ACTIVACIÓN CELULAR

¿Cómo obtener un cultivo unidireccional?

Para un CML (cultivo mixto linfocitario) unidireccional, se inhibe la proliferación de las células
mononucleares de sangre periférica de uno de los individuos, que entonces solo podrán actuar
como células estimuladoras pero no como células respondedoras. En genal, dicha inhibición de la
proliferación se logra irradiando las células estimuladoras o tratándolas con mitomicina C
(inhibidor de la mitosis). En el caso de este últmo tratamiento, es necesario realizar un lavado
exhaustivo de la droga antes de enfrentar a las células estimuladoras con las células
respondedoras varias veces.

La proliferación de linfocitos T del otro individuo, se determina por medio de la cuantificación de la

captación de timidina tritiada.

Esta técnica, desarrollada esencialmente en el pasado, se utilizaba para evaluar el grado de

histoincompatibilidad entre donante y receptor en los trasplantes de órganos, especialmente el de
médula ósea. Este estudio no se realiza más porque los MHC se tipifican por métodos moleculares.

Teorías de proliferación de Lc en cultivo mixto

1. Las moléculas de MHC tienen numerosos epítopos capaces de estimular la proliferación de

linfocitos, la proliferación principalmente es de linfocitos TCD4 que reconocen moléculas
de clase II extrañas, presentes sobre la superficie de células que estimulan (linfocitos B,
monocitos, células dendríticas). Asimismo, los linfocitos T CD8 también se activan por
reconocimiento de moléculas de clase I extrañas (alogénicas) sobre la superficie de todas
las células estimuladoras.

Fundamento de la cuantificación de la proliferación celular con alamar azul.

Los linfocitos estimulados con mitógeno exhiben un incremento en su actividad metabólica. Este
incremento se mide por la incorporación de un indicador de óxido-reducción que fluoresce y
cambia de color en respuesta a una reducción química de medio de crecimiento resultado del
crecimiento celular. La actividad metabólica celular innata resulta de una reducción química del
Alamar azul por parte de los citocromos; el continuo crecimiento celular mantiene un medio
reducido (es decir fluoresce o se torna de un color rosa), mientras que la inhibición de la
proliferación mantiene un medio oxidado representado por la no fluorescencia o un color azul, lo
cual se puede medir en un fluorómetro o espectrofotómetro, respectivamente. Lla fluoresnecia o
colorimetría indicara el grado de disparidad de los antígenos MHC-II de las células respondedoras
frente a las estimuladoras.
Problema

In vivo In vitro
+ +
- -
+ - Ag (varidasa)
- +
Linfocitos T

Determinación de linfocitos T y B

Métodos modernos específicos para determinar linfocitos

  Determinación de marcadores y receptores de membrana. Inmunofluorescencia: las
inmunoglobulinas de superficie de los Lc B pueden ser detectadas con anticuerpos
monoclonales marcados con fluorescencia (isotiocianato de fluoresceía) dirigidos para el
BCR, también pueden estar dirigidos para el CD19. En el caso de Lc T, son Ac dirigidos al
CD3 O TCR (linfocitos totales), CD4 (T cooperadores), CD8 (T citotóxicos). En el microscopio
de fluorescencia se irradian con luz UV para producir una exitación de los electrones no
conjugados que brincan a niveles energéticos mayores, los que al regresar a su nivel
original liberan la energía absorbida en forma de luz visible, permitiendo la identificación
de los respectivos Lc.
Se pueden cuantificar los linfocitos mediante el marcaje con naranja de acridina y la
posterior observación al microscopio de fluorescencia y luz ordinaria a la vez. Los linfocitos
T y B se marcan con la naranja de acridina, presentando los linfocitos T rosetas mientras
que los B se marcan con la naranja de acridina pero no forman rosetas.
 Determinación de antígenos de membrana: Expresión diferencial de marcadores de
superficie y disponibilidad de anticuerpos monoclonales con especificidad deseada. Por
ejemplo la citometría de flujo. El citómetro de flujo es un aparato que permite caracterizar
e incluso separar las diferentes poblaciones de linfocitos mediante el uso de anticuerpos
monoclonales marcados, por ejemplo con fluoresceína, contra los marcadores de
superficie de cada subpoblación que se desee (se pueden valorar varios a la vez, Ac contra
CD2, CD4, CD8, etc). Posteriormente las células pasan a través de un haz luminoso que
detecta su capacidad para dispersar la luz (tamaño de las células) y la fluorescencia que
emiten (tipo de célula) por los fluorocromos presentes en la célula o partícula al ser
excitados por el rayo luminoso. Las señales luminosas detectadas se transforman en
impulsos eléctricos que se amplifican y se convierten en señales digitales que son
procesadas por una computadora. Las mediciones obtenidas se indican en porcentajes de
cada población


¿Por qué la suma de Lc B y Lc T no da 100%?

Porque falta considerar los linfocitos NK

Aplicaciones de la determinación de Lc B y Lc T

La cuantificación de Lc T es importante en pacientes con deficiencias de su sistema inmune, ya

sean innatas o adquiridas. La enumeración de las poblaciones linfocitarias (T y B), contribuyen a
precisar la naturaleza de la inmunodeficiencia, a predecir las complicaciones más probables,
establecer una base para las estrategias profilácticas y terapéuticas posibles.

En pacientes infectados por el VIH, la evaluación de su estado inmunológico incluye un control

periódico de sus cifras de linfocitos T, en especial la subpoblación CD4+ cuyas disminuciones
muestran correlación con la aparición de los signos y síntomas característicos del síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA).

En pacientes que reciben tratamientos inmunosupresivos fuertes ( receptores de trasplantes, o

pacientes con neoplasias tratadas mediante quimioterapia/radioterapia, etc.), su seguimiento y
control se realiza por la evaluación de linfocitos T y B que puede proveer información útil para
regular la dosificación del tratamiento.

En enfermedades linfoproliferativas como las leucemias linfocíticas, la clasificación con base en su

origen T, B, o NK posee interés, dado que el pronóstico y la susceptibilidad a distintas terapias
pueden mostrar diferencias. Por ejemplo, entre las leucemias linfocíticas agudas (LLA), la LLA no-
B/no-T posee relativamente buen pronóstico, mientras la LLA-T es de pobre pronóstico y la LLA-B
es la de peor pronóstico.

¿Por qué eliminar en esta técnica PMN?

Deficiencias del complemento

Las deficiencias del complemento se transmiten generalmente de forma autosómica recesiva a excepción de
la deficiencia de C1 inhibidor que lo hace de forma autosómica dominante y el defecto de properdina que se
transmite de forma recesiva asociada al cromosoma X.

Deficiencia de C3: El individuo tiene susceptibilidad especial a infecciones por bacterias en el que la
oponización es el mecanismo primario de defensa, por ejemplo con: Staphylococcus pneumoniae, S. pyogens
o Haemophilus influenzae.

Deficiencia de C1, C4 o C2: Estos pacientes tienen una susceptibilidad mayor a infecciones por
Staphylococcus pneumoniae, S. pyogens o Haemophilus influenzae, puesto que estos componentes son
necesarios para la activación de C3; aunque la suceptibilidad en estos pacientes es menor que en la
deficiencia de C3 por tener la vía alterna intacta.

Deficiencias de C terminales: se asocia con infecciones por bacterias G(-), como Neisseria meningitidis, pero
la infección por G(+) no está aumentada, ya que estas bacterias no son susceptibles a la actividad bactericida
del sistema del C. Son más susceptibles a infecciones sistémicas que las locales (sinusitis, otitis y neumonía).

Deficiencias de C2 y C4: Las deficiencias de estos componentes esta asociada con enfermedades
autoinmunes como lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide y anemia hemolítica autoinmune
Lupus eritematoso: es un trastorno autoinmunitario en el cual el sistema inmunitario del cuerpo ataca por error
el tejido sano. Éste puede afectar la piel, las articulaciones, los riñones, el cerebro y otros órganos.