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Trabajo de Transformación Genética

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Transformación genética

En biología molecular, transformación es la alteración genética de una célula que resulta de la introducción y expresión de material genético externo (DNA). Se usan diferentes términos para las alteraciones genéticas resultantes de introducir DNA por virus (transducción) o por contactos intercelulares entre bacterias (conjugación). A la transformación de células animales se le llama transfección. El término transformación es también usado, de manera más general, para describir mecanismos de transferencia de DNA o RNA en biología molecular (es decir, teniendo en cuenta más que las consecuencias genéticas). Por ejemplo la producción de transgénicos como maíz transgénico requiere la inserción de nueva información genética en el genoma del maíz usando el mecanismo apropiado de transferencia de DNA; el proceso se le llama comúnmente transformación. El RNA también puede ser transferido en las células usando métodos similares, pero esto no provoca normalmente cambios heredables y por lo tanto no es información real

El proceso de transformación fue demostrado en 1928 por Frederick Griffith, un bacteriólogo inglés, que estaba en busca de una vacuna contra la neumonía bacteriana. Griffith descubrió que una cepa no-virulenta de Streptococcus pneumoniae podía ser transformada en virulenta al exponerla a cepas virulentas que habían sido matadas con calor.

El experimento de Griffith, llevado a cabo en 1928, fue unos de los primeros experimentos que demostró que las bacterias eran capaces de transferir información genética mediante un proceso llamado transformación. En 1928, el microbiólogo Frederick Griffith, que investigaba varias cepas de neumococo (Streptococcus pneumoniae), inyectó en ratones la cepa S y la cepa R de la bacteria. La cepa S era dañina, mientras que la rugosa (R), no lo era ya que la cepa S se cubre a si misma con una cápsula de polisacárido que la protege del sistema inmune del ser que ha sido infectado, resultando en la muerte de este, mientras que la cepa R no contiene esa cápsula protectora es derrotada por el sistema inmunológico. Cuando, inactiva por calor, la cepa S era inyectada, no había secuelas y el ratón vivía. Sorprendentemente, al combinar cepa R (no letal), con cepa S inactivada por calor (no letal), el ratón murió. Además, Griffith encontró células de cepa S vivas. En apariencia la cepa R se convirtió en cepa S.

Este hallazgo no se pudo explicar, hasta que en 1944 Avery, McLeod, y McCarty, cultivaron cepa S y: Produjeron extracto de lisado de células (extracto libre de células). Luego que los lípidos, proteínas y polisacaridos se removieron, el estreptococo aún conservó su capacidad de replicar su ADN e introducirlo en neumococo R. La inactivación por calor de Griffith habría dejado intacto el ADN de los cromosomas de las bacterias, que era el causante de la formación del gen S, y podía ser liberado por las células destruidas e implantarse en cultivos sucesivos de cepa R.

Conclusiones
El principio de transformación observado por Griffith era el ADN de la bacteria de cepa S (virulenta). Si bien la bacteria había muerto, su ADN sobrevivió al proceso de alta temperatura y fue tomado por la bacteria R (inofensiva). EL ADN de la cepa S contiene los genes que forman la cápsula de protección de polisacárido. Equipado con este gen, la cepa de bacteria R estaba ahora provista de protección frente al sistema inmune del animal y por lo tanto podía matar al animal. La naturaleza exacta del principio de transformación de ADN fue verificada en los experimentos realizados por Avery, McLeod y McCarty, y por Hershey y Chase En 1944, se demostró que este principio transformante era de índole genética, cuando Oswald Avery, Colin McLeod y Maclyn McCarty demostrarón la transferencia génica en S. pneumoniae. Avery, McLeod y McCarty llamaron a la introducción e incorporación de ADN en bacterias, transformación

Bacterias
En bacterias, la transformación refiere a un cambio genético estable producido al incorporar ADN desnudo (ADN sin células o proteínas asociadas), y la competencia refiere al estado de ser capaz de incorporara ADN exógeno del ambiente. Dos formas distintas de competencia deben ser distinguidas: natural y artificial. Competencia Natural Competencia (célula) Algunas bacterias (cerca del 1% de todas las especies)son capaces de incorporar de manera natural, ADN bajo condiciones de laboratorio; y muchas más pueden ser capaces de hacerlo en sus ambientes naturales. Estas especies traen un conjunto de maquinaria genética específica para llevar el ADN a través de la membrana o membranas. Competencia artificial La competencia artificial no esta codificada en los genes celulares. Sino que es inducida por procedimientos en el laboratorio, en donde las células son convertidas en permeables de forma pasiva, a través de condiciones que normalmente no ocurren en la naturaleza.[2]

Las células enfríadas en presencia de cationes divalente como Ca2+ (en CaCl2)prepara las membranas celulares para ser permeables al ADN plasmidial. Las células son incubadas en hielo con el ADN y luego darles brevemente un shock térmico (ej: 42°C por 30-120 segundos), lo que causa que el ADN entre en la célula. Éste método funciona muy bien en ADN plasmidial circular. Una excelente preparación de células competentes entrega ~108 colonias por microgramo de plasmidio. Una pobre preparación entrega aproximadamente 104/μg o menos. Buenas preparaciones no-comerciales debiesen arrojar 105 a 106 transformantes por microgramo de plasmidio. Este método no funciona muy bien con moléculas lineares, como fragmentos de ADN cromosomal, probablemente porque las enzimas exonucleasas en la célula rápidamente degradan el DNA lineal. Las células naturalmente competentes son generalmente transformadas de manera más eficiente con ADN linear que con plasmidios. La Electroporación es otra manera de crear agujeros en células bacterianas (y otros tipos también), mediante golpes de electricidad en un campo eléctrico de 10-20kV/cm. El ADN plasmidial puede entrar en la célula a través de ésos agujeros. Se aconseja usar éste método con ADN plasmidial de gran tamaño. Los mecanismos de reparación de membrana, cerrará rápidamente estos agujeros después del shock.
Transformación de plasmidio

Para ser mantenido de manera estable por la célula, el ADN plasmidial debe contener un origen de replicación, que permitirá la replicación en la célula, independientemente del cromosoma. Debido a que la transformación usualmente produce una mezcla de inusuales transformaciones y abundantes células no-transformadas, se necesita de un método para identificar las células que han adquirido el plasmidio. Los plasmidios utilizados en este tipo de experimentos, contienen usualmente un gen que les otorgue resistencia a un antibiótico. La cepa bacteriana a transformar, debe ser sensible a éste. Las células capaces de crecer en un medio de cultivo con este antibiótico, serán las que han sido transformadas por el plásmido, y las células que no puedan crecer carecerán de éste. Otro marcador, usado para identificar bacterias E. coli que han adquirido plásmidios recombinantes, es el gen lacZ, que codifica para β-galactosidasa. Debido a que la βgalactosidasa es un homotetrámero, en que cada monómero esta hecho de una proteína lacZ-α y lacZ-ω, si solo una de estas proteínas se expresa en la célula resultante, no se formará la enzima funcional. De esta manera, si una cepa de E. coli que ni tenga el gen lacZ-α en su genoma, es transformado usando un plasmidio que contiene el gen faltante, las células producirán β-galactosidasa, mientras que las no-transformadas no lo harán. En éste tipo de transformación, la región que contiene el sitio múltiple de clonamiento, o sitio polylinker, reside en el fragmento del gen lacZ-α, lo que significa que los plasmidios recombinantes tendrán el gen deseado insertado en alguna parte dentro de lacZ-α. Cuando este fragmento genético interrumpido sea expresado por la E. coli, no se producirá una proteína lacZ-α utilizable, por lo que no se formará β-galactosidasa utilizable. Cuando es crecida en un medio que contiene la galactosa modificada X-gal, las colonias que son capaces de metabolizar el sustrato (y por lo tanto, han sido transformadas, pero no por plasmidios recombinantes) aparecerán en color azul; las colonias que no puedan metabolizar el sustrato (y por ende no han sido transformadas por plásmidios recombinantes) aparecerán de color blanco. y eso se llama pezuña

Levadura y otros hongos
Éstos métodos son los conocidos para transformar levadura: • Acetato de Litio/transportador de ADN monohebra/Método del polietilenglicol Muchas variaciones han sido descritas, incluyendo transformación rápida y métodos de transformación de alta eficiencia. • Protocolo de congelamiento de levadura: Permite crear células de levadura congeladas que sean competentes para transformar después de deshielarse. • Transformación por biobalística Nanoparticulas de oro cubiertas de ADN que pueden dispararse a hongos (Fungi) creciendo en PDA, transformándola. Esta misma técnica puede ser aplicada a plantas. • Transformación por Protoplasto Las esporas de hongo pueden ser convertidas a al remover su cubierta protectora, y luego ser empapadas en una solución de ADN y ser transformadas

Andrea Souto García

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