UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICAS

CARRERA DE BIOQUÍMICA
FISICOQUÍMICA

LABORATORIO 11: CINETICA ENZIMATICA

1. OBJETIVO(S)

 Realizar el perfil de pH del enzima _____.

 Determinar espectrofotométricamente la actividad enzimática de ______
 Determinar el modo de inhibición de una azida sobre la enzima _______.

2. FUNDAMENTO TEORICO

La espectrofotometría es el estudio de la interacción de la radiación electromagnética con moléculas, átomos

e iones. Cuando un haz de energía radiante monocromática (luz con una longitud de onda definida) incide
sobre una sustancia, parte de la energía es absorbida y el resto transmitida. La mayoría de los compuestos
tienen una o varias longitudes de onda características a las que absorben la luz. Así, una solución puede
contener muchos compuestos que absorben a diferentes longitudes de onda, sin embargo, si el compuesto de
interés absorbe a una determinada longitud, es posible determinar su concentración aún en mezcla. La ley de
Lambert-Beer expresa la relación entre la transmitancia y la concentración de una sustancia, la transmitancia
disminuye en progresión geométrica cuando la concentración aumenta en progresión aritmética.

La enzima lo que afecta en la reacción química, no es la cantidad de energía de reactivos y de productos, ni

la constante de equilibrio, lo que disminuye es la energía de activación.

La actividad enzimática se define como la cantidad de producto catalizado por una enzima en una reacción
específica por unidad de tiempo, generalmente se mide moles de producto generado por cada minuto
(Unidad de actividad enzimática)
=
Actividad relativa:
= =
min
Actividad específica:
= = = ∕ ∕
( )
Durante la purificación enzimática, la fracción que tenga la mayor actividad específica será la fracción con
mayor pureza.

Modelo estacionario de Michaleis –Menten

⎯⎯⎯ [ ]
+ ⎯⎯ + =
⎯⎯⎯ +[ ]
Lineweaver-Burk
1 1 1
= +
[ ]
 UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICAS
CARRERA DE BIOQUÍMICA
FISICOQUÍMICA

Inhibición enzimática, Los inhibidores, disminuyen la actividad enzimática, se tienen varias maneras en las que
logran inhibir, se tienen inhibidores irreversibles y reversibles (competitivo, no competitivo, mixto, acompetitivo,
etc)

Los principales factores que afectan la actividad enzimática son la temperatura y pH.

3. PROCEDIMIENTO

Descargar la aplicación/programa: EnzLab:

https://download.cnet.com/EnzLab-for-Windows-32-bit/3000-2054_4-76136182.html

Grupo 1: Proteasa, aislada de la P. aeruginosa (80 kDa)

Grupo 2: Deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa (140 kDa)
Grupo 3: Hidratasa, fumarato hidratasa (200 kDa)
Grupo 4: Descarboxilasa, Ornitina descarboxilasa de Saccharomyces cerevisiae (105 kDa)
Grupo 5: Fosfatasa, fosfatasa acida (100 kDa)

Inhibidor: Azida

Análisis de la actividad enzimática.

Enzima: ___________
Concentración = ________ mg/mL
Actividad específica = _______ mol/min/mg de enzima

Perfil de pH

Volumen de análisis: __________ L

Concentración de sustrato: ______ mM

pH 4 5 6 7 8 9 10
vo/mol min–1

Graficar pH (x) vs velocidad inicial (y). Analizar a que pH el enzima tiene su máxima actividad y explicar porque.

Determinación kM, vmax, kcat, eficiencia catalítica y actividad específica del enzima ________

pH: ____
Volumen de análisis: __________ L

S/mM
vo/mol min–1

Con los datos obtenidos:

 Por regresión lineal determinar vmax, kM, kcat, eficiencia catalítica y actividad específica del enzima.
 UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICAS
CARRERA DE BIOQUÍMICA
FISICOQUÍMICA

Determinación del tipo de inhibidor de la azida sobre el enzima.

pH: ____
Volumen de análisis: __________ L

I= ___ mM
S/mM
vo/mol min–1

I= ___ mM
S/mM
vo/mol min–1

Con los datos obtenidos:

 Graficar: cinética de Michaelis-Menten (vo vs S), modificada de Lineweaver-Burk (1/vo vs 1/S). En
ausencia y presencia del inhibidor.
 Identificar qué tipo de inhibidor es la azida con su respectivo kI.

4. CUESTIONARIO

i. Definir: enzima, actividad enzimática, inhibidor, kI.

ii. Definir las características químicas – físicas y sus propiedades de inhibición enzimática de las azidas
de sodio.
iii. Realice un esquema para aislar y purificar un enzima
iv. Cuantas clases de enzimas existen, como se las clasifica y que características tienen.
v. Características de cada tipo de inhibidor, y sus ejemplos en bioquímica.
vi. Como afecta a la actividad enzimática: a) concentración de sustrato, b) concentración de enzima, c)
temperatura, pH.