Práctica II: Identificación de enterobacterias por perfil IMViC

Objetivos:
1. Observar y aislar bacterias de la biota intestinal mediante un coprocultivo.
2. Comprender el algoritmo para diferenciar especies de enterobacterias.
En un sentido amplio, las enterobacterias forman parte de la biota intestinal,
razón por la cuál poseen ese nombre. Además, se incluyeron a este grupo con el
tiempo más bacterias tanto patógenas como de la biota de algunos insectos al
poseer propiedades bioquímicas semejantes. Durante muchos años, el grupo de
las enterobacterias estuvo clasificado como una sola familia en donde se
incluyeron a una gran cantidad de bacilos gramnegativos con estas características
similares. De acuerdo a la sistemática de Bergey, a estas les correspondía el
taxón llamado Enterobacteriaceae. Sin embargo, con el desarrollo de herramientas
moleculares y el surgimiento de la filogenética, muchas enterobacterias han sido
reorganizadas en nuevos taxones, quedando agrupadas en el clado superior del
orden Enterobacterales donde se encuentran no solo la familia antes mencionada,
sino algunas recientemente descritas. Mucho tiempo, la clasificación de las
enterobacterias fue tema de debate que no tuvo solución sino hasta 2021 cuando
el nuevo modelo de clasificación del orden Enterobacterales llegó por parte de
Janda y Abbott. En la Tabla 1 podemos observar la reclasificación de las
enterobacterias más frecuentes según su nueva propuesta.
Tabla 1. Clasificación de los principales géneros de enterobacterias de importancia clínica de
acuerdo a la nueva propuesta. Traducido y adaptado de Janda & Abbott, 2021.
Familia Enterobacteriaceae Erwiniaceae Hafniaceae Morganellaceae Yersiniaceae
- Citrobacter
- Cronobacter
- Enterobacter
- Morganella - Ewingella
- Escherichia - Erwinia - Edwardsiella
Géneros - Klebsiella - Proteus - Serratia
- Pantoea - Hafnia
- Providencia - Yersinia
- Kluyvera
- Salmonella
- Shigella

Gammaproteobacteria incertae sedis: Plesiomonas.

Podemos generalizar con muy pocas excepciones que las enterobacterias

más comúnmente aisladas de muestras clínicas cumplen con las siguientes
características: Son bacilos gramnegativos de 1 a 6 µm que no forman esporas y
su metabolismo es anaerobio facultativo. Otras características metabólicas de las
enterobacterias son que, naturalmente, todas pueden fermentar la glucosa así
como también reducir nitratos a nitritos y producir catalasa mas no oxidasa. Esto
último es un detalle a destacar de las enterobacterias, pues (siendo la única
excepción Plesiomonas shigelloides, cuya clasificación sigue siendo incierta) nos
permite distinguirlas de otro grupo de bacilos gramnegativos no fermentadores. La
naturaleza antigénica de las enterobacterias es muy similar en todas las
integrantes del grupo y se ejemplifica en la Figura 1.

Figura 1. Estructura antigénica de las enterobacterias. Tomado de Murray et al., 2021.

El estudio de las enterobacterias es relativamente sencillo, pues se

desarrollan y aíslan con facilidad en medios selectivos y diferenciales diseñados
para este fin, como el caso de los agares MacConkey o Eosina-Azul de metileno
(EMB). Ambos medios poseen en su formulación colorantes que actúan inhibiendo
el desarrollo de bacterias grampositivas, a su vez que contienen lactosa para
poder distinguir a las bacterias capaces de fermentarla. Además, el medio EMB
posee también sacarosa como componente para distinguir principalmente a
Escherichia y Yersinia, las principales fermentadoras de sacarosa.
El estudio completo de los coprocultivos incluye a los medios
Salmonella-Shigella (SS) y Verde Brillante (VB) que en su composición incluyen
sales biliares capaces de inhibir también a gran parte de las enterobacterias. En
dicha fórmula se incluyen otros agentes diferenciales basados en la capacidad de
Salmonella para producir sulfuro de hidrógeno en el caso del agar SS, mientras
que el agar VB es altamente selectivo para Salmonella, siendo capaz de inhibir a
la gran mayoría de otras enterobacterias de manera parcial o total.
 Existen una amplia variedad de perfiles y criterios perfectamente descritos
para distinguir a las enterobacterias según sus propiedades. La gran mayoría han
sido reemplazados por sistemas automatizados capaces de realizar la
identificación de forma breve y altamente sensible, como los sistemas fenotípicos
o incluso la espectrometría de masas como el MALDI-TOF, así como las nuevas
herramientas de biología molecular. Estas herramientas, debido a su elevado
costo tanto de adquisición como de mantenimiento, son utilizados por centros de
salud donde la cantidad de muestras requiere resultados de forma breve, donde el
único tiempo de espera sería el de aislado que varía de 24 a 48 horas, mientras
que otras pruebas más sencillas, como los perfiles IMViC que se mencionan en
esta práctica, toman además un segundo tiempo de incubación por lo que una
identificación presuntiva se alcanza hasta mínimo 72 horas.
El perfil IMViC implica el uso de cuatro criterios en tres medios distintos
donde se ponen a prueba las siguientes capacidades de la enterobacteria a
identificar:
- Hidrólisis de triptófano a indol mediante una enzima triptofanasa.
- Producción de ácidos orgánicos a partir de carbohidratos mediante la vía
fermentativa de ácidos mixtos.
- Producción de acetoína como intermediario de la ruta de fermentación
butanodiólica de los carbohidratos.
- Uso del citrato como única fuente posible de carbono.
Estos cuatro criterios se hacen mediante las pruebas de indol (I), rojo metilo
(M), Voges-Proskauer (V) y citrato (C), lo que forma el acrónimo con el que se
nombra al conjunto o batería de pruebas, las cuales se realizan con medios en
tubo de ensayo de 13x100 como se detalla a continuación.
Para determinar si una bacteria es capaz de hidrolizar el triptófano, se hace
crecer en un medio con peptona o caseína. Existen caldos de peptona específicos
para este medio, pero también hay medios semisólidos con peptona donde,
además de evaluar la producción de indol, se pueden observar otras pruebas,
añadiendo criterios adicionales para facilitar la identificación. Un ejemplo es el
medio de movilidad-indol-ornitina (MIO) donde, además de la prueba de indol, se
puede observar si la bacteria es móvil y capaz de descarboxilar la ornitina,
ayudado por púrpura de bromocresol, un indicador de pH en el medio que virará a
violeta intenso en presencia del compuesto alcalino producto de la
descarboxilación de la ornitina. Otro medio sólido para evaluar la producción de
indol más otras pruebas es el medio sulfato-indol-movilidad (SIM) donde, en lugar
de evaluar la descarboxilación de un aminoácido, se observa si la bacteria es
capaz de reducir el sulfato a sulfuro, lo cuál desemboca en la reacción con hierro
del medio formando un precipitado negro.
En cualquiera de los medios arriba mencionados, se puede poner en
manifiesto la producción de indol con dos métodos fundamentados en reacciones
semejantes. Ya sea mediante la reacción de Kovacs o de Ehrlich, el principal
reactivo es el p-dimetil amino benzaldehído que, en medio ácido, reacciona con el
anillo pirrólico del indol formando un compuesto rojo a violeta. La reacción que
ocurre se muestra en la Figura 2 y es completamente espontánea, por lo que no
hay necesidad de calentar el medio.
Las enterobacterias, al tener metabolismo anaerobio facultativo, pueden
fermentar los carbohidratos por distintas rutas. Las pruebas de rojo metilo y
Voges-Proskauer (VP) detectan productos de fermentación generados por
distintas vías, por lo que permiten discriminar entre bacterias capaces de
fermentar por la vía de ácidos mixtos con la prueba rojo de metilo, o bien por la vía
butanodiólica con la prueba Voges-Proskauer. Ambas se realizan en el mismo
medio por lo que puede hacerse crecer a la cepa en un solo tubo con caldo de
peptona y dextrosa y separarlo para hacer las dos pruebas después de incubar.
Al igual que la prueba de indol, estas dos son espontáneas y no requieren
calor adicional. Cuando el medio es lo suficientemente ácido, al añadir el rojo de
metilo inmediatamente virará de amarillo a rojo intenso si el pH del medio está por
debajo de 4.5. Por otra parte, la prueba VP detecta acetoína en solución alcalina,
por lo que requiere hacerse por separado. Si se hace por el método de Barritt, es
necesario primero añadir el reactivo de α-naftol al 5% y luego alcalinizar el medio
con KOH al 40%. En presencia de acetoína, ocurre una condensación en cadena
que genera un color rojo a rosado según la reacción demostrada en la Figura 3.
Por lo general, las enterobacterias no realizan varias vías fermentativas de forma
simultánea, por lo que estas pruebas son mutuamente excluyentes.

Figura 2. Reacción del anillo pirrólico con el p-dimetil amino benzaldehído en la prueba de
Kovacs o Ehrlich. Tomado de MacFaddin., 2004.

Figura 3. Reacción de la acetoína con los reactivos de Barritt en la prueba VP. Tomado de
MacFaddin., 2004.
 Por último, la prueba de citrato se realiza en el medio de Simmons en forma
de pico de flauta, el cual contiene azul de bromotimol como indicador de pH para
poner en manifiesto la capacidad de las bacterias para utilizar este ácido orgánico
como única fuente energética y se observa con el vire del indicador de verde a
azul al alcalinizarse el medio. A grandes rasgos, todo esto implica lo mínimo
necesario para distinguir a la mayoría de las enterobacterias entre sí.
El perfil puede ampliarse mediante más medios y pruebas como los caldos
de nitrato, los medios de Stuart o Christensen para urea o los medios lisina hierro
(LIA) o triple azúcar y hierro (TSI) que permiten evaluar varios parámetros de
forma simultánea. En la Tabla 2 se resumen los resultados esperados para el
perfil IMViC de las enterobacterias más frecuentemente aisladas en muestras
clínicas.
Tabla 2. Principales criterios para la identificación de enterobacterias por perfil IMViC.
Microorganismo Indol Movilidad Rojo metilo VP Citrato
Citrobacter freundii Neg Pos Pos Neg Pos
Enterobacter cloacae Neg Pos Neg Pos Pos
Escherichia coli Pos Pos Pos Neg Neg
Klebsiella pneumoniae Neg Neg Neg Pos Pos
Salmonella enterica Neg Pos Pos Neg Pos
Shigella dysenteriae Neg* Neg Pos Neg Neg
Hafnia alvei Neg Pos Neg* Pos Neg
Morganella morganii Pos Pos Pos Neg Neg
Proteus mirabilis Pos Pos Pos Pos* Pos*
Providencia rettgeri Pos Pos Pos Neg Pos
Serratia marcescens Neg Pos Neg* Pos Pos
Yersinia enterocolitica Pos* Neg1 Pos Neg1 Neg
Plesiomonas shigelloides Neg Pos Pos Neg Neg
Pos: Positivo >90%. Neg: Negativo >90%. Pos*: 50-90% positivo. Neg*: 50-90% negativo. Neg1:
Negativo cuando se incuba a 37 °C, positivo cuando se incuba a 25 °C. Rosa: Fermentador de
lactosa. Azul: Oxidasa positivo. VP: Voges-Proskauer.

Material:
Proporcionado por la escuela:
- Mechero de gas tipo Bunsen, dos por equipo.
- Asa bacteriológica de nicromel con filamento en argolla, cuatro por equipo.
- Asa bacteriológica de nicromel con filamento recto, dos por equipo.
- Pinzas de disección sin diente de ratón, rectas o tipo Kelly, dos por equipo.
- Placas Petri con medio agar MacConkey, dos por equipo.
- Placas Petri con medio agar Eosina-Azul de metileno, dos por equipo.
- Tubos de ensayo 13x100 con medio caldo peptonado, dos por equipo.
- Tubos de ensayo 13x100 con medio agar citrato Simmons, dos por equipo.
- Tubos de ensayo 13x100 con medio agar movilidad-indol-ornitina, dos por
equipo.
- Sensidiscos de tetrametil-p-fenilendiamina para prueba de oxidasa, dos por
equipo.
 - Batería para tinción de Gram que contenga: cristal violeta, yodo lugol,
alcohol-acetona, safranina, aceite de inmersión tipo A y portaobjetos de
vidrio, uno por equipo.
- Batería para interpretación de perfil IMViC que contenga: KOH 40%,
reactivo de Voges-Proskauer (ɑ-naftol 5% en etanol), reactivo de Kovacs o
reactivo de Ehrlich (p-dimetilaminobenzaldehído 5% en alcohol ácido) y rojo
metilo 0.04% en etanol-agua 2:3.
- Gradilla para tubos de ensayo, una por equipo.
- Papel filtro tipo Whatman.
Proporcionado por cada equipo alumnos:
- Bata blanca de manga larga en buen estado, individual.
- Guantes de látex o nitrilo.
- Cubrebocas tricapa.
- Agua oxigenada comercial con 3% de peróxido de hidrógeno.
- Vasos de unicel desechables.
- Cinta adhesiva tipo “masking”.
- Encendedor de gas o cerillos.
- Hipoclorito de sodio comercial al 5%.
- Etanol desnaturalizado al 70%.
- Toallas desinfectantes a base de sales de amonio cuaternario o, en su
defecto, desinfectante líquido a base de sales de amonio cuaternario más
un trapo de algodón que no suelte residuos.
- Muestra de materia fecal fresca acompañada del formato de consentimiento
informado firmado por el paciente o su tutor/representante legal con copia
adjunta de identificación oficial.
Equipo de laboratorio:
- Incubadora microbiológica.
- Microscopio de luz blanca.
- Cuenta colonias.
- Autoclave.
Desarrollo experimental:
Primer día:
1. Tome la muestra de la materia fecal, principalmente donde observe sangre
o moco. En condiciones de esterilidad, abra el frasco y, con el asa
previamente flameada, tome una porción de la muestra e inocúlela
PRIMERO en el medio MacConkey y después en el medio EMB.
2. Diluya su muestra realizando estría cruzada, recordando flamear y enfriar
entre cada estría.
 3. Incube a 37 °C durante 24-48 horas hasta observar colonias aisladas de
buen crecimiento (mayor a 1 mm de diámetro).

Segundo día:

4. Describa la morfología colonial de una o dos colonias aisladas.

5. De las colonias seleccionadas, confirme la reacción de catalasa y oxidasa.
6. Confirme también morfología microscópica utilizando tinción de Gram.
7. Para sembrar el medio MIO o SIM, tome el asa recta, esterilice, enfríe y
tome parte de la colonia. Posteriormente, tome el tubo con su mano no
dominante, quite el tapón de algodón con uno o dos dedos de su mano
dominante y pase la boca del tubo por la llama. Inocule picando profundo el
agar al centro del tubo sin llegar hasta el fondo.
8. Para sembrar el caldo peptonado, tome el asa bacteriológica, esterilice,
enfríe y tome parte de la colonia. Posteriormente, tome el tubo con su mano
no dominante, quite el tapón de algodón con uno o dos dedos de su mano
dominante y pase la boca del tubo por la llama. Proceda inclinando el tubo y
coloque su inóculo en la pared del mismo a una altura que el medio lo toque
cuando vuelva a su posición recta.
9. Para sembrar el medio Simmons, tome el asa bacteriológica, esterilice,
enfríe y tome parte de la colonia. Posteriormente, tome el tubo con su mano
no dominante, quite el tapón de algodón con uno o dos dedos de su mano
dominante y pase la boca del tubo por la llama. Proceda a inocular el tubo
por una sola estría abierta.
10. Sujete sus tubos debidamente rotulados con una liga, de preferencia un
juego por cada cepa inoculada. Incube de 24 a 48 horas a 37 °C.

Tercer día:

11. Para interpretar la prueba de indol, destape el tubo de medio MIO/SIM y

agregue dos gotas del reactivo directamente sobre la superficie del medio.
No es necesario hacerlo en condiciones de esterilidad.
12. Para interpretar las pruebas de rojo metilo y VP, coloque la mitad del caldo
con crecimiento en un segundo tubo limpio. Para la prueba de rojo metilo,
agregue dos gotas del indicador al medio y agite ligeramente.
13. En el segundo tubo, para la prueba VP, añada PRIMERO dos gotas del
reactivo α-naftol y después dos gotas de KOH 10%.
14. Analice sus resultados y concluya.