Tcnicas inmunolgicas y moleculares para la determinacin de haplotipos HLA y transplantes en general

Inmunologa Aplicada 1065 Formacin de profesores 2005 Carolina Hernndez Supervisado por MD Lastra

Microlinfocitotoxicidad

Se distribuyen los linfocitos de los donadores potenciales y el receptor en una placa de microtitulacin. Se aaden a los diferentes pozos anticuerpos especficos para diversos alelos MHC de las clases I y II. Se incuba y se adiciona complemento a los pozos y se valora la citotoxicidad segn la captacin o exclusin de colorante por las clulas.

Si los leucocitos expresan el alelo MHC para el que es especfico el anticuerpo, las clulas experimentan lisis al aadir complemento y estas clulas captan el colorante. Esta prueba puede indicar la presencia o ausencia de diversos alelos MHC

Cultivo Mixto de Linfocitos

Cuando se combinan los linfocitos de dos individuos con diferentes HLA en el cultivo de tejido, las clulas crecen, sintetizan DNA y proliferan, mientras que las clulas con HLA idntico permanecen en reposo. La proliferacin se desencadena principalmente por diferencias en los antgenos HLA clase II entre las dos poblaciones clulas por analizar.

La reactividad en la prueba CML quiz refleja el paso inicial del reconocimiento inmunitario del rechazo a transplante in vivo. Mientras ms inmunognica sea la diferencia del locus D, mayor ser la respuesta celular del CML y mayor posibilidad habr de un rechazo al transplante. Normalmente ambas clulas proliferan y forman el CML de doble va.

Para evaluar la respuesta de una sola clula responsable, se inactiva la clula estimulante por medio de radiacin o frmacos , que inhiben la sntesis de DNA. Por lo general se presenta una respuesta proliferativa despus de incubar 6 das.

Entonces, se aplica al cultivo un pulso de timidina tritiada de 5 a 12 horas para marcar al DNA recin sintetizado. Finalmente se cosechan las clulas, se libera la radioactividad no adherida y con un contador beta se da el resultado en CPM. Esta prueba se utiliza para confirmar la aparente identidad de HLA, en el caso de transplante de donador familiar. Revela incompatibilidades ocultas de clase II.

LMC

La exposicin a antgenos no propios de clases I y II, puede dar como resultado la generacin de linfocitos T citotxicos (CTL). Los CTL matan a sus clulas blanco mediante contacto directo, quiz por la liberacin de mediadores txicos que llevan a la lisis celular. Los CTL tipo CD4 y CD8, se pueden observar infiltrando los aloinjertos renales durante el rechazo y se considera que son efectores importantes en la prdida del injerto.

Se corre un CML primario con las clulas del donador como estimulantes inactivados. Se cosechan las clulas del paciente y se reexponen en cultivo a clulas frescas del donador, marcadas con Cr51. Por lo general, la clulas marcadas se preincuban con PHA durante 6 das (incorporan ms cromo que los linfocitos en reposo). Las CTL y las clulas marcadas se colocan en relacin de blanco a efector de 100:1, 50:1 y 10:1.

Los pozos control incluyen blancos solos para medir la liberacin espontnea de la marca y pozos de prueba que contienen clulas marcadas. Despus de 4 horas de incubacin se toma una muestra del sobrenadante de cada pozo de prueba y se cuenta. Las cuentas elevadas de 30 a 50% que exceden la actividad de fondo, son indicativas de actividad de linfocitos T citotxicos. Esta prueba puede evaluar el rechazo posterior al trasplante de rin y mdula sea.

Pruebas cruzadas
El propsito de las pruebas cruzadas es detectar la presencia de anticuerpos en el suero del paciente, dirigidos contra los antgenos HLA del presunto donador. En caso de estar presentes, los anticuerpos dan la seal al sistema inmune de que el receptor ha estado sensibilizado contra estos antgenos del donador y que por tanto, est preparado para rechazar de manera enrgica cualquier injerto que los posea.

Linfocitotoxicidad
De

manera preliminar se evala a donadores potenciales utilizando el mtodo estndar de citotoxicidad usando como clulas blanco las clulas del donadores. En condiciones normales, los PBL son alrededor de 80% de clulas T que poseen slo antgenos HLA clase

 El

resto son clulas B y monocitos, que poseen ambas clases de HLA. Una prueba positiva por medio de citotoxicidad indica claramente la presencia de anticuerpos contra antgenos de clase I.

Pruebas cruzadas con clulas T

Se realizan a 37 C para evitar el enlace de anticuerpos frios, que se supone, son autorreactivos. Una prueba positiva clulas T por cualquier mtodo contraindica el trasplante.

Pruebas cruzadas con clulas B

Las pruebas cruzadas para anticuerpos contra antgenos HLA clase II, requiere el uso de linfocitos B como clulas blanco. Una prueba cruzada positiva para clulas B puede provenir de anticuerpos que se enlazan a antgenos HLA clase I o II. Ms an, las clulas B son un indicador ms sensible para anticuerpos dbiles clase I, ya que llevan molculas clase I en mayor densidad que las T.

Pruebas cruzadas por citometra de flujo

Se ha demostrado que las pruebas cruzadas mediante citometra de flujo (FCC) son hasta 100 veces ms sensibles que los mtodos serolgicos visuales para la deteccin de anticuerpos HLA en los linfocitos Las clulas T se pueden separar de las B por medio de un anticuerpo fluorescenado (anti-CD3)

Los linfocitos del donador se incuban con el suero del paciente para permitir la fijacin de cualquier anticuerpo antidonador. Los anticuerpos enlazados a la poblacin de clulas T seleccionada, se detectan mediante IgG anti-humana especfica antiFc del anticuerpo F(ab)2y se marca con un fluorocromo distinto al que marca a las clulas T

Mtodos Moleculares para HLA

Nombre RFLP

Reactivos caractersticos Endonucleasas de restriccin bacteriana Cebadores de PCR especficos a secuencia

Procesos caractersticos Southern blot

Polimorfismos detectados Longitud del fragmento de restriccin Genrico a antgenos HLA a nvel de alelo

SSP

PCR/electroforsis en gel

SSOP

Sondas de aligonuclotido especficas a secuencia

Cebadores marcados/terminald ores de secuencia marcados DNA desnaturalizado de tira simple/generador UHG

PCR/hibridacin de Alelos HLA sondas con producto de la PCR

PCR/establecimien Alelos a nivel de to de secuencia del secuencia exacta producto de la PCR Reunin de tiras de DNA /electroforsis del DNA recombinado Complejos del DNA caractersticos de alelos

SBT

Anlisis heterodplex

Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restriccin (RFLP)

El DNA genmico extrado de clulas se digiere con enzimas de restriccin selectiva. Los digeridos se someten a una electroforesis en gel de agarosa, el DNA se desnaturaliza en tiras de una sola cadena y el patrn de los fragmentos se transfiere a una membrana de soporte, mediante Southern blot

Los fragmentos de DNA, se hibridan con una sonda especfica para el sitio HLA, marcado con material radioactivo (DRB1). Despus de la autorradiografa los fragmentos de restriccin que se han hibridado con la sonda, aparecen como patrones de bandas aisladas de tamao especfico (kB) Muchos alelos HLA tienen patrones caractersticos de formacin de bandas (polimorfismo en la longitud del fragmento).

Los productos amplificados son objeto de electroforsis y se tien con bromuro de etidio y se fotografa bajo luz UV. Si los cebadores hibridizan con la muestra de DNA, es visible una banda (la cual indica la presencia del alelo HLA particular). La falta de amplificacin implica la ausencia de esa secuencia allica particular en la muestra de DNA.

Primers de secuencia especfica (SSP)

Se extrae el DNA de la muestra (clulas, tejidos) y se mezclan con cebadores que tienen especificidad para las secuencias caractersticas de cada uno de los alelos del sitio HLA clase II que se tipifican (DRB1,DRB3,etc.). Se colocan alcuotas de la muestra en tubos separados cada uno contiene un conjunto de cebador especfico y se amplifica en un termociclador.

Los productos amplificados son objeto de electroforsis y se tien con bromuro de etidio y se fotografa bajo luz UV. Si hibridizan con la muestra de DNA, se hace visible una banda (la cual indica la presencia del alelo HLA particular). La falta de amplificacin implica la ausencia de esa secuencia allica particular en la muestra de DNA.

Todos los tubos contienen una plantilla de DNA adicional que hbrida con todos los primers para servir como un control en el xito de la PCR.

Sondas de oligonucletidos especifcas de secuencias (SSOP)

Las sondas de oligonucletido son segmentos cortos de DNA de tira simple, de 18 a 24 nucletidos, cada uno de los cuales est constituido por una secuencia de nucletido complementaria a un motivo de secuencia particular que se encuentra dentro de las regiones invariables de los alelos HLA individuales.

Estas sondas solo hibridan con sus secuencias exactamente complementarias en condiciones estrictas de hibridacin. An la diferencia de un simple par de bases hace que las sondas se separen del pareado con el DNA blanco. Est propiedad de especificidad perfecta de secuencia brinda a este modelo de tipificacin una mayor resolucin de alelos del HLA

Mtodo SSOP Dot-Blot

Se aplican las muestras de DNA (o RNA) directo en una membrana de soporte mediante el uso de una plantilla de hendidura (solt-blot). Los replicados de una sola muestra se colocan en una sola columna de hendiduras. Despus de que se han dispersado las muestras, la membrana se corta en lneas horizontales.

Se preparan sondas individuales especificas y diagnsticas para alelos individuales HLA, como DR1y DR2. Cada banda se hibrda con una sonda distinta de oligonucletidos especifica de secuencia radiomarcado (SSOP). La membrana se reensambla y se revela por autorradiografa o colorimetricamente. Una banda indica la presencia en la muestra de la secuencia del alelo HLA correspondiente

SSOP Dot-Blot reversa

Un mtodo ms simple consiste en fijar las sondas especficas de secuencia a la membrana de soporte y se aplican gotas del DNA de la muestra en las sondas. Se permite que la muestra de DNA hibrde, se lava la membrana y se revelan las manchas de la sonda de hibridacin con la muestra del DNA por mtodos colorimtricos

Tipificacin basada en secuencia (SBT)

Se aisla el DNA de una clula o tejido y se amplifica mediante la PCR con el uso de cebadores de sitio o especifcos a grupo. El producto amplificado se distribuye en cuatro tubos, cada uno de los cuales tiene polimerasa, dNTP y mezclas de establecimiento de secuencia . Cada una de estas mezclas esta marcada con un terminador de secuencia marcado con fluorescencia.

El tubo 1 contiene citosina marcada;el tubo 2, guanina marcada; el tubo 3, timina marcada y el tubo 4, adenina marcada. El producto se amplifica mediante la PCR para incorporar los terminadores marcados. Los cuatro tubos de muestra se mezclan y se sujetan a electroforsis para formar una escalera de secuencia, la cual se rastrea por un lser para generar un electroferograma de secuencia del DNA.

Con el uso de programas de computadora se compara la secuencia con la biblioteca de secuencias de antgenos HLA y se asignan los antgenos HLA

Anlisis heterodplex
Polimorfismo conformacional de tira nica (PCR-SSCP)

Mtodo rpido que usa la propiedad que tienen las tiras desnaturalizadas del DNA para reunirse nuevamente en heterodplex (formar la doble hlice). S los individuos son genticamente distintos para alelos HLA, la desigualdad en las bases polimorfas modifica la desviacin o aumenta el dimetro superhelicoide del DNA y causa retardo en la movilizacin electrofortica.

Cuando se mezcla DNA desnaturalizado de dos individuos diferentes se forman nuevos heterodplex con generacin de nuevos patrones de banda en la electroforesis. Puede evaluarse rpidamente la identidad gentica entre dos indiciduos mezclandop DNA de la PCR de sus genes HLA.

De manera alterna, puede agregarse DNA de referencia para un alelo simple o una molcula generadora heterodplex universal sinttica (UHG) a la muestra de la PCR. Esto forma complejos heterodplex singulares para cada alelo y de esta manera se generan bandas caractersticas que ayudan al diagnstico.

Tipificacin VNTR

El genoma humano contiene trechos de secuencias sumamente repetitivas, que a menudo se presentan en agrupamientos. El numero de repeticiones en un agrupamiento varia entre individuos y da lugar a un nmero variable de duplicados colocados en tndem (VNTR).

Este polimorfismo puede traducirse en fragmentos de amplitud variable para amplificacin con la PCR mediante primers diseados para amplificar la regin de la repeticin. Los VNTR tienen clsicamente una longitud de 10 a 50 bases, tambin se usan polimorfismos genticos de secuencias cortas conocidas como duplicados cortos en hilera (STR) de 4 a 9 pb de longitud, para la determinacin de huellas digitales de DNA.

Los VNTR pueden analizarse con electroforesis del DNA ya sea genmico o amplificado por la PCR. Una aplicacin de los VNTR es la vigilancia del establecimiento del injerto en receptores de transplante de mdula sea. Los anlisis de VNTR se usan como un marcador gentico con aplicaciones tanto clnicas como forenses.