COPROCULTIVO

El estudio microbiológico de la materia fecal para el aislamiento e identificación de bacterias

productoras de diarrea se denomina “coprocultivo”.
Examen directo
El examen directo de la metería fecal en una preparación húmeda con SSF permite observar la
presencia de leucocitos (generalmente polimorfonucleares) lo cual es común encontrar en infecciones
bacterianas y algunas parasitarias. En las muestras de diarrea de casos de cólera o las producidas por
rotavirus no se observan leucocitos.
El examen con la tinción de Gram tiene poco valor para el diagnóstico de las enteritis
bacterianas, ya que, a excepción de Campylobacter y Vibrio (bacilos gramnegativos curvos), el resto de
las bacterias enteropatógenas no poseen una morfología característica.
Cultivo
Los medios de cultivo utilizados son medios de enriquecimiento y selectivos que permiten el
crecimiento de las bacterias que se desea aislar, inhibiendo casi por completo el resto de la flora.
Deben emplearse siempre medios selectivos para el aislamiento de Salmonella y Shigella y si
es posible para Campylobacter ya que estos son los responsables de la mayoría de las enteritis
bacterianas. Cuando en una población se encuentran casos de cólera, se debe investigar V. cholerae
O1.
Los campilobacter son microaerófilos, y los que causan enteritis con mayor frecuencia son
termofílicos por lo que se recomienda incubar los medios selectivos como el de Skirrow a 42º C en
atmósfera microaerófila durante 48 horas (80% de H, 10% de O2 y 10% de CO2).
Para el aislamiento de Shigella Salmonella y V. cholerae el procedimiento se describe
enseguida:

Material y reactivos
 Muestra de heces o hisopo rectal
 Yodo-yoduro al 30 %
 Asa de nicromo
 Gradillas
 Portaobjetos
 Mechero
 Incubadora
 SSF

Medios de transporte:
Cary- Blair o de Stuart

Medios de enriquecimiento selectivo:

Caldo tetrationato (CTT) ó Caldo selenito F (CS)
Agua peptonada alcalina (APA)

Medios selectivos para siembra directa:

Agar de Eosina y azul de metileno (EMB) ó Agar MacConkey
Agar TCBS ( Tiosulfato, citrato, bilis, sacarosa)

Medios selectivos para siembra indirecta:

Agar sulfito de bismuto (SB) ó Agar Salmonella- Shigella (SS)
Agar TCBS ( Tiosulfato, citrato, bilis, sacarosa)

Medios de cultivo para pruebas bioquímicas:

Enterobacterias
LIA, MIO,TSI, CITRATO, MRVP, FAD,UREA

1
 Vibrio
MIO, LIA, ARGININA

Antisueros:
Polivalente A-I +Vi para Salmonella
4 antisueros para Shigella uno para cada especie
Polivalente Grupo O1 para Vibrio cholerae

COPROCULTIVO
Aislamiento de Salmonella, Shigella y V. cholerae a partir de heces

METODO DIRECTO

1. A partir de la muestra directa o muestra en hisopo contenido en un medio de transporte (Cary

Blair o Stuart)
2. Tomar el hisopo con pinzas esterilizadas y descargar en un tercio de las placas de EMB (o Mac
Conkey) y en TCBS
3. Colocar un hispo con muestra en CTT y otro en APA (para método Indirecto)
4. Continuar sembrando las placas de acuerdo a la descripción del Capítulo 2 (ver figura)
5. Incubar el EMB ó el Mac Conkey a 37°C durante 24h
6. Describir las colonias
7. Si crecieron colonias características de Salmonella o Shigella, elegir una colonia (realizar
resiembras si se requiere)
8. Sembrar bioquímicas MIO, LIA, TSI
9. Si crecieron colonias características de Vibrio cholerae elegir una colonia
10. Sembrar bioquímicas MIO, LIA, ARGININA
11. Incubar bioquímicas 24h e interpretar resultados
12. Identificar si se aisló Salmonella, Shigella ó Vibrio cholerae

MÉTODO INDIRECTO

1. Incubar el CTT con muestra 18-24h a 37°C y el APA 6-8h a 37°C

2. Tomar una o 2 asadas del APA y en TCBS descargar en un tercio de la placa
3. Tomar una o 2 asadas del CTT y en agar SB y/o SS, descargar en un tercio de la placa
4. Continuar sembrando las placas de acuerdo a la descripción del Capítulo 2 (ver figura)
5. Incubar las placas a 37°C durante 24 a 48 h
6. Describir las colonias
7. Si se observan colonias características de Salmonella, elegir una colonia aislada
8. Sembrar pruebas bioquímicas LIA, TSI
9. Si se observan colonias características de V. cholerae, elegir una colonia aislada
10. Sembrar pruebas bioquímicas LIA, MIO, ARGININA
11. Incubar 24h e interpretar resultados
12. Identificar si se aisló Salmonella ó V. cholerae

13. Se reporta Salmonella, sólo con la identificación bioquímica. Se puede realizar aglutinación
serológica con antisuero para Salmonella polivalente A-I+Vi una aglutinación positiva confirma
que corresponde a alguno de los grupos del A al I y si la aglutinación es negativa se puede enviar a
un laboratorio de referencia como el InDRE, para conocer el serotipo con fines epidemiológicos.
14. A las cepas sospechosas de Shigella se les debe aglutinar con los 4 antisueros para identificar la
especie. No se debe reportar sólo con bioquímicas
15. Si la cepa corresponde a Vibrio cholerae aglutinar con suero para conocer el serogrupo. Realizar
prueba serológica con antisuero para Vibrio cholerae O1
16. En caso de ser positivo aglutinar con los antisueros para los serotipo Ogawa e Inaba

2
Resultados en medios diferenciales
Medio de cultivo Morfología macroscópica Bacterias probables
Colonias azul oscuro con o sin brillo verde E.coli y otras enterobacterias
metálico fermentadoras de lactosa
EMB
Salmonella, Shigella y otras
Colonias translúcidas enterobacterias que no fermentan
la lactosa
Colonias rosas o rojas E.coli y otras enterobacterias
fermentadoras de lactosa
Mac Conkey
Colonias translúcidas con vire amarillo en el Salmonella, Shigella y otras
medio enterobacterias que no fermentan
la lactosa
SB Colonias negras con precipitado negro Salmonella
Colonias amarillas planas y el medio vira a V.cholerae y enterobacterias que
amarillo fermentan la sacarosa

Colonias azul verdosas V. parahaemolyticus y

TCBS Entrerobacterias que no fermentan
la sacarosa
Colonias azul verdosas con precipitado negro Entrerobacterias que no fermentan
la sacarosa y producen sulfhídrico

3
4
5
 Determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos. Método de Kirby Bauer
La prueba de sensibilidad a los antimicrobianos denominada antibiograma, evalúa la capacidad de un
antibiótico u otro fármaco antimicrobiano para inhibir in vitro el desarrollo los microorganismos, lo que tiene
como finalidad guiar al médico en la selección de agentes antimicrobianos eficaces en tratamientos
determinados y reunir información epidemiológica sobre la resistencia de microorganismos de importancia
sanitaria en una comunidad.

Para que sea válida, la prueba de sensibilidad deberá efectuarse mediante un método reproducible.
El criterio definitivo de confiabilidad de los métodos de pruebas de sensibilidad es la correlación que
presenten con la respuesta del paciente al tratamiento antimicrobiano. CHM

Las pruebas de sensibilidad pueden clasificarse como:

1. - Prueba de dilución
2. - Prueba de difusión

Prueba de dilución: sirve para evaluar cuantitativamente la acción de un antimicrobiano. Esto se

logra añadiendo diluciones del antimicrobiano a caldos de cultivo o a medios con agar en los que luego se
siembra el microorganismo de prueba en concentración constante. Después de 16-18 horas de incubación, la
concentración más baja que impide el desarrollo del microorganismo, se conoce como concentración mínima
inhibitoria (MIC) del antibiótico. Posteriormente se compara el valor de la MIC con las concentraciones de los
antimicrobianos que pueden alcanzarse en suero y otros líquidos orgánicos para evaluar la probable
respuesta clínica.
CHM

Prueba de difusión: Se siembra uniformemente el microorganismo problema en una placa de agar

Muelle Hinton, se colocan en la superficie varios discos de papel, impregnados con antimicrobianos, estos
difunden en el medio de cultivo a partir del disco siguiendo un gradiente de concentración, de manera que el
crecimiento microbiano resulta inhibido a una distancia del disco relacionada con la sensibilidad del
microorganismo. Existe una relación aproximadamente lineal entre el logaritmo de la MIC y el diámetro de la
zona de inhibición en la prueba de difusión.

Las dos deben cumplir algunas condiciones ya que pueden ser fuente de error, la cantidad de
inóculo, el tiempo y temperatura de incubación, el pH del medio, la atmósfera y la estabilidad de los agentes
antimicrobianos en los discos, para obtener buenos y confiables resultados. La variación en el contenido
iónico entre lotes, afectan a la difusión de las sulfonamidas, tetraciclinas, polimixinas, aminoglucósidos,
quinolonas entre otros. Las pruebas de difusión también están influenciadas por la cantidad del
microorganismo, por el tipo, grosor y concentración del agar utilizado.

Para obtener resultados reproducibles, todos los detalles técnicos del procedimiento de la prueba
deben estar estandarizados. El método normado, actualmente recomendado por el Subcomité de Pruebas de
Susceptibilidad Antimicrobiana del CLSI / NCCLS (Clinical and Laboratory Standards Institute / National
Committee for Clinical Laboratory Standards) se basa en el método original descrito por Kirby y Bauer .

El medio de cultivo es el de Mueller-Hinton (MH), que permite el crecimiento de casi todas las
bacterias. Este medio puede ser suplementado con un 5% de sangre desfibrinada de caballo, oveja o conejo,
cuando la bacteria lo requiera para su desarrollo. El pH del medio debe estar entre 7.2 y 7.4, y el grosor de la
placa debe ser de 4 mm.
Para adecuar la densidad del inóculo destinado a una prueba de susceptibilidad, se debe utilizar un
patrón de turbidez con BaSO4 equivalente al tubo 0.5 de McFarland.

6
Preparación del estándar de BaSO4:
1. Un volumen de 0.5 mL de BaCl2 0.048 M /L (1.175 % p/v BaCl2. 2H2O) se añade a 99.5 mL de H2SO4 0.18 M
/L (0.36 N) (1%v/v) agitando vigorosamente.
2. La turbidez del patrón deberá verificarse utilizando un espectrofotómetro con cubeta de 1 cm de
diámetro, para el patrón 0.5 de McFarland la absorbancia a 625 nm debe ser entre 0.080 y 0.100.
3. La suspensión de sulfato de bario se transfiere en alícuotas de 4 a 6 mL dentro de tubos con tapón. Estos
tubos deben ser del mismo tamaño que los utilizados en el cultivo o para la suspensión del inóculo
bacteriano, los más comunes son los de 13x100.
4. Estos tubos deberán cerrarse herméticamente y se guardarán en lugar oscuro a temperatura ambiente.
5. Este patrón debe agitarse vigorosamente (ó en un vortex) antes de cada uso, y se inspeccionará para
comprobar que mantiene una turbidez uniforme. Cuando aparezcan partículas de gran tamaño, éste deberá
ser reemplazado. Mensualmente deberá comprobarse su absorbancia.

ANTIBIOGRAMA

Objetivo:
Determinar la sensibilidad de bacterias Grampositivas y gramnegativas a diferentes antibióticos
utilizando la técnica de difusión en placa de Kirby-Bauer.
CHM

Material necesario:
 Tubo con solución de sulfato de bario equivalentes al tubo 0.5 del nefelómetro de MacFarland
 Cepas de E.coli y S. aureus (u otras bacterias G+ y G-) en AST con una incubación de 18- 24 h. (Las
cepas podrán ser de las aisladas en cultivos de las prácticas).
 Asas de nicromo
 Hisopos estériles
 Discos con antimicrobianos para grampositivos y gramnegativos
 Tubos con 2 mL de solución salina estéril
 Placas de Mueller-Hinton
 Regla para medir los halos de inhibición
 Pinzas para colocar los sensidiscos
 Recipiente de vidrio para desechar RPBI (posteriormente se esteriliza)

Procedimiento:

Preparación de la suspensión bacteriana:

1. Preparar los cultivos de las bacterias en Agar soya tripticasa o en su caso en Agar sangre, estriando
de manera de obtener colonias aisladas e incubarlos 18- 24 horas a 37 ° C.
2. De las colonias aisladas, tocar 1 a 3 y transferirlas a 2 mL de SSF (utilizando el procedimiento de
inoculación de caldos descrita en capítulo 2). Algunos microbiólogos sugieren tocar varias colonias
iguales (y por tanto presuntivamente pertenecientes a la misma especie) ya que permite detectar
posibles variantes resistentes dentro de la especie, que podrían seleccionarse con el tratamiento.
También se puede hacer la suspensión a partir del crecimiento de la cepa en tubo inclinado con AST
ó a partir de un caldo como BHI y en el mismo estandarizar el inóculo con el nefelómetro.
3. Comparar con el estándar 0.5 de McFarland (ajustar si es necesario)

7
 Inoculación de los medios de cultivo:

1. Sumergir el hisopo en el tubo con la suspensión bacteriana y eliminar el exceso presionándolo sobre
la pared interna del tubo por encima del nivel de la suspensión.
2. Inocular la superficie de una placa de agar de Mueller-Hinton con un hisopo pasándolo
uniformemente por toda la superficie en tres direcciones (ver diagrama). Por último, pasar el hisopo
por el reborde de la placa de agar. Dejar secar 5-10 minutos colocando la placa tapada invertida
sobre la mesa de trabajo.
3. Elegir los antimicrobianos cuidando que correspondan a los microorganismos en estudio de acuerdo
a las tablas del CLSI para Grampositivos o para Gramnegativos.
4. Colocar los discos de antibióticos utilizando unas pinzas estériles y apretándolos suavemente sobre la
superficie del agar. Los discos no deben estar a menos de 15 mm del borde de la placa y separados
entre ellos a por lo menos 20 mm de distancia, para que no se superpongan las zonas de inhibición.
5. Incubar las placas en posición invertida a 35-37 °C durante 16 a 18 horas.
6. Medir los diámetros de las zonas de inhibición con una regla o con un escalímetro utilizando luz
reflejada sobre fondo negro o a contraluz.

Interpretación:

Los diámetros de los halos de inhibición, se traducen a las categorías de resistente (R), intermedio
susceptible (I) o susceptible (S), de acuerdo con las tablas del CLSI.

Susceptible (S)
La categoría susceptible implica que una infección debida a esa cepa puede ser tratada con el agente
antimicrobiano, a menos que este contraindicado por alguna otra causa.

Intermedia (I)
La categoría intermedia incluye las cepas que presentan una CMI de agente antimicrobiano
semejante a los niveles que habitualmente se consiguen en sangre y en tejidos y para los cuales la magnitud
de respuesta puede ser inferior a la de las cepas susceptibles. La categoría intermedia implica que pueda
aplicarse clínicamente a sitios corporales donde las drogas se concentran fisiológicamente (Ej. Quinolonas y
-lactámicos en orina) o cuando se puede utilizar una alta dosificación de la droga.

Resistente (R)
Las cepas resistentes NO son inhibidas por las concentraciones habitualmente alcanzables por el
agente cuando se administra en dosis normales, y/o pueden tener CMIs que están dentro de unos valores
donde los mecanismos específicos de resistencia microbiana son probables (Ej. -lactamasas) y su eficacia
clínica no resulta fiable en los tratamientos.
CHM

Reporte:
Cuando se hayan examinado las pruebas de sensibilidad midiendo el diámetro en milímetros de los
halos de inhibición que se formaron, se comparan las medidas con las tablas de antimicrobianos del CLSI
para establecer cuáles son susceptibles, intermedio-susceptibles o resistentes.

8
 Deben siempre reportarse los antimicrobianos con su nombre completo y los resultados en las tres
categorías mencionadas:

SUSCEPTIBLE A:
INTERMEDIO SUSCEPTIBLE A:
RESISTENTE A:

En los unidiscos, los nombres de los antimicrobianos están abreviados, por lo que se debe consultar
el nombre completo en el vial ó en el inserto, por ningún motivo se deben reportar abreviaturas que pueden
conducir al médico a un error en la terapia.
Es aconsejable utilizar unidiscos para tener la libertad de elegir aquellos a los que sea más sensible el
microorganismo en prueba y elegirlos de acuerdo a la ubicación de la infección para que el efecto
antimicrobiano sea más rápido y efectivo (por ejem. Las quinolonas se recomiendan para infecciones
urinarias). Además los unidiscos se aplican en el medio de cultivo en cantidades menores sean de 6 a 8
solamente y se evita la superposición de halos de inhibición lo cual llevaría a interpretaciones erróneas.
Cuando se adquieren unidiscos se deben solicitar de la concentración que corresponda con las tablas de
interpretación de los diámetros.

9
DEJAR
SECAR
5 MIN

10
UROCULTIVO
Objetivos:
 Cuantificar e identificar los microorganismos que puedan ser considerados responsables de procesos
infecciosos importantes en vías urinarias.

Material necesario:
 Frasco estéril de boca ancha
 Muestra de orina de medio chorro
 Portaobjetos y Cubreobjetos
 Tubos estériles 13 x100
 Aceite de inmersión
 Colorantes para Gram

Prueba cuantitativa
 Tubos 16 x 150 con 9 mL (ó tubos de 13x100 con 4.5 mL) de SSF estéril
 Pipetas de vidrio estériles de 1 ó 2 mL (ó Micropipeta de 0.5 -1.0 mL)
 Micropipeta de 20 o de 50 microlitros
 Puntas estériles amarillas y azules
 Asas de nicromo
 Placas de Agar nutritivo (AN) se puede utilizar Agar CLED

Prueba cualitativa
 Agar Sangre (AS)
 Agar salado manitol (MAS)
 Agar EMB
 Agar Sabouraud (SAB)
 Asas de nicromo

Procedimiento:

Examen directo de la muestra

1. Centrifugar 5 mL de orina, decantar el sobrenadante y observar el sedimento en busca de elementos

(leucocitos, eritrocitos, levaduras) que puedan ayudar en el diagnóstico.
2. Realizar una tinción de Gram con una gota del sedimento de orina y observar al microscopio con
objetivo de inmersión, para describir la morfología microbiana.

Prueba cuantitativa

El urocultivo cuantitativo, se puede llevar a cabo por diferentes técnicas:

 Vaciado en placa
 Siembra con asa calibrada
 Siembra por superficie con ángulo de vidrio, previa inoculación con pipeta de vidrio
 Siembra con asa normal previa inoculación con micropipeta.

1. Marcar los tubos con SSF estéril con los números del 1-4
2. Marcar las placas de AN o de CLED como 101, 102, 103 y 104
3. Tomar 1 mL de orina con una pipeta estéril y depositarlo en el tubo con solución salina marcado con
el No. 1

11
 4. Agitar el tubo para homogeneizar totalmente la suspensión, obteniendo de esta forma la dilución
101.
5. Repetir la operación a partir de esta dilución con el tubo No. 2 y así sucesivamente hasta terminar las
4 diluciones.
6. Con una punta estéril depositar 0.05 mL en las (puede inocularse un volumen de 0.020 mL, pero
considerarlo en el cálculo). Cada dilución en el tubo debe coincidir con su respectiva placa, (tubo No.
1 inocular en la placa marcada como 101 etc.).
7. Extender el inóculo de forma homogénea por toda la superficie de la placa utilizando asa esterilizada
hasta sequedad, (otra opción es depositar 0.1 mL con pipeta de vidrio y distribuir sobre la placa con
varilla de vidrio estéril hasta sequedad).
8. Incubar las placas a 37° C durante 24- 48 horas.
9. Elegir para el conteo la placa que muestre un número entre 30 y 300 UFC. Un número menor de
colonias en las placas puede llevar a errores debido a fluctuaciones estadísticas. Un número mayor
de 300 dificulta el conteo.
10. Con los datos obtenidos, calcular el número de UFC iniciales utilizando la siguiente fórmula:

UFC / mL = (No. de colonias) X (Dilución)

Volumen de muestra inoculado (en mL)

Ejemplo: Dilución 103 UFC = 220 X 1000 = 2,200 000

Colonias contadas =220 0.05
Volumen de muestra = 0.05 mL

Nota.- Como la prueba cuantitativa se puede realizar también por vaciado en placa, con micropipetas, con
varilla de vidrio, o por la técnica de asa calibrada, varía en cada caso la forma de hacer los cálculos.

Prueba cualitativa

1.- Inocular las placas de Agar sangre, MacConkey y Agar manitol salado y SAB por la técnica por estrías,
tomando una asada del sedimento para cada placa.
2.- Incubar las placas a 37° C por 24-48 horas.
3.- Si en la prueba cuantitativa el recuento fue significativo se realiza la identificación de los microorganismos
aislados en el método cualitativo.

Reporte.

Un recuento igual o superior a 100 000/ mL de orina determina una bacteriuria significativa. Sin embargo
para cuentas menores de esta cantidad considerar los criterios antes descritos.
Para la identificación de géneros y especies bacterianos, realizar las bioquímicas necesarias. Practicar
antibiograma de acuerdo a las reglas del CLSI.

12
 UROCULTIVO MTRB-CHM

Examen
cuantitativo Microscopía y Cultivo

DILUCIONES INOCULACIÓN OBSERVACIÓN

DE MEDIOS DEL SEDIMENTO
DE
1 2 3 4
10 , 10 , 10 , 10 , AISLAMIENTO

AGAR SANGRE,
AGAR CLED Ó
EMB, MAS Y SAB
FRESCO:
Leucocitos
Inocular 0.050 mL de Incubar 18-24h a 37°C Bacterias
cada dilución y Eritrocitos
extender con asa Tricomonas
Levaduras
Observar
morfología colonial Tinción de Gram
y microscópica del sedimento

Pruebas Bacterias
bioquímicas Levaduras
Incubar 18 – 24 h
a 37°C

• Identificación
Realizar
recuento y hacer • Antibiograma
cálculos para • Reporte
reportar UFC/mL

13
 UROCULTIVO

Nº muestra_____________________________

MICROSCOPíA DE SEDIMENTO MTRB-CH M

Leucocitos________
Eritrocitos_________
Levaduras_________
Tricomonas_________
Anotar Neg, Esc, Mod, Abu

TINCIÓN DE GRAM DEL SEDIMENTO

% APROX
Bacilos Gramnegativos
Cocos Grampositivos
Otro:

Neg, Esc, Mod, Abu

Polimorfonucleares
Levaduras

CUENTA MICROBIANA:__________________________UFC/mL

CULTIVO: CEPA(S) AISLADA(S)

ANTIBIOGRAMA(S)

14
HEMOCULTIVO
Objetivo:

Aislamiento e identificación de microorganismos a partir de muestras de sangre obtenidas y procesadas en

condiciones de asepsia.

Reactivos y Material

 Etanol al 70%
 Solución de iodo al 2%
 Torundas de algodón
 Torniquete
 Jeringa de 10 mL.(dependiendo de la edad del paciente)
 Medio líquido y/o sólido-líquido para hemocultivo (con anticoagulante SPS)
 Medios selectivos para resiembras AS
 Portaobjetos
 Colorantes de Gram
 Incubadora a 37° C
 Cámara de CO2 ó frasco con vela
 Dispositivos para incubación en anaerobiosis (si es posible)

Procedimiento

1. Localizar una vena adecuada para la punción, por medio de palpación después de aplicar el torniquete
(aflojar el torniquete)

2. Limpiar el área cutánea con etanol al 70% comenzando sobre el lugar de la punción y haciendo círculos
concéntricos progresivamente mayores.

3. Aplicar solución de yodo al 2% de la misma manera, permitir que el desinfectante se seque por lo menos
un minuto antes de proceder a la punción.

4. Colocar de nuevo el torniquete y realizar la punción procurando llegar a la vena de forma directa.

5. Extraer la sangre por aspiración y transferir a los frascos de cultivo adecuados a través del tapón estéril del
frasco.

7. Mezclar la sangre con el medio de cultivo (bifásico) para evitar la coagulación.

9. Incubar a 37°C revisar diariamente durante 3 días en busca de señales de crecimiento.

10.-Resembrar cada día en placas de Agar sangre y Agar chocolate e incubar a 37º C en CO 2. Las siguientes
resiembras se realizan a los 7, 14, 21 y 28 días antes de desecharlos como negativos.

11.- Para los cultivos negativos se realiza un reporte semanal hasta el final en la 4ª semana

15
CULTIVO DE EXUDADO FARÍNGEO
Objetivos:
 Distinguir la flora comensal de posibles patógenos del tracto respiratorio superior

Material utilizado:
 Hisopos estériles, abatelenguas, portaobjetos
 Agar sangre de carnero (o AS con Azida de sodio)
 MAS
 MacConkey o EMB
 Agar selectivo para levaduras.(SAB)
 Discos de 0.04 U de Bacitracina
 Pruebas bioquímicas ( de acuerdo a los microorganismos aislados)
 Colorantes de Gram
 Aceite de inmersión
 Mechero Bunsen ó Fisher
 Asas de siembra de puntas redonda y recta
 Incubadora a 35-37°C con atmósfera de CO2 o frasco con vela
 Discos de 10 U de Bacitracina
 Discos con Clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (para la prueba de oxidasas)
 Caldo BHI para coagulasa
 Plasma con EDTA (prueba de coagulasa)
 Peróxido de hidrógeno (para catalasa)
 Bioquímicas MIO, MRVP, CITRATO, LIA
 Frasco para desechos RPBI (esterilizar posteriormente 121ºC 20 min)
 Microscopios

Toma de muestra:

1. Explicar al paciente que debe presentarse en ayunas y sin aseo bucal. En pacientes hospitalizados se
hará la toma cuando sea necesario y se registrarán la hora y condiciones del paciente.
2. El paciente debe inclinar la cabeza hacia atrás, se hace bajar la lengua con el abatelenguas y se le
indica que respire profundamente. Si es posible, iluminar la cavidad oral con una lámpara.
2. Frotar con un hisopo enérgicamente la faringe posterior, las amígdalas, las partes que muestren
inflamación, exudados o ulceraciones. Evitar tocar con el hisopo la lengua, los carrillos o los labios
para evitar la contaminación con flora comensal.
3. En un portaobjetos estéril (o previamente higienizado con alcohol) hacer un frotis en la parte
central. Desechar como RPBI
4. Tomar muestra con otro hisopo y colocarlo en un medio de transporte como el de Stuart o Amies,
para los estudios bacteriológicos.

Examen Microscópico

La tinción de Gram en el exudado faríngeo no se considera de gran utilidad pero puede ser
importante la observación de leucocitos así como de espiroquetas y bacilos fusiformes que se relacionan con
GUNA o con angina de Vincent. En algunos casos también se detectan células y pseudohifas de Candida.

Inoculación:
16
 Iniciar siempre con la placa de agar sangre de carnero, puede hacerse selectivo el medio si se adiciona
SXT (sulfametoxazol y trimetropim), este inhibe en gran medida a la microbiota normal aumentado la
probabilidad de aislar S. pyogenes desde la primera siembra. También se puede utilizar un Agar sangre al que
se le añade 0.02 % de azida de sodio para inhibir la flora comensal.

1. Con el hisopo se descarga la muestra y se estrían la placas de acuerdo con el procedimiento descrito
en el capítulo 2, para obtener colonias aisladas. En la segunda descarga del AS se coloca un disco de
bacitracina 0.04 U para inhibir la flora comensal y aislar Haemophilus influenzae.
2. Incubar el agar sangre en atmósfera de CO2. y los demás en atmósfera normal, todos a 35-37°C. Ver
los diagramas para la identificación de posibles patógenos.

Interpretación de los resultados

Informar los resultados de la tinción de Gram con base a la hoja de resultados de la práctica
En caso de que no desarrollen bacterias patógenas se reporta la flora normal encontrada
Si hay flora patógena informar la cepa identificada y en los casos necesarios deberá practicárseles
antibiograma o en su caso reportar los medicamentos de elección. Por ejemplo en el caso de Streptococcus
pyogenes, el medicamento de elección es la penicilina (para personas alérgicas eritromicina).

CULTIVO DE EXPECTORACIÓN
Objetivo:
 Aislamiento e identificación de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Candida,
Pseudomonas, Klebsiella.
 Distinguir la flora comensal de posibles patógenos del tracto respiratorio inferior

Equipo, material , medios y reactivos :

 Envase estéril de boca ancha (6 cm. aproximadamente) con tapa de rosca.
 Esputo obtenido de expectoración profunda
 Agar sangre de carnero
 Agar chocolate enriquecido
 Agar MacConkey ó EMB
 Agar salado manitol MAS
 Discos de optoquina
 Discos de Bacitracina( 0.04 U)
 Agar selectivo para levaduras.(SAB)
 Colorantes de Gram
 Aceite de inmersión
 Mechero Bunsen ó Fisher
 Incubadora a 35-37°C con atmósfera de CO2 o frasco con vela
 Discos con 10 U de Bacitracina
 Caldo BHI para coagulasa
 Plasma con EDTA (prueba de coagulasa)
 Bioquímicas MIO, MRVP, CITRATO, LIA, TSI
 Discos con Clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (para la prueba de oxidasas)
 Peróxido de hidrógeno (para catalasa)
 Colorantes para Ziehl Neelsen
 Asas de siembra de puntas redonda y recta
 Aplicadores de madera estériles

17
  Frasco para desechos RPBI (esterilizar posteriormente 121ºC 20 min)
 Microscopios
 Incubadora a 35-37 °C
 Incubadora a 35-37°C con atmósfera de CO2 o frasco con vela

Toma de muestra:

El esputo proveniente del árbol bronquial, debe recolectarse de una tos profunda temprano por la
mañana después de que el paciente despierta. La boca debe enjuagarse enérgicamente sólo con agua antes
de recoger la muestra para disminuir los contaminantes orofaríngeos. La espectoración se deposita en un
frasco estéril de boca ancha.
Procedimiento:

Estas muestras se deben trabajar con mucho cuidado cuando se utiliza mechero.

1. Tomar con aplicadores de madera estériles las porciones más purulentas y sanguinolentas de la muestra
y depositar en los medios de cultivo empezando con el Agar Sangre, haciendo la descarga del inóculo
primero y luego estriando para obtener colonias puras.
2. Incubar el Agar Sangre y el Gelosa Chocolate a 37°C por 24 - 48 horas en atmósfera con 5-10 % de CO2. y
los otros medios a la misma temperatura en atmósfera normal.
3. Hacer dos frotis tomando la muestra con los aplicadores de madera estériles teñir uno con Gram y el
otro con Ziehl Neelsen. Una vez terminada la operación, los palillos deben llevarse al frasco con tapón de
rosca para esterilizarse posteriormente.

Examen Microscópico

Con la tinción de Gram, en una espectoración se observa la presencia de levaduras o pseudohifas,

puede evaluarse la calidad y purulencia de las muestras ya que normalmente una espectoración adecuada
contiene más de 20 leucocitos y menos de 10 células por campo 100x (“campo útil”) de lo contrario se
considera una muestra inadecuada ya que está formada por saliva por lo que no es útil para el cultivo o la
baciloscopía.
En el frotis teñido con Ziehl-Neelsen se busca la presencia de de bacilos alcohol-ácido-resistentes
(BAAR) sugerentes de micobacterias. Este procedimiento se le denomina también “Baciloscopía” y la tinción,
la observación microscópica y la forma de reportarse se describen más adelante.

Inoculación:
1. Iniciar siempre con la placa de agar sangre de carnero. Con el hisopo se descarga la muestra y se estrían
la placas de acuerdo con el procedimiento, para obtener colonias aisladas. En la segunda descarga del AS
y del GCH se coloca un disco de bacitracina 0.04 U para inhibir la flora comensal y aislar Haemophilus
influenzae.
2. Incubar el Agar sangre y el Gelosa chocolate en atmósfera de CO2. y los demás en atmósfera normal,
todos a 35-37°C. Ver los diagramas para la identificación de posibles patógenos.

Interpretación de los resultados

Informar los resultados de la tinción de Gram con base a la hoja de resultados de la práctica
En caso de que no desarrollen bacterias patógenas se reporta la flora normal encontrada
Si hay flora patógena informar la cepa identificada y en los casos necesarios deberá practicárseles
antibiograma o en su caso reportar los medicamentos de elección. Por ejemplo en el caso de Streptococcus
pyogenes, el medicamento de elección es la penicilina (para personas alérgicas eritromicina).

18
 IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS PATÓGENAS EN LOS CULTIVOS DE EXUDADO FARINGEO Y ESPUTO

Medio de Morfología colonial Morfología microscópica Pruebas presuntivas de Resultado

cultivo identificación
Solubilidad en bilis +
24-48h α-Hemolíticas Blanco- Sensibilidad a Streptococcus
37°C <0.5mm Ø Cocos Gram+ Pares cadenas cortas optoquina + pneumoniae
grisáceas
10%CO2
β-Hemolíticas
Pares o cadenas cortas Catalasa – Sensibilidad a
Agar <0.5 mm Ø S.pyogenes
bacitracina +
sangre β-Hemolíticas ó no Cocos Gram+
hemolíticas 1-2 mm Ø Aislados o racimos Catalasa + Coagulasa +
S. aureus
Novobiocina R
S.aureus
γ-Hemolíticas Blancas lisas
Cocos Gram – Oxidasa +
Moraxella catarrhalis
DNasa +
Blancas
cremosas Levaduriforme Candida sp
Agar
Gris a
chocolate
blancas,
enriquecido Requiere Factores X y V Haemophilus influenzae
transparentes, Bacilos Gram -
24-48h 37°C granulares o
10%CO2 H.parainfluenzae
mucosas Requiere sólo Factor V

Pseudomonas sp
Lactosa – Incoloras Bacilos Gram – Oxidasa +
ó verdosas No fermenta glucosa
Agar
MacConkey
24h, 37°C
Fermentan Enterobacteriaceae
Lactosa + ó - Rosas ó Bacilos Gram – glucosa
incoloras

Agar manitol Cocos Catalasa + Staphylococcus aureus

sal Manitol + Halo amarillo Gram + Coagulasa +
24h, 37°C
Mycobacterium sp
Tinción Ziehl

19
Bacilos alcohol-ácido resistentes
Neelsen
Fusobacterium y
Bacilos Gramnegativos curvos y Borrelia
Tinción Gram Bacilos gramvariables espirilares
Tinción de Ziehl-Neelsen (Baciloscopía)

Objetivo:
 Aplicar la tinción de ZN para investigar la presencia de las bacterias alcohol ácido resistentes (BAAR) en
muestras de expectoración.
 Discriminar estas bacterias de la flora asociada en un frotis de expectoración positivo.

Material y reactivos
- Muestra de esputo en recipiente de boca ancha con tapa hermética
- Aplicadores de madera estériles
- Portaobjetos Datos
- Lápiz punta de policarbonato
- Lámpara de alcohol
- Colorantes para Ziehl Neelsen
- Frasco para esterilizar desechos
- Mechero bunsen ó Fisher

Procedimiento:

1. En un tercio del portaobjetos anotar el número de muestra con el lápiz de punta de policarbonato.
2. Tomar dos aplicadores de madera y con los extremos seleccionar la partícula útil de la muestra,
constituida por la parte purulenta o más densa de la misma.
NOTA: evitar usar asa metálica porque al flamearla se producen aerosoles (brincan partículas de moco)
que son peligrosos para el operador o sus compañeros.
3. Colocar la muestra sobre el portaobjetos y extender con el aplicador, haciendo presión para que el
extendido quede uniforme, formar un óvalo o rectángulo de aproximadamente 1 cm de ancho por 2 de
largo sin llegar a las orillas del portaobjetos (ver dibujo). Terminado el extendido se desechan los
aplicadores en un frasco con tapón de rosca para luego esterilizar.
4. Dejar secar a temperatura ambiente. Ya secas, fijar con el extendido hacia arriba, pasándolas dos o tres
veces sobre la llama del mechero.
5. Los frotis deben de teñirse de preferencia el mismo día. Para lugares distantes del laboratorio se
recomienda dejar secar el extendido y envolver en papel para su traslado. En el laboratorio debe
retirarse el papel con mucho cuidado, colocarlo dentro de un frasco para luego esterilizarlo.

Tinción de Ziehl Neelsen

Quienes realicen esta tinción deben protegerse con un cubrebocas grueso ya que la exposición prolongada a la emisión
de vapores fenolados puede ser tóxica.

1. Para efectuar la coloración, los frotis se colocan sobre las varillas de vidrio dispuestas en una tarja o sobre una
cubeta o bandeja metálica para coloración, con el extendido hacia arriba y el tercio rotulado con lápiz punta de
policarbonato hacia el operador. Se cubre la superficie del extendido con fucsina fenicada.
2. Con la llama una lámpara de alcohol o de un encendedor largo (regulable) se calienta suavemente (la fucsina
fenicada) por debajo del portaobjetos, hasta que se produzca emisión de vapores blanquecinos y enseguida se
retira la flama; en ningún caso la fucsina debe hervir o secarse sobre la lámina; si ocurre esto último debe
adicionarse más colorante. Cuando deja de observarse la emisión de vapores se vuelve a calentar hasta emisión de
vapores y así sucesivamente. La operación de calentar 4 veces hasta la emisión de vapores toma unos 5 minutos,
que es el tiempo necesario.
3. Dejar enfriar de 30 a 60 segundos.
4. Lavar con agua corriente a baja presión, hasta quitar el exceso de colorante

20
5. Cubrir el extendido con alcohol ácido, se toma la lámina por los bordes del extremo numerado y se efectúa un
suave movimiento de vaivén, de modo que el alcohol ácido vaya decolorando y arrastrando la fucsina. Cuando el
alcohol adquiere una coloración roja se lava con agua y si es necesario se adiciona nuevamente alcohol-ácido y se
lava. Se recomienda limpiar el portaobjetos por su cara inferior con un papel absorbente (impregnado con alcohol),
para eliminar residuos del colorante y de la flama. Se considera decolorado el extendido cuando sus partes más
gruesas no tienen color o sólo conservan un ligero tinte rosado. De acuerdo al grosor del frotis puede ser necesario
adicionar 1 a 4 veces el alcohol ácido hasta observar que ya no se escurre el color rojo.
6. Enseguida se procede a la coloración de contraste cubriendo la superficie del extendido con azul de metileno
durante un minuto.
7. Lavar con agua corriente para eliminar el exceso de azul de metileno.
8. Las láminas ya teñidas se dejan secan al aire colocándolas verticalmente sobre papel absorbente. Evitar hacerlo
sobre la flama del mechero ya que se deteriora la morfología bacteriana y de los leucocitos.

Observación microscópica
1. Se observa con objetivo de 100 X y aceite de inmersión. Se debe seguir una pauta sistemática para la
observación, leyendo de izquierda a derecha, y en “zigzag” sobre el extendido un mínimo de 100 campos
útiles. Se considera campo microscópico útil aquel en el que se observan elementos celulares de origen
bronquial (leucocitos, fibras y/o células ciliadas). Los campos en los que no aparezcan dichos elementos no se
contabilizan, a menos que presenten BAAR, sí se anotan.
2. Cada campo microscópico debe observarse en superficie y con profundidad, utilizando constantemente el
tornillo micrométrico.
3. Los bacilos que aparecen delgados rectos ó ligeramente curvos teñidos de ROJO, aislados, en parejas o en
grupos son BAAR. El resto de las bacterias (flora asociada) los leucocitos y células se observan teñidos de azul,
para este caso no se reportan.
4. Se utiliza una cuadricula con 100 espacios para registrar en cada uno de ellos el número de BAAR encontrados
por cada campo microscópico.
5. Cada 10 campos observados se calcula el promedio de BAAR encontrados para determinar el total de campos
que se deberán revisar (20, 50 ó 100 campos):
a) Si no se encuentran BAAR o hay menos de un BAAR por campo en promedio, se examinan al menos
100 campos microscópicos útiles.
b) Si se encuentran de uno a diez BAAR por campo en promedio, es suficiente la observación de 50
campos.
c) Si se encuentran más de 10 BAAR por campo, basta con la observación de 20 campos.
Nota: Colocar las láminas que se desee conservar, envueltas en papel absorbente para que el aceite se impregne en el
papel y luego archivarlas (nunca frotarlas, pues se deteriora el extendido).

Resultados:

Negativo: No se encuentran BAAR en 100 campos observados.

Positivo (+): Menos de un BAAR por campo en promedio, en 100 campos observados.
Positivo (++): De 1 a 10 BAAR por campo en promedio, en 50 campos observados.
Positivo (+++): Más de 10 BAAR por campo, en 20 campos observados

Nota: Si en una lámina se observan entre 1 y 4 bacilos en 100 campos se recomienda lo siguiente:
- Ampliar la lectura en 200 campos.
- Si no se encuentran más bacilos hacer otro extendido de la misma muestra.
- Si la lectura de este segundo extendido no modifica el resultado anterior, la muestra debe informarse como
negativa, consignar el hallazgo de 1 a 4 BAAR en el libro de registro del laboratorio y solicitar una nueva muestra del
paciente.
- Se recomienda hacer cultivo para Mycobacterium tuberculosis.

LECTURA DE BACILOSCOPÍAS

21
Con muestra de espectoración, realizar un extendido y aplicar la tinción de Ziehl-Neelsen.
Observar al microscopio y anotar los BAAR en la cuadrícula izquierda (un cuadro por cada campo).
En la cuadrícula derecha registrar los resultados de la laminilla positiva que les será proporcionada.

Nº Muestra_______________________ Nº Muestra _______________________

Resultado BAAR_______________________ Resultado BAAR_______________________

EJEMPLOS DE RESULTADOS

0 0 0 2 1 0 2 0 0 0 9 2 7 4 10 1 8 3 6 1
2 0 0 5 1 0 1 0 0 0 3 2 3 5 1 1 5 2 1 2
0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 5 2 1 6 3 2 0 8 10
0 0 2 1 1 1 0 0 0 5 7 4 6 1 2 2 10 1 2 9
4 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 4 5 2 8 1 9 3 3 4
0 0 6 0 2 0 0 2 1 0
0 0 0 0 0 0 1 0 0 0
2 0 2 0 1 1 0 0 1 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 1 0 0 0 0 0 3 1 0
Resultado BAAR positivo + Resultado: BAAR positivo ( ++ )

Con base en los dos ejemplos anteriores y aplicando las reglas del número de campos necesarios a observar
en cada caso: Anotar en la parte inferior la respuesta

21 26 25 29 20 53 18 50 24 13 1 6 2 9 0 3 1 5 2 3
45 16 20 26 31 26 25 58 32 34 4 1 0 6 3 2 5 5 2 4

Hasta cuántos campos se deben contar

Resultado BAAR____________________
en esta muestra?_______________

22
 CULTIVO DE EXUDADO FARÍNGEO
Nombre del alumno ó paciente__________________________________________________________

TINCION DE GRAM % APROX

Cocos Gram Positivos
Cocos Gram Negativos
Bacilos Gramnegativos
Bacilos Grampositivos
Bacilos morfotipo Bacteroides
Bacilos morfotipo Borrelia*
Bacilos morfotipo Fusobacterium*
*Se asocian en la GUNA (Gingivitis Ulcerante Necrosante Aguda y en Angina de Vincet)

Neg, Esc, Mod, Abu

Polimorfonucleares
Levaduras

RESULTADO DE CULTIVO: CEPA(S) AISLADA(S)

Streptococcus sp. alfa hemolíticos (flora normal)
Neisseria sp. (Flora normal)
Streptococcus sp. Beta hemolítico negativo al grupo A (flora normal)

Streptococcus sp. Beta hemolítico positivo al grupo A

Staphylococcus aureus
Pseudomonas sp.
Klebsiella pneumoniae
Candida sp.

ANTIBIOGRAMA(S) (SE REALIZARÁ EN OTRA PRÁCTICA)

23
 CULTIVO DE EXPECTORACIÓN

Nombre del alumno ó paciente__________________________________________________________

TINCION DE GRAM % APROX

Cocos Gram Positivos
Cocos Gram Negativos
Bacilos Gramnegativos
Bacilos Grampositivos
Bacilos morfotipo Bacteroides
Bacilos morfotipo Borrelia*
Bacilos morfotipo Fusobacterium*
*Se asocian en la GUNA (Gingivitis Ulcerante Necrosante Aguda y en Angina de Vincet)

Neg, Esc, Mod, Abu

Polimorfonucleares
Levaduras

Tincion de Ziehl Neelsen:

BAAR________________________
Bacilos morfotipo Nocardia (parcialmente BAAR)__________________

RESULTADO DE CULTIVO: CEPA(S) AISLADA(S)

Streptococcus sp. alfa hemolíticos (flora normal)
Neisseria sp. (Flora normal)
Streptococcus sp. Beta hemolítico negativo al grupo A (flora normal)

Flora patógena investigada

Streptococcus sp. Beta hemolítico positivo al grupo A
Streptococcus pneumoniae

Staphylococcus aureus
Pseudomonas sp.
Klebsiella pneumoniae
Candida sp.

RESULTADO DE CULTIVO: CEPA(S) AISLADA(S)

ANTIBIOGRAMA(S) (SE REALIZARÁ EN OTRA PRÁCTICA)

24
CULTIVO DE EXUDADO VAGINAL Y URETRAL
CARACTERÍSTICAS DIAGNÓSTICAS DE LAS ENFERMEDADES VAGINALES
VAGINA VULVOVAGINITIS
TRICOMONIASIS VAGINOSIS
NORMAL POR Candida
Trichomonas
Flora microbiana Lactobacillus sp Candida sp. Gardnerella vaginalis
vaginalis
Irritación, prurito Leucorrea profusa y Flujo maloliente y
Síntomas Ninguna
vulvar, leucorrea maloliente, prurito profuso
Amarillento, viscoso ó Claro o gris, recubre la
Exudado vaginal Claro Blanco
espumoso mucosa
Inflamación del
Eritema de la mucosa
introito vaginal o No Eritema e inflamación No
vaginal
vulvar
pH del exudado < 4.5 < 4.5 > 4.5 > 4.5
Prueba de KOH
(+) (olor a No No Frecuentemente Casi siempre
aminas)
Células clave,
Células
Leucocitos, células abundantes bacilos
Examen epiteliales y Leucocitos,
epiteliales, Levaduras, cortos gramvariables
microscópico predominio de Trichomonas
Pseudomicelios escasos leucocitos con
Lactobacillus
o sin Lactobacillus
Modificado de: Perea, 1992 por MC M. T. Reyes Blanco
Objetivo
Aislar e identificar los microorganismos responsables de infecciones del tracto genital, mediante la
utilización de técnicas microscópicas de diagnóstico, medios enriquecidos, selectivos y diferenciales, así
como el uso de pruebas bioquímicas aplicables.

Material y reactivos:
 Muestra de exudado cervicovaginal o de exudado uretral
 Placa con medio de gelosa sangre de carnero y/o sangre humana, AS
 Placa con medio EMB
 Placa con agar manitol salado MAS
 Placa con agar Sabouraud SAB
 SSF
 Solución de KOH al 10%
 Peróxido para catalasa
 Tubos con medios para bioquímicas de enterobacterias (TSI; LIA, MIO, MRVP, FAD, UREA,CIT) en caso
demuestras con Neisseria son necesarios tubos CTA (Agar cistina-tripticasa) con lactosa, con maltosa
con glucosa con Sacarosa
 Reactivo para oxidasa
 Tubo con BHI para coagulasa
 Plasma de conejo
 Agar bilis esculina
 Caldo hipurato
 Cepa de Staphylococcus aureus beta hemolítica para prueba de CAMP

25
Procedimiento:

Es importante instruir a la paciente para que haga un aseo normal de genitales externos y evitar la aplicación
de algún tipo de tratamiento, local o sistémico, así como evitar el lavado vaginal y abstenerse de tener relaciones por lo
menos tres días antes de tomarle la muestra.
La toma de la muestra se realiza directamente de la lesión, como úlceras, chancros, vesículas. En los casos de
cervicitis, blenorragia crónica, abscesos en las glándulas anexas, etc. se toma de las secreciones.
La paciente se coloca en posición ginecológica, se introduce en la vagina un espejo vaginal estéril, puede ser
lubricando con agua estéril, evitando el uso de lubricantes del tipo vaselina o algún antiséptico. Se localiza el cuello
uterino y con un hisopo estéril se toma la muestra del cérvix y del fondo del saco. El hisopo de algodón o rayón tratado
con carbón para absorber el material tóxico es preferible a los hisopos comunes ya que estos últimos son más tóxicos
para el virus del herpes, los gonococos y Chlamydia, también pueden utilizarse hisopos de alginato de calcio sobre todo
para exudados uretrales ya que son muy delgados y permiten hacer mejor la toma de muestra. Se toman 3 hisopos para
hacer frotis directo para teñir por la técnica de Gram, otro pasa a un tubo con solución salina estéril para efectuar el
examen en fresco, (preparación en fresco, ó preparación húmeda) en donde se buscarán leucocitos, eritrocitos,
tricomonas y levaduras ; la tercera muestra se coloca en medio de transporte de Stuart o Amies para posteriormente
hacer la siembra directa. Si se desea investigar la presencia de Chlamydia y Mycoplasma se toman una muestra del
cérvix rotando el hisopo para colectar células epiteliales, se hará un frotis para el estudio de inmunofluorescencia y otra
muestra se coloca en el medio especial de transporte que contiene una solución amortiguadora. En mujeres sin
actividad sexual, se utiliza un hisopo delgado a través del orificio himenal.

1. Colocar una gota de muestra en SSF, entre un portaobjeto y un cubreobjetos para la “preparación en fresco” ó
“preparación húmeda”. En las muestras vaginales se observa el número de leucocitos, y la presencia de
Trichomonas. Para exudados uretrales sólo se observa el número de leucocitos ya que los hombres son portadores
asintomáticos de tricomonas. Sólo que el médico lo solicite se reportan.
2. Una preparación húmeda con solución de KOH ayuda a observar mejor la presencia de levaduras aunque se
observan bien en la preparación con SSF.
3. Teñir con Gram un frotis y observar al microscopio para determinar el % aproximado de los tipos de bacterias que
se observen. El frotis directo con Gram dará idea de los diferentes “morfotipos bacterianos” y el criterio de
diagnóstico para la vaginosis bacteriana (morfotipos de Gardnerella o Mobiluncus y “células clave”), así como la
observación de diplococos Gramnegativos intracelulares característicos de la gonorrea. El informe de la presencia
de Lactobacillus (bacilo Döederlein) también es importante.
4. Sembrar en los medios de cultivo (ver diagrama) e incubar a 37ºC por 48h; las placas de Thayer-Martin y de Agar
sangre (Gardnerella desarrolla mejor en Agar sangre humana) se incuban con CO2.
Observar la morfología colonial y la morfología microscópica con Gram, realizar las bioquímicas suficientes para
identificar la flora aislada, de acuerdo a la metodología del grupo microbiano que corresponda y determinar la
1,3,6,9,10,18
sensibilidad a los antibióticos, cuando sea necesario.

Resultados:
1.-En la preparación en fresco, contar los elementos encontrados en diez campos reportándolos en promedio o cruces
utilizando la hoja para reporte.
2.- En la tinción de Gram observar cuidadosamente en busca de: polimorfonucleares con diplococos intracelulares,
diplococos extracelulares, “células clave” y diferentes microorganismos presentes, reportando el porcentaje de cada
uno de ellos. En los exudados vaginales es importante reportar si se observa la flora normal que debe haber,
Lactobacillus.
3.- En los cultivos, registrar la morfología colonial, realizarle Gram para describir la morfología microscópica, realizar y
reportar las pruebas bioquímicas, identificar la flora aislada de acuerdo a los diagramas correspondientes y practicar
sensibilidad antimicrobiana a los patógenos aislados.

26
 EXUDADO VAGINAL Y URETRAL

EXAMEN EN
CULTIVO FRESCO

VAGINITIS O VAGINOSIS
Secreción del cervix y URETRITIS
fondo del saco anterior y Conducto uretral
posterior de vagina
IF
GRAM inmuno
fluorescencia
SSF NaOH
INOCULAR estéril al 10%
Chlamydia
trachomatis

Muestra en medio de  Levaduras

SIEMBRA DIRECTA  Hongos
transporte de Stuart
(óptima)
(sembrar antes de 12 h)
 Leucocitos
 Eritrocitos
 Trichomonas
 Células epiteliales

 Agar sangre
CO2, 24-48 h
 Thayer-Martin  Morfología colonial
 Morfología microscópica
 Sabouraud  Pruebas bioquímicas
 MAS OPCIONAL  Identificación

27
 MacConkey  Antibiograma
 EXUDADO VAGINAL Y URETRAL (CONT.)

Medio de cultivo Colonias Tinción al GRAM Pruebas bioquímicas Microorganismo

Oxidasa (+)

Medio CTA con:

Blanco-grisáceas Glucosa (+)
Diplococos Gram (-) Neisseria gonorrhoeae
De 0.5-1 mm diam. Fructosa (-)
Agar Thayer Maltosa (-)
Martin Lactosa (-)
Sacarosa(-)

Blanco-amarillentas Cocos Gram (+) Coagulasa (+)

0.5-2 mm diámetro Agrupados en racimos Novobiocina(S) Staphylococcus aureus
 ;  ó no hemolíticas

-hemolíticas Hidrólisis del Hipurato(-) Lactobacillus

Bacilos Gram (+)
< 0.5 mm de diámetro (Flora normal)

 ó -hemolíticas Bacilos cortos Gram (+)

Hidrólisis del Hipurato(+) Gardnerella vaginalis
< 0.5 mm de diámetro o Gram (-)

Blanco-grisáceas, Bacilos Gram (-) Pruebas bioquímicas para Enterobacteriaceae

cremosas o mucosas enterobacterias
1-3 mm diámetro

Grises ó verdosas Bacilos Gram (-) Oxidasa positiva Pseudomonas

Agar Sangre 1-2 mm diámetro No fermentan glucosa

-hemolíticas
Cocos Gram(+) Hidrólisis de Esculina (+) Enterococcus
≤ 0.5 mm de diametro

Hidrólisis de Esculina (-)

28
-hemolíticas Streptococcus agalactiae
Cocos Gram(+) Hidrólisis del Hipurato(+)
≤0.5 mm de diametro
Prueba de CAMP (+)
 CULTIVO DE EXUDADO VAGINAL O URETRAL

Nº de muestra________________________

Cultivo de exudado:  VAGINAL  URETRAL

PREPARACIÓN HÚMEDA SSF

Trichomonas / campo  Negativo

Leucocitos / campo  Negativo
Eritrocitos / campo  Negativo

PREPARACIÓN HÚMEDA KOH 10%

Levaduras / campo

TINCIÓN DE GRAM
% APROX
Bacilos morfotipo Lactobacillus (Bac. de Döderlein)
Bacilos morfotipo Gardnerella
Bacilos morfotipo Mobiluncus
Diplococos gramnegativos
Intracelulares  SI  NO
Cocos Grampositivos
Bacilos Gramnegativos

Neg, Esc, Mod, Abu

Polimorfonucleares
Levaduras

CULTIVO: CEPA(S) AISLADA(S)

ANTIBIOGRAMA(S) (

29
CULTIVO DE HERIDAS O ABSCESOS

Objetivos:
 Aislamiento e identificación de microorganismos más comunes causantes de infecciones en
heridas o abscesos: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa,
Enterobacterias, Candida etc.

Material utilizado:
 Hisopos estériles, abatelenguas, portaobjetos
 AS (agar sangre de carnero); MAS; MacConkey ó EMB; Agar para levaduras.(SAB)
 Colorantes de Gram
 Aceite de inmersión
 Mechero Bunsen ó Fisher
 Asas de siembra de puntas redonda y recta
 Incubadora a 35-37°C con atmósfera de CO2 o frasco con vela
 Discos de 10 U de Bacitracina (A)
 Discos con Novobiocina (NB)
 Discos con Clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (para la prueba de oxidasas)
 Caldo BHI para coagulasa
 Plasma con EDTA (prueba de coagulasa)
 Peróxido de hidrógeno (para catalasa)
 Bioquímicas para enterobacterias MIO, MRVP, CITRATO, LIA,UREA,FAD,TSI
 Agar bilis esculina
 Frasco para desechos RPBI (esterilizar posteriormente 121ºC 20 min)
 Microscopios binoculares

Toma de muestra:

1. Con una gasa estéril retirar el material purulento tratando de dejar libre de pus el tejido infectado.
2. Con un hisopo estéril frotar la lesión y hacer un extendido en un portaobjetos estéril.
3. Tomar más muestra con otro hispo y colocarlo en medio de Stuart, mantener a temperatura
ambiente en tanto se siembran las placas.
Nota: cuando la lesión corresponde a un absceso se recomienda que el médico obtenga la muestra
por punción y dentro de la jeringa se conserva la secreción para sr enviada al laboratorio para su
cultivo.

Inoculación:

1. Iniciar siempre con la placa de agar sangre de carnero. Con el hisopo se descarga la muestra y se
estrían las placas de acuerdo con el procedimiento descrito en el capítulo 2, para obtener colonias
aisladas.
2. Incubar a 37ºC por 24-48h.

Resultados:

1. Teñir con Gram el frotis y observar al microscopio para determinar el % aproximado de los tipos de
bacterias que se encuentren. 1.-En la tinción de Gram observar cuidadosamente en busca de:
polimorfonucleares Registrar la presencia de leucocitos PMN y diferentes microorganismos
presentes, reportando el porcentaje de cada uno de ellos, reportar si se encuentran levaduras
(Candida). Esta tinción de Gram dará idea de los tipos de bacterias presentes y de los “morfotipos

30
 bacterianos” que corresponden a anaerobios como Bacteroides y Fusobacterium, ya que estos no
crecerán en los cultivos aerobios.
2. En los cultivos, registrar la morfología colonial, realizarle Gram para describir la morfología
microscópica, realizar y reportar las pruebas bioquímicas, identificar la flora aislada de acuerdo a los
diagramas correspondientes y practicar sensibilidad antimicrobiana a los patógenos aislados.

Interpretación de los resultados

Informar los resultados de la tinción de Gram con base a la hoja de resultados de la práctica
Si hay flora patógena informar la(s) cepa(s) identificada(s) y en los casos necesarios deberá practicárseles
antibiograma o en su caso reportar los medicamentos de elección. Por ejemplo en el caso de Streptococcus
pyogenes, el medicamento de elección es la penicilina (para personas alérgicas eritromicina).

31
 CULTIVO DE HERIDAS Y ABSCESOS
HISOPADO DIRECTO,EN
MEDIO DE TRANSPORTE

AGAR SANGRE MACCONKEY Ó EMB AGAR MANITOL SALADO AGAR SABORAUD

24 h 35-37 °C 24 h 35 - 37 °C 48-72 h 25 -37 °C
24h. 35-37°C

Colonias Colonias lisas,

Colonias 0.5 a 1 Colonias <0.5 a fermentadoras Colonias no Colonias Colonias circulares, blancas
mm de diam. 1 mm de diam. de lactosa fermentadoras amarillo blancas y el con borde micelial
 ó -hemolíticas doradas medio vira a ligero.
 hemolíticas
rodeadas de rojo
halo amarillo

Cocos grampositivos aislados o en

cadenas , catalasa negativa Bacilos gramnegativos

Cocos grampositivos Tubos germinales agar

agrupados en racimos, suero 35°C,
Hidroliza la catalasa positivos , oxidasa clamidosporas: agar
esculina Susceptibl a CAMP Oxidasa Oxidasa harina de m.
bacitracina negativos positivos negativos.
positivo

Enterococcus
Coagulasa Coagulasa
positiva negativa Candida albicans
S. pyogenes S. agalactiae

32
ENTEROBACTERIAS Pseudomonas
(otros BGNNF) S. aureus S. epidermidis
S. saprophyticus