el caso de los plásmidos, cuando finaliza la transferencia se
recircularizan utilizando el ​oriT ​ y la cadena complementaria se sintetiza ​de novo
tanto en la bacteria dadora como en la aceptora. En la transferencia puede que haya
recombinación o que se cierre el episoma.

Tomar el tiempo de entrada de los marcadores permite generar un mapa

cromosómico

Se logra mediante la técnica de apareamiento interrumpido. Cuando una cepa Hfr

conjuga con una cepa F-, el ADN se transfiere desde el ​oriT ​y generalmente no es
completa, se interrumpe. El ADN transferido puede recombinar con el cromosoma
de la cepa aceptora pero por la interrupción de la conjugaciòn, la frecuencia de
recombinantes cae con la distancia al ​oriT.​
Para determinar el orden entre dos marcadores se analizan la cantidad de doble
recombinantes. Cuanto mayor es la frecuencia, menor es la distancia entre ellos.
Por lo tanto, se hace cronometrando la aparición de recombinantes en una
conjugación entre una Hfr y una F- que se interrumpe artificialmente con una
licuadora a distintos intervalos.

¿Por qué doble recombinantes? El mecanismo molecular es un poco diferente al de

doble recombinantes pero es la misma idea.
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Hay una copia completa circular del F- y una incompleta del Hfr. Un solo crossover
llevaría a la linealización, lo que rompería el ADN circular y no sería viable. Para que
se mantenga el círculo tiene que haber números pares de crossovers.
Plásmido F’: plásmidos F que se llevan fragmentos genómicos

El factor F en Hfr es generalmente bastante estable en su posición insertada. Sin

embargo, ocasionalmente un factor F sale del cromosoma por una inversión del
proceso de recombinación que lo insertó en primer lugar. Ocurre por recombinación
entre los sitios IS flanqueantes (los mismos que permitieron la integración), y se
produce un cruce para liberar el plásmido F. Sin embargo, a veces la salida no es
limpia (por ejemplo porque ocurre entre regiones IS más lejanas), y el plásmido lleva
consigo una parte del cromosoma bacteriano.
La transferencia de DNA no requiere de recombinación en el cromosoma porque el
plásmidos F’ que lleva el gen puede replicarse en la célula receptora F- y
mantenerse en la descendencia.

Se forma un diploide parcial F’ lac+/F-lac-

El orden de transferencia de los genes no es siempre el mismo en cepas Hfr

diferentes, pero si se alinea las secuencias respecto a un gen se ven que los genes
de al lado son los mismos y esto tiene sentido porque el ​genoma bacteriano es
circular​ y el oriT varía de una cepa a otra. (La orientación y posición del factor F
difiere entre las cepas porque se puede insertar diferente en cada una)

Plásmido auto transmisible: Plásmido F

100 KB
➔ OriT ​ (sitio de clivaje y ciclización, se requiere en ​cis)​ ​~300 pb
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Para identificar el origen de transferencia:

Corto el DNA del plásmido auto transmisible en cachitos, y los meto en
vectores no transmisibles con resistencia a ampicilina, y transformo una
bacteria dadora. Pongo una bacteria aceptora y selecciono con ampicilina
(para seleccionar las que hayan incorporado el plásmido) y str (para dejar
solo las aceptoras), el plásmido no transmisible que por conjugación paso a
la bacteria aceptora es el que tenía el oriT.

➔ Genes ​Tra​ ~ ​20 (se requieren p/transferencia, actúan en ​trans). Dos

grandes grupos de genes:

● Dtr (DNA transfer and replication): Generalmente son cuatro genes, contiene
Relaxasa que “nickea” el plásmido y se une mediante Tyr
(transesterificación), se transfiere con el ADN, una primasa que también se
transfiere genera la cadena complementaria y relaxasa vuelve a circularizar el
plásmido. Relaxasa + otras π del oriT: Relaxosoma
● Mpf (mating pair formation)
Pilina es la que forma el pilus

Aislamiento de mutantes tra:

Infecto bacterias que tenían plásmido transmisible con resistencia a
ampicilina usando fago lambda suicida con la transposasa Tn5 (generaría
mutantes). Liso las bacterias, tomo la población de plásmidos con insertos al
azar y transformo (para no depender de la conjugación) bacterias dadoras,
seleccionando con ampicilina. ​Las pongo con bacterias aceptoras. Ahora ​me
interesan las bacterias que no sean resistentes a ampicilina​ porque
significa que no hubo conjugación, es decir que tenían una mutaciòn en la
región Tra. Para eso hago Replica Plating, poniendo un fieltro sobre la placa
madre y transfiriendolas a dos placas de petri nuevas, una con y otra sin
ampicilina, recupero de la placa madre las que sean ampicilina sensible. (de
alguna forma tengo que comparar la aceptora vacía con la dadora que tenga
el inserto y si uso str las mato todas)
➔ gen TraST​ (“entry exclusión”; impide ser aceptoras a las bacterias F+)

También hay ​transferencia del material genético entre reinos ​con genes Vir
(similares a tra)

Aplicaciones Biotecnológicas
● Permite transferir información genética a un amplio rango de huéspedes
● Conjugación triparental
● Medio ambiente

Transformación Bacteriana
Descubrimiento

Griffith (1928)
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Inyectó en ratones la ​cepa S​ y la ​cepa R​ de la ​bacteria​. La cepa S era letal, la R no.

Cuando, inactivada por calor, la cepa S era inyectada, no había secuelas y el ratón
vivía. Sorprendentemente, al combinar ​cepa R​ (no letal), con cepa S inactivada por
calor (no letal), el ratón murió. Además, Griffith encontró células de cepa S vivas. En
apariencia la cepa R se convirtió en cepa S.
La inactivación por calor habría dejado intacto el ​ADN​ de los ​cromosomas​ de las
bacterias​, que era el causante de la formación del ​gen​ S, y podía ser liberado por
las células destruidas e implantarse en la cepa R.
Una bacteria de la cepa dadora (WT) complementó a una célula de la cepa
receptora (mutante en algún gen de síntesis de la cápsula) mediante recombinación
homóloga.

¿Y si no era el ADN lo que las transformaba?

En 1944, se vio que tras eliminar los lípidos, π y polisacáridos, se conservó la
capacidad de replicar su ​ADN​ e introducirlo en ​neumococo​ R. ​El principio
transformante era el DNA.
Mecanismo

Bacterias competentes. Entra DNA simple cadena a la aceptora, hay tres hebras y
por doble recombinación homóloga se incorpora el DNA foráneo. En la replicación,
una célula hija recibe la copia original y la otra la copia de DNA foráneo.

Diferencia con la conjugación: En la conjugación el DNA se transfiere de una célula

viva a otra por contacto cercano, en cambio en la transformación, piezas aisladas de
DNA son tomadas por las células a través de la membrana plasmática.

Mapeado cromosómico usando la transformación

Que tan cerca están dos genes en un cromosoma. Si dos genes donores están
cerca hay altas probabilidades de que estén juntos en la misma pieza de DNA
transformante. En ese caso, ambos se van a incorporar, causando una doble
transformación.
La tasa relativa a la que los pares de genes se cotransforman indica la distancia que
los separa: cuanto mayor es la tasa de cotransformación, más cercanos están los
genes a los cromosomas bacterianos

Transducción: Fagos
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Mecanismo

Los bacteriófagos tienen dos ciclos de vida alternativos: lítico y lisogénico. En el

ciclo ​lítico​, un fago se une a un receptor en la pared celular bacteriana e inyecta su
ADN en la célula. Dentro de la célula huésped, el ADN del fago se replica, transcribe
y traduce, produciendo más π de fago y ADN de fago. Las nuevos fagos se
ensamblan y rompen la célula huésped, liberando los nuevos fagos. Siempre matan
a sus células huéspedes.
En el ciclo ​lisogénico​ el ADN del fago se integra en el cromosoma bacteriano
donde permanece como un​ profago​ inactivo. El profago se replica junto con el ADN
bacteriano y luego se transfiere a las células hijas. Ciertos estímulos pueden causar
que el profago se disocie del cromosoma y entre en el ciclo lítico.

Replicación del DNA por círculo rodante

Es distinta a la replicaciòn de un plásmido en la que una copia de DNA circular me

da dos. Aca una molécula da múltiples copias.
Empieza por una enzima codificada por el virus que nickea una hebra del dsDNA.
Esta proteína se queda unida al 5’ y el 3’ OH está libre y sirve como primer para la
pol III que usa la hebra que no se nickeo como molde y la nickeada se va
desplazando como DNA simple cadena. Cuando termina la replicación, se hace otro
nick y se recircularizan.

El largo concatémero que

se forma (cadena de
genomas) se corta por la
proteína pA que reconoce
las secuencias cos, en
genomas individuales que
son empaquetados.

La forma de estudiar fagos es por ​playas de lisis ​que se producen por la infección
de bacterias en placas con agar. Ponemos un volumen conocido de sc y contamos
las playas y podemos conocer la concentración de fagos en la solución original.
Índice de Multiplicidad de Infección​ (MOI) el cual es el número de genomas
virales que infectan a una célula.

Mapeo genético de un fago: Recombinación en virus

Depende de la recombinación homóloga entre cromosomas del fago. Se hacen

cruzas entre fagos que difieren en dos o más genes, se identifica y cuenta la
progenie recombinante y esta proporción se usa para estimar la distancia entre
genes y su orden en el cromosoma.
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Hershey and Rotman

En fago T2, se hizo la cruza ​h-r+​ x​ h+r- h
​ aciendo una ​doble infección​ de bacterias
E.Coli​ (B) con una mezcla de ambos virus (usaron una concentración de fago alta).
Ocurrieron recombinaciones entre las bacterias produciendo cromosomas h+r+ y
h-r-.
Después agarraron a los fagos hijos y los pusieron en placas con cepas de ​E.Coli​ B
y B2.
h- : puede infectar dos colonias diferentes de E.Coli (B y B2). Entonces la playa era
clara porque todas las células se lisan.
h+: puede infectar solo B. Las playas son turbias
r- : lisa rápidamente a las células produciendo playas grandes
r+: lisa lentamente a las células produciendo playas más pequeñas.

La frecuencia de recombinantes se puede calcular como

RF=​ playas recombinantes (h+r+) + (h-r-)

playas totales

Benzer mapeó una gran cantidad de mutaciones que ocurrieron dentro de la región
de fago T4. Los resultados de sus estudios de complementación demostraron que la
región rll consta de dos unidades funcionales que denominó cistrones. Él mostró
que tiene lugar la recombinación intragénica.
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Transducción generalizada

En el ciclo lítico, el cromosoma bacteriano se rompe en pedazos random. Algunos

tipos de bacteriofagos, empaquetan una pieza de cromosoma bacteriano en lugar
de DNA viral, estos se llaman ​fagos transductores ​(con sitios PAC poco
específicos, hay sitios parecidos en el genoma bacteriano). Infectan una célula
nueva, liberando el DNA bacteriano que puede ser incorporado al genoma por doble
recombinaciòn produciendo una bacteria​ transductante​. Necesita de la maquinaria
​ o va a ser
de recombinación de la célula huésped (por lo que una bacteria ​rec- n
capaz de incorporar fragmentos de DNA). (Ej: Fago P1)

Transducción especializada

En el ciclo lisogénico, el profago puede escindirse imperfectamente del cromosoma

bacteriano, llevando consigo una parte de este. Ocurre en fagos con sitios de
integración específicos. Es mediada por enzimas fago específicas que es
independiente del sistema de recombinasas del huésped. Por lo que una célula ​rec-
puede heredar marcadores por transducción especializada.(Ej: fago Lambda)

Mecanismo

Un entrecruzamiento en el sitio especializado de integración produce una bacteria

lisogénica.

La bacteria lisogénica puede producir un fago (i) Normal o (ii) Raro, λdgal una
partícula transductora que contiene el gen ​gal
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Transductantes ​gal+​ pueden formarse por (i) la coincorporación de λdgal y λ

(actuando como helper) o (ii) recombinaciones flanqueando el gen ​gal​ (mas raro)

Influenza
La influenza A, un virus con 8 moléculas de RNA cada una codifica para una o dos
π virales, está dividida en subtipos según las proteínas que se encuentran en la
superficie del virus. Las π HA y NA afectan la capacidad de infección y la respuesta
inmune del huésped. Hay 9 tipos de NA y 16 tipos de HA que se pueden dar
distintas combinaciones.
Uno de los peligros de la influenza es que evoluciona rápido y lo hace de dos
maneras:
● Antigenic drfit​: Hay un cambio continuo en las cepas por mutaciones en las
cadenas de RNA porque la enzima que lo copia comete errores
● Antigenic shift:​ Puede pasar que un huésped sea infectado con dos cepas
del virus y se combina el material genético produciendo una nueva cepa.

La mayoría de la influenza afecta a los pájaros y los humanos no se infectan tan

fácil de la influenza de pajaro. La forma más común en la que aparecen nuevas
cepas para humanos es por infección de virus que cambiaron en los cerdos, que
pueden infectarse tanto de pájaros como de humanos.

En 2009, apareció una nueva cepa de virus H1N1 en México que se expandió
rápidamente. Tenía secuencias de humano, ave y cerdo.
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Preguntas piolas

​
● ¿Que pasa si la célula aceptora es ​rec-?

Conjugación:
Con Hfr o F+ : No se va a incorporar al cromosoma bacteriano de la receptora y se
va a degradar (pero según Nadra no es necesario que recombine)
Con F’: Como el marcador está en el factor F’ puede replicarse independiente en la
célula y no necesita recombinar con el genoma, va a heredar el gen.

Transformación:
No se va a incorporar el DNA foráneo

Transducción:
Generalizada: No va a incorporarse porque necesita de la recombinasa del huésped
Especializada: Tiene su propia maquinaria de recombinación así que va a
incorporarse igual.

● Estado del factor F

Hfr: Factor F integrado en el cromosoma

F+: Factor F esta libre en el citoplasma
F-: No tiene factor F
● ¿Porque mapear una mutación usando Hfr o transducción generalizada por
P1 por separado es ineficiente?

Hfr me permite mapear genes que no estén muy alejados entre sí y no se puede
encontrar una mutación puntual. La transducción generalizada da información de
genes cercanos lo que hace que no sea eficaz como primer experimento porque
sería muy engorroso. Si juntas las dos, primero podes localizar la mutación con Hfr y
segundo, para determinar la mutación de forma más precisa conociendo la región
con transducción generalizada.

● Una cepa Hfr transmite el marker ​pro+​ último en la conjugación. En la cruza

con una F-, algunas recombinantes ​pro+​ se recuperan antes en el
apareamiento interrumpido. Cuando estas ​pro+​ se cruzan con F-, la mayoría
de las F- se convierten en ​pro+​ y también llevan el factor F

La mejor explicación es que el factor F del Hfr “looped out” incorrectamente del
cromosoma y ahora el F’ que contiene el gen ​pro+.​ Este F’ rapidamente se transfiere
al F-convirtiéndolas en ​pro+​ (y F+)

● Las cepas F ' en E. coli se derivan de las cepas Hfr. En algunos casos, estas
cepas F ' muestran una alta tasa de integración de nuevo en el cromosoma
bacteriano de una segunda cepa. Además, el sitio de integración suele ser el
sitio ocupado por el factor sexo en la cepa Hfr original (antes de la producción
de las cepas F '). Explica estos resultados
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La alta tasa de integración y la preferencia por el mismo sitio originalmente ocupado

por el factor F sugieren que el ​F ' contiene cierta homología con el sitio original​.
La fuente de homología podría ser un fragmento del factor F, o más probablemente,
es la homología con la copia cromosómica del gen bacteriano que también está
presente en la F '

Regulación de la expresión

Gen:​ Unidades hereditarias que se transmiten de una generación a otra en

forma uniforme y predecible, dando origen a una característica fenotípica
determinada. Transmiten ​información​ sobre estructuras y funciones

Los genes actúan controlando la química celular.

Descubrimiento
Beadle y Tatum
Hongo haploide ​Neurospora. I​ rradiaron células para producir mutantes e incubaron
las esporas en distintos medios. Encontraron numerosos mutantes auxotróficos que
tenían deficiencias nutricionales y se centraron en un mutante que necesitaba
arginina para crecer. Encontraron que eran mutaciones en tres loci diferentes en
tres cromosomas separados.
Cada mutante respondía distinto a los compuestos ornitina y citrulina.

Se propuso el siguiente camino bioquímico:

Este modelo se conoce como ​un gen una enzima (más tarde un gen una cadena
polipeptídica, Crick)​ porque la mutación en un gen interfiere con la producción de
una enzima. Este procedimiento no necesariamente tiene en cuenta todo los pasos
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del camino. Más tarde se complementó:

Hay varios tipos de RNAs y las simples cadenas pueden plegarse formando
estructuras más complejas.

Ribozimas
● Molécula de ARN que cataliza una reacción química. Muchas de las
ribozimas naturales catalizan su propio clivaje.

● Han sido definidas como falsas enzimas dado que las mismas no
permanecen inalteradas o recuperan su estructura molecular después de
la reacción (Hay un sólo ciclo de reacción).

● Las versiones sintéticas son más parecidas a las enzimas verdaderas y

en algunos casos, como la Ribonucleasa P, la actividad catalítica del
ARN puede observarse ​in vitro​, en ausencia de proteína, promoviendo
varios ciclos de reacción

● También el ADN puede tener este tipo de actividad y se las llama

deoxiribozimas

La parte funcional del ribosoma es fundamentalmente una ribozima.

RNase P
Ubicua: bacterias, eubacterias, mamíferos
Función: procesa 5 ́ del precursor del t-RNA
En Euca, transcripción polIII dependiente
Rnasa P bacteriana: puede catalizar varios ciclos de clivaje independiente de
la porción proteica
RNAsa P euca: también puede actuar libre de proteína, pero con una
eficiencia varios órdenes inferior a la bacteriana

Viroides: organismos “sin genes”

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La actividad enzimática del ARN permite hipotetizar la existencia de un​ mundo de

ARN​, donde la información y la función dependían de las mismas moléculas

Definición “complicada” de gen: ​Unidad de información (físicamente constituida

por un ácido nucleico) codificante para una “unidad” de función (polipéptido o RNA)
Con capacidad de variar (mutar, recombinar), tener una dinámica poblacional
(comportamiento frente a la selección). Con capacidad de almacenamiento y
reproducción fidedigna de la información, así como su decodificación.

Regulación: Control de la expresión génica

Niveles:
1. DNA
2. Transcripcional
3. Post-transcripcional
4. Traduccional
5. Post-traduccionales

1. Regulación a nivel de restructuración o acceso al DNA

Puede regularse
● El número de copias.
Amplificación génica: ​aumento en el número de copias de un fragmento de ​ADN​.
Ejemplos: E​ste fenómeno se produce de forma natural durante el ciclo vital de
algunos insectos y anfibios, pero en el caso de los mamíferos se asocia con tumores
● El acceso al DNA
La heterocromatina es menos laxa y se expresa menos. También las histonas
pueden sufrir modificaciones.
“mating type en levaduras” hay como dos tipos de sexos en levaduras y las tienen
los genes para ser cualquiera de los dos.
​2. Regulación Transcripcional
Puede regularse
● RNA pol
En bacterias, core + factor sigma forma la holoenzima. reconoce una secuencia
consenso.
En eucariotas, hay tres tipos de pol y una serie de factores necesarios para iniciar la
transcripción que suelen ser modulares.
La transcripción produce tensión en la doble hélice, en bacterias lo soluciona la ADN
girasa que introduce superenrollamiento negativo, en eucariotas la topoisomerasa
que facilita el desarmado de nucleosomas.

Enhancer: sitios de ADN donde se unen activadores, forman loops que acercan FT
al promotor
Silencers: sitios de ADN donde se unen represores.

Factores de transcripción: suelen reconocer el surco mayor. Estructura:

Hélice-vuelta-hélice, homeodominios, dedos de zinc, cierre de leucinas,
hélice-loop-hélice
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Técnicas para estudiar Factores de Transcripción

EMSA
Cromatografía de afinidad
DNA footprinting (sitios de hipersensibilidad a DNAsa)
Huella filogenética
Chip
Genes reporteros

● Los factores de transcripción.

Operones como lac (regulación positiva y negativa) y triptófano (negativa)

Controles combinatorios: ​establece de forma coordinada una única manera correcta

de unión de las proteínas a las secuencias.

3. Regulación post (co)-transcripcional

Se puede regular
● Modificación (CAP y poliA) de mRNA
La adición del ​CAP​ es cotranscripcional. El CAP se agrega en el ​extremo 5´​por
proteínas que interactúan con la cola de CTD de la RNA pol II. Consiste en un
7-metilguanosina residuo unido al transcrito por tres grupos fosfatos. Una primer
función es proteger el RNA de la degradación y es necesario para la translación.

El procesamiento del ​3​’ se da cuando una enzima reconoce el RNA en la secuencia

conservada AAUAAA o AUUAAA y se agrega una ​cola de polyA​ de masomenos
250 adeninas. Su función es otorgar estabilidad. Hay sitios de poliadenilaciòn
alternativos, por ejemplo en un intrón que no se remueve y contiene un stop.

● Escisión de intrones (splicing)

Los intrones se remueven del transcripto primario transcripcionalmente, después del
agregado del CAP pero antes del transporte al citoplasma.
Son dos reacciones de transesterificación.
Requerimientos en cis:
Nucleótidos conservados, GU en el 5’ y AG en el 3’ y una A de branching. La
existencia de estas bases sugiere que hay maquinaria celular que reconoce las
secuencias y hace el splicing.
Requerimientos en trans:
Los snRNA son complementarios a las secuencias consenso y junto con otras
proteínas forman el ​spliceosoma​, hay distintos tipos​.

Intrones autocatalíticos
Sin spliceosoma, forman una estructura secundaria y se autoclivan. Se descubrió en
Tetrahymena​.

● Procesamiento del RNA Ribosomal (rRNA)

Las células eucariotas poseen dos tipos de genes de rRNA: un gen grande y un
pequeño. Los tres rRNA bacterianos están codificados por un solo tipo de gen.
Tanto en proca como en eu estos genes sufren modificaciones.
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En E. coli​, las modificaciones son el citoplasma. Cada gen de ARN se transcribe en

un precursor de rRNA que se metila en varios lugares, y luego se escinde y se
recorta para producir rRNAs y junto uno o más tRNA. Una serie de enzimas
provocan la escisión, metilación y recorte.
En ​eucariotas​, las modificaciones ocurren en el nucleolo. Pequeños RNAs
nucleolares (snoRNAs) ayudan a cortar y modificar rRNA y ensamblar los rRNA
procesados ​en ribosomas maduros. snoRNA + proteínas forman
ribonucleoproteína (snoRNP)​. Los snoRNA tienen una amplia complementariedad
con las secuencias de rRNA en las que tiene lugar la modificación.

● Transporte al citoplasma
El splicing es necesario para la exportación del mRNA.​ ​El complejo EJC se pega a
la unión exón-exón y recluta proteínas necesarias para la exportación. REF es una
proteína del EJC que une otra proteína, TAP que permite el pasaje por el poro
nuclear. Para ser exportado, el último control es NMD.

NMD (Nonsense mediated decay)

Una mutación puntual sin sentido no afecta la transcripción, pero un codón stop
lleva a la traducción prematuramente y la proteína resultante está truncada y, a
menudo, no funciona. Una forma común en las que las mutaciones sin sentido
surgen en la célula eucariótica, es por que uno o más de los exones se omiten o se
empalman incorrectamente. Conduce a la eliminación o adición de nucleótidos en el
ARNm, que altera el marco de lectura y le introduce codones stop prematuros. La
descomposición mediada del ARNm (NMD), da como resultado la eliminación rápida
del ARNm nonsense. El mecanismo responsable de la descomposición mediada por
ARNm sin sentido es poco conocido. Pasa una vez que salió del núcleo. También
ocurre reconociendo el EJC.

● Edición del RNA

Lo importante es que también hay cambios en la secuencia del RNA. Un ejemplo sin
los tRNA donde la edición del RNA permite el wobblig de la tercer base.

● Vida media
Si se acorta la cola de polyA es una forma de llevar a degradaciòn al mensajero.

● miRNA
Transcritos a partir de genes propios. Son endógenos, se unen a mensajeros y los
silencian. Primero corta ​drosha​ en el núcleo, después ​dicer​ le saca el loop en el
citoplasma y se une al complejo ​RISC​ formado por ​argonauta​ y otras proteínas.

En el laboratorio puedo sintetizarlos para hacer KD.

Epigenética

Epigenetic modifications are heritable changes in gene expression not encoded by

the DNA sequence.
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Mecanismos moleculares que producen cambios epigenéticos

● Metilaciòn del DNA
Islas CpG
Regiones de contenido G+C mayor al del promedio del genoma que sufren
poca metilación. El ~ 60% de los promotores de mamíferos (RNA pol II) estan en
islas CpG

Hay dos tipos de metilaciòn del DNA, de novo y de mantenimiento.

La de mantenimiento es necesaria para preservar la metilación del ADN después de
cada ciclo de replicación. Por un momento esta hemimetilado, una de las hebras
​ stablece
metilada y la otra no, hasta que se metila completamente. La de ​de novo e
los patrones de metilación de ADN en el desarrollo temprano.
● Modificaciòn de la cromatina
Marcas de histonas: Pueden sufrir modifcaciones en la cola N-terminal
-Controlan la expresiòn genética por modificaciòn por estado de condensaciòn de la
cromatina
-Las metilaciones suelen ser señal para condensar la cromatina (inactivaciòn) y las
acetilaciones para activar la transcripciòn
-Activadores reclutan acetilasas HACs, los represores reclutan desacetilasas
HDACs
-La metilaciòn recluta a proteínas HP1, que recluta a más HP1 y la
heterocromatinizaciòn de la cromatina puede propagarse a lo largo del cromosoma:
efecto posicional de variegación (PEV)
Existe lo que se denominan ​barriers​ (barreras), que son elementos de DNA que
impiden que la heterocromatina invada una región de eucromatina
-La metilaciòn del DNA está conectado con las modificaciones de histonas

Los genes del grupo Polycomb estan asociados al silenciamiento epigenetico por
modificacòn de histonas, en su mayoría metilaciòn. Es epigenético porque el
silenciamiento sigue a pesar de que no esté la señal que lo originó.
● RNA de interferencia (siRNA)
Si el siRNA es reconocido por RISC, se silencia el mRNA. Si es reconocido por
RITS, se produce un silenciamiento epigenético: metilaciòn de histonas y DNA y
represión transcripcional

Fenómenos de compensaciòn de dosis

Hace que, a pesar de la diferencia en número de cromosomas X, las células
femeninas y masculinas tengan cantidades equivalentes de las proteínas
codificadas por genes del cromosoma X
La compensación de dosis puede conseguirse doblando la expresión del
cromosoma X del macho (hipertranscripción, moscas), mediante la inactivación del
X, (mamíferos), o disminuyendo a la mitad la expresión de los dos cromosomas X
en la hembra (hipotranscripción, gusanos).

Locus XIC (Centro de inactivaciòn de X) necesario para el silenciamiento del

cromosoma que comienza por el gen XIST que da un RNA no codificante. La
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inactivaciòn es en cis, XIST es expresado por el X que será silenciado. XIST recluta
al complejo policomb, pero su presencia no es necesaria para mantener el
silenciamiento.
Los cromosomas se ubican en territorios. El Xa y Xi se ubican en distintos territorios

● Imprinting
Si el que deriva de la mama está inactivo es imprinting materno.
En la formaciòn de células germinales se borra el imprinting. Durante el desarrollo
de las gametas, los grupos metilos se agregan al DNA en las regiones regulatorias
de los genes imprinteados de un solo sexo, impidiendo que se unan FT. El
imprinting entre la descendencia puede ser distinto.

Ingeniería genética

4 clases de recombinaciòn:
● Recombinación homóloga: intercambio de material genético entre dos
moléculas de DNA que comparten identidad entre si
● Sitio específica: intercambio en sitios muy específicos
● Transposición
● Recombinaciòn ilegítima: No entra en ninguna categoría

Plásmidos
Una forma de separarlos del genómico es con un gradiente de ClCs que separa por
densidad.

Arriba: DNA genómico roto, se intercala más BrEt y es menos denso

Abajo: DNA plasmídico

Fondo: Todo el RNA

Cuando meto un plásmido en una célula pueden pasar cuatro cosas

a) Sin plásmido: Para descartarlas seleccionó con antibiótico
b) Varios plásmidos es una misma célula: No suele pasar porque hay
incompatibilidad.
c) Muchos recombinantes distintos: cortas el DNA con una ER y se puede meter
cualquier fragmento
d) Plásmidos vacíos: Para evitar que se religue ahora se usa fosfatasa. Antes,
se usaba un vector donde el lugar de inserción estaba en el medio de un gen
de resistencia. El clon que era resistente no había incorporado vector así que
me quedo con los que se mueren, lo haces por replica plating. Ahora se usa
el gen LacZ (me quedo con las azules)
 18

Genotecas
● Partir de DNA genómico (contiene promotores e intrones)
● La frecuencia de los clones positivos es independiente de la expresiòn
porque todos están en la misma proporción
● Es difícil que se exprese
Clonotecas
● Partir de RNA
● Dependiente de la expresiòn
● Se puede expresar si se coloca promotor adecuado

Calculo para saber cuantas colonias tenemos que picar

N = ln (1-p)/ln(1-a/b) Donde a: inserto promedio b: tamaño del genoma

VECTORES
Vectores para genotecas
● YAC:
a: hasta 1700 pb largo de un cromosoma de levaduras
Sistema: ​Levaduras
Elementos:
centrómero y telomeros, al lado de los telómeros tiene sitios para BamH1, entonces
cortas y se hace lineal, despues cortas con EcoRI que está cerca del centrómero y
también digeris los fragmentos con EcoRI y ligas. Para meterlo en levaduras tengo
que degradar primero la pared.
Problema:​ ​recombinación homóloga

● BAC:
a: 300 kb (en general metes 100)
Sistema: ​Bacterias
Ventaja:​ Para clonar ​cosas muy grandes
Uso:​ ​Proyecto genoma
Elementos:
Ori del plásmido F
gen de selección negativa: si no se inserta el fragmento, se muere porque es un gen
suicida. También puede tener el LacZ
gen de selección positiva: antibiotico
Problema:​ Para meter en E.Coli hay que usar electroporaciòn porque es muy difícil.

● Bacteriofago P1
a: 100 kb
Sistema:​ Lo empaquetas en fago y después infectan bacterias
Ventaja:​ Empaquetamiento eficiente porque el fago siempre mete el DNA
Uso:​ ​Libraries​, porque empaqueta al azar. Traducciòn generalizada.
Elementos:
Pac: de reconocimiento y clivaje
Replicon y ciclo lítico inducible
sitio loxP para cre
 19

● Fago lambda: Reemplazo

a: 20-30 Kb
Sistema: ​Bacterias
Ventaja: ​Empaquetamiento eficiente, todas los fagos que se formen tienen
fragmento porque si el inserto es muy chico no o empaqueta.
Uso: ​Para estudiar ​genes individuales
Elementos:
Tiene la parte del ciclo lítico pero le sacas la parte del ciclo lisogénico para tener
más lugar. Hay que agregarle a tu secuencia los brazos del fago.

● Cósmido
a: 35-45 kb
Sistema: ​Lo empaquetas en el fago y queda como DNA en​ ​bacterias, no es
infectivo
Ventaja: ​Empaquetamiento más efectivo, porque tiene sitios cos
Uso: ​Para subclonar insertos de YAC,BAC
Elementos: ​Sitios cos
Problema:​ No lo usas para cDNA porque no empaqueta fragmentos que son más
cortos.

Vectores para clonotecas

● Fago lambda
a: 10-15 kb
Sistema: ​Bacterias
Ventaja: ​Empaquetamiento eficiente, la capacidad no limita al ARNm (8 kb), más
representativo que la clonoteca de plásmidos
Uso: ​Genes individuales
Elementos: ​Sitios cos, NO haces el reemplazo del ciclo lisogénico
Problema:​ Subclonado y pasos siguientes más difíciles que en plásmidos

● Plásmidos
a: 10-15 kb
Sistema: ​Bacterias
Ventaja: ​Subclonado y pasos siguientes faciles
Uso: ​Libraries
Problema:​ Fácil de transformar en bacterias pero no tan eficiente, menos
representativo que clonotecas de fagos

Vectores para expresión

● Fago lambda
Le pones brazos del fago a tu plásmido que tiene un promotor bacteriano,
haces DNA genómico, seleccionas los que incorporen el inserto en el
plásmido

INSERTOS
-Amplificas por PCR o combinas purificando el mARN con columna de oligoT, usas
 20

oligoT de primer y haces cDNA. Le pones adaptadores ER

-Si queres direccionar, usas dos ER

PRIMERS
Específicos si los conoces o si no, degenerados si conoces algo homólogo que te
agregan como cambios en la tercer base del codón o random si no sabes nada.

Screening
● Por abundancia relativa
● Por el producto de expresión: clonotecas de expresión que también se puede
detectar con anticuerpo
● Por PCR o sonda si conoces algo de la secuencia
● Por ensayos funcionales:

❖ Complementación funcional en levaduras: Medio selectivo

❖ Hibridación diferencial: Tenes el mRNA de dos sexos, solo uno expresa
globulina, pasas el de ese sexo a cDNA e híbridas: cDNA con el mRNA del
que no lo expresa
El cDNA de globulina no se va a hibridar, pasas por una columna que sólo
retenga lo doble cadena y se pasa el que no híbrido. Lo tiras en una
clonoteca del tejido de donde sacaste el mRNA del sexo que te interesa e
híbrida.

Segunda clase
Mutagenesis in vitro
Mutagénesis dirigida permite generar mutaciones en cualquier posición de un gen
de secuencia conocida. Se sintetizan oligonucleótidos que pueden unirse al gen
blanco.
Pueden generarse sustituciòn de bases, deleciones o inserciones.
● Por plásmido:
En una de las estrategias, el gen de interés se inserta en un vector de ADN de
cadena sencilla, como el fago M13. Se diseña un oligonucleótido portador de la
mutación deseada y se permite que hibride actuando como primer para la síntesis in
vitro de la cadena complementaria insertada en el vector en condiciones de baja
rigurosidad (baja temperatura y concentraciones elevadas de sal). Después lo
clonas en bacterias.
● Por PCR:
La PCR puede utilizarse también para generar mutaciones. En una primera ronda
de PCR, se utiliza un cebador portador de la mutación deseada. El producto de esta
reacción se emplea como cebador en una segunda ronda de PCR, cuyo producto es
el alelo mutante.

Transfección de DNA
Tipos:
 21

● Transitoria: Buscan que el ADN entre a la célula, se exprese, pero que no

quede permanente (experimentos cortos). En general se usan genes
reporteros y no requieren selección
● Estable: Requiere que el ADN se integre al genoma (para que se herede a la
progenie). La probabilidad de que una secuencia se inserte en el genoma es
baja, por lo que hay que seleccionar aquellas que lo insertaron

En general, los transgenes se insertan al azar y en gran número de copias en

tándem.

Métodos:
● Químicos: Los más utilizados. Se basan en moléculas-carrier cargadas
positivamente. Los complejos carrier-ADN se asocian a membranas y facilitan
la incorporación del ADN.
Fosfato de calcio: Se mezcla la solución con el ADN, se forma un complejo
que es internalizado por la célula, y el ADN termina por incorporarse al
núcleo. Es posible seleccionar las transfecciones estables si se aplica un
antibiótico.
Liposomas: Forman micelas que tienen atrapado al ADN y al ser
internalizadas,
liberan al ADN dentro del contenido celular
● Mecánicos: Electroporaciòn (para muchos cultivos), biobalística (para
animales transgénicos) y microinyecciòn (en transgénicos, metes DNA con
una aguja fina)
● Biológicos: Emplean virus eucariotas recombinantes para incorporar el ADN a
las células. Se saca el gen de la cápside, para que el virus no se ensamble, y
no lise la célula.

Generación de animales transgénicos

El transgén se expresará con un patrón espacial y temporal que dependerá de los
elementos en cis que contiene.
Es deseable incorporar una estrategia para diferenciar el gen endógeno del
agregado. En general, la integración es al azar, y difícil de controlar. Tampoco
puede controlarse el número de copias. Existe lo que se llama efecto de posición: si
el ADN se integra en una zona muy heterocromatina, el gen no se expresa; por eso,
se utilizan varios organismos transgénicos, que permiten asegurarse que lo que se
observa no es solo un producto del lugar de inserción del gen.

Transgénesis de la línea germinal

-Microinyección directa en pronúcleos de óvulos
-Infección in Vitro de embriones con retrovirus
-Por manipulación in Vitro de células troncales pluripotentes
-Transferencia nuclear: el núcleo de un individuo (célula somática) se inyecta en el
ovocito de otro individuo (al cual previamente se le extrajo su propio núcleo
fertilizado); este se implanta en el útero de una hembra. Podría incorporarse un
paso en el que se incorpore en el núcleo un transgen, y así producir un organismo
transgénico.
 22

Mutaciones específicas para analizar funcion

-KO
-KD Pérdida de función (puede ser parcial)
-KI ganancia de función
-humanizar (reemplazar genes de ratón con genes humanos, por ejemplo, los
codificantes para anticuerpos)

Uso de ES para la ingeniería del genoma mamífero. Se les puede introducir DNA y
volverse a meter en el blastocisto y la siguiente generación llevará el gen en
heterocigosis. Como introducir el gen en la región homóloga es algo raro, tiene que
tener selección positiva y negativa.

Selección positiva: se inserta un gen de resistencia (neoR) dentro de un exón del

gen de interés. Las que incorporaron el transgén serán resistentes a neo
Selección negativa: gen de la timidina quinasa; las células que expresan la TK del
HSV mueren en presencia de ganciclovir
De las que han incorporado inserto, algunas lo habrán hecho por recombinación
homóloga, y otras al azar en un sitio ectópico; las que incorporaron el transgen en
un sitio ectópico, mueren por la expresión de timidin kinasa en presencia den
ganciclovir, pero las que lo incorporaron por recombinación homóloga, no poseerán
el gen de ésta, y sobrevivirán.

Para generar genes knock out en un tejido específico y en un momento determinado

usamos el sistema Cre que es una recombinasa inducible de fago y reconoce
secuencias loxp. De la secuencia loxp, el centro es asimétrico flanqueadas por
repeticiones invertidas y estas son las que reconoce Cre.
 23

Si un fragmento de DNA está entre dos regiones loxP que están en sentido opuesto,
Cre corta en ambas, la región se invierte; si las regiones loxP están en el mismo
sentido, y Cre corta en ambas, la región se deleciona.
Entonces, si se quiere observar el knock out en hígado, puede expresarse Cre solo
en hígado, utilizando un promotor que solo se exprese allí.

Esto podría ser letal y no observarse fenotipo, lo que se hace es colocar el gen Cre
bajo un promotor que pueda inducirse voluntariamente en el momento deseado.

Sistema Tet-off/on
Se utiliza el represor del operón de resistencia a la tetraciclina del Tn10. El promotor
regulador (TRE) contiene sitios de unión del represor de la tetraciclina (TetR). TetR
se encuentra unido al VP16. TetR+VP16 se une a tetraciclina y deja de estar unida
al DNA.
En ​Tet-Off​, el TetR se encuentra unido al promotor de la tetraciclina (TRE),
activando la expresión de Cre, pero al unirse a tetraciclina/doxiciclina, se “despega”
del promotor, lo que hace que el gen deje de expresarse; la presencia de tetraciclina
“apaga” (off) la expresión del gen.
Entonces, si ponemos a CRE bajo el control de TRE, se debe dar tetraciclina a los
ratones, mientras no se quiera noquear el gen.

En ​Tet-On​, un cambio en 4 aminoácidos en el represor TetR, hace que éste active el

gen sólo al unirse a doxiciclina/tetraciclina; la presencia de tetraciclina “enciende”
(on) la expresión del gen.
En este caso, solo se le da tetraciclina al ratón cuando se quiere noquear el gen de
interés​.

Entonces necesitamos:
El represor bajo un promotor tejido específico
 24

CRE bajo un sistema TetO

gen floxed

Recombinación homóloga para reparar no es lo más común, pero las roturas

fomentan la recombinación homóloga. SI rompemos dna en un sitio específico
podemos generar recombinación

En bacteria, cuando es infectada por un fago, incorpora en su genoma DNA foráneo

y lo usa como molde para hacer un transcrito que reconocerá el DNA foráneo y lo
cliva, eso se llama ​CRISPR​.

Cas 9 es uno de los sistemas de este tipo, y tiene una sola proteína por lo que es
más fácil de manipular. Es una proteína que une un RNA guia que usa para cortar el
DNA foráneo.

RNA GUIA lo vamos a tener en un vector.

Una de las formas que tiene la célula para arreglar el daño a la doble cadena :
El sistema puede unir dos fragmentos que están cortados, es una forma rápida de
arreglarlo y puede inducir mutaciones y deleciones, cambios en el marco de lectura.
Sirve para hacer KO.

Otra de las formas:

Recombinaciòn homologa. Para que esto pase metes dentro del vector, a los
costados del transgen secuencias de homología al genoma. Mantener exacto la
secuencia del genoma, podrían fusionar dos proteínas y que queden en marco de
lectura. Sirve para hacer KI.

Aplicaciones de la Ingeniería Genética a la producción de vacunas

Dos tipos principales de vacunas
● Atenuadas: patógeno vivo pero con poca virulencia, activan la respuesta
celular y es más eficiente
● Inactivadas: patógeno inactivo, activan la respuesta inmune.
Las vacunas tienen algunos problemas: • Producción • Nivel de bioseguridad
elevado • Correcta presentación del antígeno • Riesgo de atenuación/inactivación
parcial o incompleta • Reversión de la virulencia/patogenicidad • Conservación,
transporte, validez
 25

Vacunas de DNA
Podríamos introducir DNA por electroporación, que codifique para proteínas virales
y active la respuesta inmune
Son re pro pero algunos contras es que está limitada a antígenos proteicos (no a los
polisacáridos de las membranas bacterianas), y que requiere de dosis altas por lo
que puede generar tolerancia al antígeno

Vacunas de Subunidades
Proteínas recombinante sacadas del patógeno inyectadas en el huésped para que
se active la respuesta inmune a proteínas. Contras: proteolisis, proteínas chicas
baja capacidad inmunogénica y se pueden filtrar, y además necesitan dosis
múltiples y adyudantes: para que mejoren la respuesta inmune, es jodido.

Producción recombinante de proteínas de la cápside viral

Hay proteínas que tienen la capacidad de ensamblarse, y a esa subunidad le
agregas (o acoplas químicamente) un antígeno contra el que queres que se
produzca el anticuerpo.

Una alternativa también de producción veloz es producir

⬇
Vacunas recombinantes
 26

Virus del que conoces su genoma y le agregas un gen que codifica un antígeno de
otro virus y cuando lo usas como vacuna se va a producir una respuesta inmune
contra ambos virus.

Tercera clase
Agrobacterium tumefaciens​ ​es una bacteria que infecta plantas, además de su ADN
genómico, posee un plásmido, TI, que codifica para lo necesario para transferir un
fragmento de ADN, tDNA, de la bacteria a la planta.
El plásmido tiene otros gene​s Vir que no se transfieren pero son necesarios para
que el tADN se transfiera. Los genes Vir pueden también estar codificados en el
ADN genómico de la bacteria. Al fragmento de tADN lo rodean dos regiones
llamadas borde izquierdo y derecho (BI y BD respectivamente). El plásmido también
tiene un oriT.

Cuando hay una herida, la planta libera compuestos fenólicos, que son reconocidos
por la bacteria, y promueven la expresión de los genes Vir y la transferencia del
tADN. La transferencia de ADN es análoga a la conjugación. El ADN es transferido a
la planta por un sistema de secreción que inhibe la respuesta a patógenos por parte
del huésped. La integración del tADN es al azar. Este plásmido es un bastante
grande (250 kb), por lo que es difícil trabajar con él

(1) se crea un plásmido TI desarmado (sin la porción interna del tADN pero sí con
los bordes BI y BD), se utiliza un plásmido más pequeño que replique ​E. coli​ en el
que se agrega el segmento de ADN de interés (con promotores y terminadores
eucarióticos), y transforman bacterias ​A. tumefaciens​ que contienen el plásmido TI
desarmado con el plásmido pequeño conteniendo el gen de interés. El plásmido TI
posee algunas bases que son homólogas a las del plásmido de ​E. coli​ (dentro de los
bordes I y D), por lo que se espera que el plásmido pequeño recombine con el TI en
esas zonas, e integre el segmento de ADN de interés. Las bacterias que han
recombinado pueden ser seleccionadas porque el plásmido de ​E. coli​ posee un gen
que codifica la resistencia a un antibiótico (que ​A. tumefaciens​ no posee), pero solo
se expresará si se ha integrado al plásmido TI (porque tiene un ori de E.Coli pero
que no funciona en ​A. tumefaciens​);

EL SISTEMA QUE SE USA ES ESTE: ​SISTEMA BINARIO

 27

(2) se crea un plásmido desarmado, que no posee los bordes I y D, pero si los
genes Vir. Se utiliza además un vector binario que sí puede replicar en ​A.
tumefaciens​ (también en E. coli). Este plásmido binario posee la región del tADN
con los bordes izquierdo y derecho, el gen de interés, un promotor eucariótico, y un
gen de selección (por ejemplo, de resistencia a un antibiótico). Los genes Vir del
plásmido TI desarmado actúan en trans, permitiendo la transfección de las células
de la planta por el plásmidos binario.

Las proteínas que “arrastran” al segmento de tDNA son VirD1/VirD2 y son las que
ayudan a que se integre al DNA genómico.
En un vector binario: Un gen de resistencia se tiene que re expresar en la planta en
la región de tDNA y el otro para el de la bacteria en cualquier lugar.

En arabidopsis alcanza con sumergir la planta en la solucIón de agrobacterium

Suelen ser bajo número de copias. Es mejor que el cañón génico

Ahora para largar la planta, no te combiene tener la resistencia, para solucionarlo:

-Sistema Cre/lox
-Uso de transposones
-Replicones distintos
-Dos T-DNAs en el mismo replicón
-Dos cepas distintas, pones dos tDNA uno con resistencia y el otro con el tDNA de
interés y despues los eliminas pro cruzas

Sistemas inducibles
Hay varios. El que es inducible por alcohol tiene dos elementos:
● ft es un hongo y tiene dominio de unión para el alcohol y lo tienes bajo un
promotor mínimo.
 28

● El gen está bajo un promotor quimera que es minimo + donde se van a poner
los FT
Cuando pones alcohol el FT se activa y va a unirse al promotor

Hay dos formas de meter DNA en la célula vegetal:

● El DNA se puede insertar en el núcleo usando bombardeo de partículas
(1) son considerados sistemas universales porque, al no depender de organismos
vectores, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal (no dependen de la
interacción planta-bacteria); (2) no requieren eliminar las células del organismo
vector de los tejidos o plantas transgénicas (​Agrobacterium​ debe sacarse de las
células transfectadas); (3) requieren construcciones más simples y pequeñas que ​A.
tumefaciens​; (4) son apropiados para estudios de expresión transitoria. Las
desventajas son: (1) pueden resultar en un alto número de copias y/o copias truncas
del transgén y del vector en varios sitios del genoma de las células transformadas
(puede haber silenciamiento por parte de la planta por el alto número de copias); (2)
se caracterizan por la alta frecuencia de aparición de re-arreglos en los transgenes

● Pero también se puede insertar en los cloroplastos

En cloroplastos sí es frecuente la recombinación homóloga, por lo que es más
factible insertar un fragmento de ADN en lugar específico del genoma. Sin embargo,
el sistema de expresión debe funcionar en cloroplastos. Como son muchos
cloroplastos por célula, si se obtienen plantas transplastómicas, pueden obtenerse
muchas copias de un transgen, y quizás un alto nivel de expresión de una proteína.
Al principio son células heteroplasmaticas (con algunos cloroplastos con el inserto y
otros no); como l​o que se quiere es que el transgen este en todos los
cloroplastos​, se requieren sucesivas selecciones para llegar a individuos
homoplasmaticos. Si se logran obtener callos, que poseen pocos cloroplastos, es
más fácil seleccionar los cloroplastos transgénicos.
Pueden obtenerse ​plantas libres de marcadores​ con el sistema Cre-loxP: si se
integra en el cloroplasto un transgen con los sitios loxP, y se expresa en trans a la
recombinasa Cre, se puede lograr la recombinación para eliminar el transgen de
resistencia.

Para purificarlos
Aislamiento y purificación de protoplastos. Se incuban fragmentos de hojas de una
planta con enzimas que digieren la pared celular (se liberan los protoplastos), se
filtran
y los protoplastos se pueden transfectar por métodos químicos, como por ejemplo el
polietilenglicol (un polímero) o por métodos físicos, como la electroporación. Una
vez
que se obtienen los protoplastos con el transgen, se debe regenerar la pared de los
protoplastos y regenerar plantas en medio selectivo (primero generar callos, luego
vástagos y al final raíces para formar la planta adulta).

Plantas transgénicas
Existen tres tipos principales de plantas transgénicas:
 29

- ​De primera generación​. Se le da a la planta una característica que disminuye el

riesgo
de cosecha del productor (resistencia a herbicidas, insectos, patógenos, a estreses
abióticos, aumento de la eficiencia fotosintética, de fijación del nitrógeno, etc.).
- ​De segunda generación​. Se tratan de alterar caracteres de las plantas de calidad
y
nutraceuticos, por ejemplo, mejorando la calidad nutritiva.
- ​De tercera generación​. Se alteran caracteres relacionados con la bioremediacion
y el
cuidado del medio ambiente. Por ejemplo, para descontaminación de suelos,
absorción y metabolización de productos tóxicos, etc.

Plantas transgénicas de primera generación.

- De resistencia al glifosato. El glifosato inhibe la síntesis de aminoácidos aromáticos

(inhibe a la enzima EPSPS), paso esencial en la formación de los aminoácidos
aromáticos triptófano, fenilalanina y tirosina). Actúa a nivel del cloroplasto. Se
encontró una bacteria que produce una enzima EPSPS que es resistente a la acción
del glifosato, cuyo gen se transfectó en plantas. El transgen de resistencia al
glifosato utilizado posee un promotor constitutivo, un gen de selección, el gen de la
enzima resistente, un terminador y una señal de localización del cloroplasto (donde
actúa el glifosato). Las ventajas de este método son: permite matar a las plantas
competidoras, sin tener que erosionar el suelo (por lo que va incorporando materia
orgánica), se utiliza la siembra directa.
- Genes BT. BT (B. thuringiensis) es una bacteria que mata y se alimenta de
insectos (produce cristales que cuando el insecto ingiere, produce una proteína
activa que lo mata). Se han obtenido plantas transgénicas que producen estos
cristales. Sin embargo, estos cristales pueden matar también insectos no
patógenos, como mariposas. Existe una diversidad grande de estas proteínas.
- Con genes de resistencia a virus. Una de las estrategias es que la planta produzca
una proteína de la cápside viral que hace que no se ensamble bien. Cuando la
planta es atacada por un virus, estos en algún momento producen, como parte de
su mecanismo de replicación, ARN de doble cadena. Para defenderse, la planta
suprime al virus por un mecanismo de ARN de interferencia. A esto, el virus
contraataca generando proteínas supresoras del silenciamiento. Cuando el virus
suprime el
silenciamiento, también reprime a mecanismos de regulación endógenos. Entonces,
por toda esta respuesta y contrarespuesta, la planta sufre un gran estrés.

Plantas intragénicas y cisgenicas.

● Una planta intragénica tiene introducidos genes vegetales recombinados de
una manera especial. Todas las secuencias introducidas pertenecen a la
misma especie pero “recombinadas” (promotor de un gen y secuencia
codificante de otro, cambiando el nivel y especificidad de expresión).
● En las plantas cisgenicas, se toma el gen de resistencia de una cepa
resistente a un determinado patógeno y se integra en el genoma de otra cepa
susceptible.
 30

Genómica Estructural

El mapeo genético determina una distancia estadística entre dos genes, y se lleva a
cabo
mediante el estudio de frecuencias de recombinación génica. El mapeo físico es la
representación ordenada de los genes en un cromosoma basado en unidades
físicas
(pares de bases de DNA) más que en recombinación.

Para el mapeo físico

-FISH
-Mapeo de restricción: En un gel, se corren cada uno de los BACs que se tienen. Si
comparten sitios de restricción, significa que son contiguos. Esto lo realiza un
programa.
-STS:(Sequence Tagged Site). Es la técnica más utilizada. Utiliza una secuencia de
ADN
que sea de copia única (que no haya más de una copia en el genoma). Permite
localizar clones en el genoma. Para saber si una secuencia determinada es de copia
única se realiza un Southern en el que se hibrida con una sonda con la secuencia
de interés; si siempre aparece una sola banda, puede suponerse que esta una sola
vez en el genoma. Luego, partiendo de una library de BACs, se toman
membranas que son improntas de las placas, se hibridiza con la secuencia de
interés, y, una vez que se encuentra donde hibridiza la sonda, se determina en que
pocillo se encuentra el clon de BAC que contiene el segmento de interés. ​Si la
secuencia de copia única hibrida con dos BACs, de dos pocillos distintos, es
una prueba de que ambos BACs “solapan​”, es decir, tienen un fragmento en
común, y por lo tanto, son ​contiguos​. Entonces, esta técnica es útil para ordenar
BACs. Un marcador molecular de copia única también sirve para STS. Todos los
marcadores moleculares que a su vez sirven como sonda para STS, sirven para
alinear mapas genéticos de mapas físicos. Los BACs utilizan plásmidos que
integran grandes segmentos de ADN, por lo que ​lo primero que puede
secuenciarse son los extremos​ (porque lo que se utiliza de primer para hacer un
Sanger ​son las zonas conocidas del plásmido​). Entonces, los extremos
secuenciados pueden utilizarse para encontrar otros BACs contiguos al encontrado
anteriormente. Una library de BACs puede estar formada por 50000 clones en 50
membranas. Hibridizar cada sonda con las 50 membranas puede ser mucho trabajo.
Entonces, lo que suele hacerse para simplificarlo es mezclar todos los BACs
de una determinada fila (de una determinada placa) en un mismo pocillo (que ahora
contiene, por ejemplo, los BACs de las 12 columnas de esa fila) y, por otro
lado,mezclar todos los BACs de una determinada columna en un mismo pocillo.
Hibridizando la sonda de interés con estos nuevos pocillos “resumidos”, se obtiene
en qué fila y que columna de que placa se encuentra el fragmento de interés. La
otra forma de mapear con STS es utilizando células híbridas humano-hámster/ratón.
Implica que se fusionen células tratadas con rayos X (producen rotura de ADN) de
humanos y hamsters, lo que termina dando células híbridas que poseen algún
pequeño fragmento humano. Se puede preparar ADN de cada una de las células
 31

híbridas, e hibridarlas con STS. Si dos STS están juntos en el genoma, es más alta
la probabilidad de que hibridicen con las del mismo panel. Esto da una idea de la
cercanía de STSs y permite ordenarlos (y así ordenar también los BACs).
MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN DEL GENOMA
- Whole-genome shotgun method. Se clona todo el genoma, se secuencian todos
los fragmentos que se obtienen, y luego por computación se ordenan. Este método
conviene si la secuenciación es barata y si el genoma es pequeño.
- Clone contig method. Se clona el genoma, se ordenan los BACs obtenidos, y luego
se secuencian. Este método conviene si la secuenciación es cara y si el genoma en
estudio es grande.
En la secuenciación, hay un concepto que se llama “Coverage” (cobertura), que es
el promedio de veces que se leyó cada base. Un genoma secuenciado 8X significa
que en promedio, cada base fue leída 8 veces. Un número confiable es 10X. Un
mayor número de fragmentos secuenciados permite disminuir la probabilidad de que
queden “gaps” (fragmentos de genoma que quedan sin secuenciar). También
reduce el problema de los gaps la utilización del método Clone Contig Method,
porque si se encuentra que un fragmento no fue secuenciado por azar, se vuelve a
secuenciar sólo el BAC que contiene ese fragmento (en el otro método, no se tiene
un orden de los fragmentos, lo cual no permite re-secuenciar las zonas específicas
que presentan gaps). En el caso de hacer secuenciación por Clone contig method,
puede suceder que algunos fragmento del ADN no estén representados en ningún
BAC (por el motivo que fuera); estos espacios pueden llenarse haciendo PCR,
utilizando el genoma completo del individuo a analizar, y, como primers, los
extremos de los BACs que encierran a la zona sin secuenciar. Si el gap es muy
grande, puede realizarse una nueva library y utilizar como sondas los fragmentos de
que rodean a la zona sin secuenciar; aquellos BACs que hibridicen con ambas
sondas, contendrán también al gap. Si la computadora que procesa la
secuenciación reconoce que una determinada base fue leída una excesiva cantidad
de veces en comparación con el promedio, puede considerarla como ADN repetitivo.
Esto puede llevar a errores, que pueden subsanarse o evitarse comparando el mapa
físico obtenido con el mapa genético conocido. El mapa genético también sirve para
ordenar contigs que se encuentran separados por un gap.

MAPEO Y CLONADO POSICIONAL

Sirve para detectar una mutación en un gen específico. Se parte de un individuo
enfermo, con una determinada enfermedad recesiva (determinada por un gen
específico). Si se cruza con un homocigota dominante, la F1 estará compuesta por
individuos heterocigotos para el gen determinante de la enfermedad, pero sanos. En
la F2 proveniente de cruzar la F1, aparecerán nuevos homocigotas recesivos para el
gen (25% de la progenie). Si se seleccionan estos individuos, no solo se estará
seleccionando el gen de interés, sino que también se estarán seleccionando
aquellos marcadores que se encuentren muy cerca de éste (y por ende sufran poca
recombinación). Si se estudian los cromosomas de estos individuos, puede verse
qué marcadores se encuentran en
heterocigosis. En el cuadro siguiente se muestra un ejemplo. N significa Norte; A, B
y C son tres marcadores, y S significa Sur. Norte y Sur se definen en referencia a
los 3 marcadores (el orden en el cromosoma sería N, A, B, C, S). La presencia de N
en heterocigosis en el individuo 2 descarta que el gen de interés se encuentre al
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norte de N (porque el individuo enfermo debe estar en homocigosis +/+). La

presencia de heterocigosis en N y A, descarta que el gen de interés se encuentre al
norte de A. La presencia de heterocigosis en N, A y B, descarta que el gen de
interés se encuentre al
norte de A. Por otro lado, la heterocigosis en C y S, descarta que el gen de interés
se encuentre al sur de C. Esto indica que el gen de interés se encuentra entre B y C.

Determinar la ubicación entre B y C

limita
la ubicación posible del gen de interés,
pero
sigue siendo poco específica. Una
opción
para mejorar la definición de esto es,
usando el mapa físico (si se tiene),
determinar en qué BAC se encuentra
el gen
(usando como guía los marcadores
encontrados). Si no se tiene el mapa
físico,
puede usarse una library e hibridar
con los
marcadores B y C. De los clones obtenidos
que hibridizan, se seleccionan los mínimos
necesarios para cubrir toda la región
contenida entre los marcadores. Luego, se
secuencia la región y se identifica una
posible mutación.
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MAPEO POR ASOCIACIÓN

Si en un individuo se genera una mutación espontánea, y esa mutación causa una
enfermedad, durante las sucesivas generaciones se generan eventos de
recombinación en los alrededores de la mutación. Pero algunos marcadores, por su
cercanía, suelen heredarse juntos. Durante la evolución, aquellas mutaciones que
producen una enfermedad siempre están asociadas a algún otro polimorfismo muy
cercano (tan cercano que es difícil detectarlo con marcadores moleculares). La
única manera de determinarlo sería tener una batería tan grande de marcadores,
que exista alguno lo
suficientemente cercano. Ahora que se pueden secuenciar genomas, se cuenta con
muchísimos marcadores moleculares, y puede tomarse de una población, por
ejemplo, 100 individuos sanos y 100 individuos enfermos. Así, puede detectarse que
polimorfismo está presente en los individuos enfermos y no en los sanos.
Probablemente, ese polimorfismo sea la causa misma de la enfermedad, o esté
ubicado sumamente cerca de esta.

Desarrollo
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Las diferencias morfológicas entre especies no dependen tanto de la presencia de

genes diferentes, sino que
está determinada en gran parte por la regulación diferencial de genes comunes.
La ​determinación​ el proceso por el cual una célula se decide; por un destino
celular. Experimento para verlo:

Si se ve rojo es que ya estaba determinado el destino celular.

Morfógenos.​ Son moléculas inductoras que inducen varios destinos celulares de

acuerdo a un
gradiente de concentración.

Se realizó mutagénesis en Drosophila y se observó la anatomía durante el

desarrollo.

Se encontró un ​sistema de polarización del huevo​ (controlado por genes), en el

que cuando
alguno de los genes de este sistema se encuentra mutado, grandes porciones
desaparecen
(segmentos de la cabeza, el tórax o el abdomen). También se descubrió que
durante la
formación del ovocito, las células del folículo (maternas) son las fuentes de señales
que regulan de manera polarizada a los genes relacionados con la segmentación
del huevo. Se estableció que hay un sistema posterior, uno anterior, uno terminal y
uno dorsoventral. El sistema posterior está basado en la ubicación del ARNm de un
gen que se llama Nanos. En sistema anterior está basado en otro ARNm de un gen
llamado Bicoid. Estos ARNm son portados por las células foliculares de la madre,
entran al embrión y dentro de este son traducidas a sus respectivas proteínas, las
cuales quedan distribuidas de acuerdo a un gradiente. Como durante estos
procesos el embrión se encuentra en forma de sincicio, los gradientes de
concentración que se generan afectan de manera diferencial a los distintos núcleos.
Las células foliculares también activan receptores llamados Torso y Toll. Torso y
Toll son dos genes que dan origen a dos receptores de membrana. Estas proteínas
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están presentes en toda la membrana del embrión, pero los ligandos de Torso y Toll
son sintetizados por las células foliculares solo en ciertos lugares.

en la parte anterior del embrión de la mosca, las células foliculares maternas

secretan ARNm de
bicoid, el cual se traduce dentro del embrión, generando un gradiente de
concentración de esta
proteína a lo largo de él; la proteína ​bicoid reprime​ ​la traducción del ARNm de
caudal​, por lo
que en la parte anterior, se observa poca proteína caudal, y en la parte posterior, se
observara mucha, formando un gradiente. Por otro lado, también se dijo que las
células foliculares maternas secretan ARNm de nanos solo en la parte posterior del
embrión, donde se traducen y generan un gradiente de concentración de esta
proteína. La proteína ​nanos reprime la traducción del ARNm de hunchback​,
generando un gradiente de concentración de la proteína hunchback, la que se
encuentra en mayor cantidad en la parte anterior, y en menor cantidad en la parte
posterior.

Señalización Spätzle-Toll-Dorsal​. Como se dijo antes, del lado ventral del embrión
se activa un receptor que se llama Toll, porque el ligando (llamado Spatzle) es
provisto por las células foliculares de la madre solo de este lado. Cuando Spatzle se
une a Toll, ésta se une a otra proteína llamada Pelle, y Pelle fosforila a otra llamada
Cactus. Cactus está unida a Dorsal, e impide su traslado al núcleo. Al ser fosforilada
por Pelle, Cactus es degradada, y Dorsal puede trasladarse al núcleo,
donde funciona como factor de transcripción. Entonces, se genera un gradiente
dorso-ventral en la cantidad de Dorsal nuclear.

Dorsal es un morfógeno. Distintas concentraciones de Dorsal activan diferentes

genes del embrión: altas concentraciones de dorsal activan la transcripción de Twist,
concentraciones intermedias de dorsal activan la transcripción de Sog y bajas
concentraciones de dorsal activan la transcripción de Dpp. Esto genera un nuevo
gradiente de concentraciones refinado en el que
las proteínas Dpp y Sog terminan de determinar los tejidos del eje dorsoventral. Se
determina el
mesodermo, el ectodermo, el tejido extraembrionario, etc.

Los genes maternos también activan un grupo de genes cigóticos​, que activan
a su vez otro grupo de genes, y así sucesivamente, a modo de cascada. Esto
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determina la pigmentación de Drosophila y establece (mediante los genes

homeóticos) la identidad de los segmentos.

Genes homeoticos​. Dan origen a las mutaciones causadas por alteraciones en la

expresión de genes homeóticos (genes Hox) organizados en dos clusters de genes
y codifican factores de transcripción con homeodominio (dominio de unión al DNA).
Los genes Hox se expresan a lo largo del cuerpo del embrión en el mismo orden en
que están alineados en el cromosoma (colinealidad).

Las plantas no tienen genes Hox.​ El modelo de determinación de compartimentos

florales es
denominado ABC. En el compartimiento 1 se expresa el gen A y determina la
formación de
sépalos, en el compartimiento 2 se expresan los genes A y B y juntos determinan la
formación de
pétalos, en el compartimiento 3 se expresan los genes B y C y juntos determinan la
formación de
estambres, y en el compartimiento 4 se expresa el gen C y determina la formación
de carpelos.