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SP-16
Seleccionar un plásmido por cada bacteria seleccionada (investigación formativa) para:
a) Generar el mapa de restricción
b) Detectar enzimas de restricción con sus respectivos isoschizómeros y neoschizómeros.
Instrucciones
(a) Detectar “Endonucleasas de restricción” (RE) que:
- cortan una sola vez al plásmido, pero que no cortan al gen funcional de la replicación.
- con “Sitio de restricción o reconocimiento” perfecto de 6 bp
- con Patrones de corte cohesivo con extensión 5′ P o 3′ OH.
Verificar si RE tienen isoschizómeros y/o neoschizómeros.
(b) Para el plásmido asignado obtener:
Información simplificada de la anotación
Formato “fasta” de la secuencia

New England Biolabs

NEB: Reagents For the Life Sciences Industry

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https://international.neb.com/tools-and-resources/interactive-
tools
NEBcutter™ v3.0
https://nc3.neb.com/NEBcutter/

Klebsiella pneumoniae isolate INF321-sc-2280120 plasmid 4, complete sequence

LOCUS NZ_LR890672 4518 bp DNA circular CON 03-NOV-2021
DEFINITION Klebsiella pneumoniae isolate INF321-sc-2280120 plasmid 4, complete
sequence.
ACCESSION NZ_LR890672
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VERSION NZ_LR890672.1

FEATURES Location/Qualifiers
source 1..4518
/organism="Klebsiella pneumoniae"
/mol_type="genomic DNA"
/isolate="INF321-sc-2280120"
/plasmid="4"
gene complement(630..1040)
/locus_tag="JMW44_RS26095"
/product="helix-turn-helix domain-containing protein"
/protein_id="WP_025714791.1""
gene complement(1040..1231)
/locus_tag="JMW44_RS26100"
/product="Rop family plasmid primer RNA-binding protein"
/protein_id="WP_025714792.1"

BspEI 1411
gene complement(1703..1894)
/locus_tag="JMW44_RS26105"
/product="Rop family plasmid primer RNA-binding protein"
/protein_id="WP_022631206.1"
gene 2294..3289
/locus_tag="JMW44_RS26110"
/product="hypothetical protein"
/protein_id="WP_201507411.1"
gene complement(3314..4231)
/locus_tag="JMW44_RS26115"
/product="replication initiation protein"
/protein_id="WP_193944603.1"

Explicación:

- El tamaño del plásmido es de 4518

- El gen de la proteína iniciadora de la replicación esta codificada en la banda de la tira negativa
- El primer nucleótido de la ORF 3314
- El ultimo nucleótido de este ORF es 4231
- La región que contiene al promotor esta entre el 2294 al 3314

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Explicacion :

 Se muestra el mapa genético circular

 Nuestro gen fue 331 aa
 Las enzimas de restricción son Hindill y BspEl al extremo 5`del Orf que cortan al plasmido pero no
interrumpen ninguna función .

BspEI CUT SITES

Cut Position Site with Flanks (5′  3′)

1411/1415 1401 TTACCTGTAG T CCGG A AAAATAATCC

HindIII CUT SITES

Cut Position Site with Flanks (5′  3′)

1154/1158 1144 CAAGCTCGTT A AGCT T CTCCAGCAGG

Conclusiones

 BspEI corta al plásmido en una posición que no interrumpe a ningún gen funcional
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 HindIII corta al plásmido en una posición que interrumpe al gen funcional que codifica:
/product="Rop family plasmid primer RNA-binding protein"
Pero no interrumpe al gen funcional de la replicación

 Ambas enzimas de restricción cortan en el extremo 5` lo que genera extensiones 5 fosfato lo que
genera patrones de extensión iguales .