Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán

Departamento de Ciencias Biológicas Sección
de Ciencias de la Salud Humana Licenciatura
en Bioquímica Diagnóstica Clave de la carrera:
105-39

Cuaderno de
Trabajo
Laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos de Sistemas
Clave de la asignatura: 1849
Grupo: 2851 No. de Equipo: 11 Semestre: 2022-2 .

Integrantes del equipo: Andón García David

Mendoza Morales Miguel Ángel
Santillán Maldonado Nadia Iyari

Autores:

QFB. Ma.de Lourdes Galván Ruiz

M. en C. Gloria Leticia Arellano Martínez
QFB. Beatriz L. González Maldonado QFB.
Maricruz Reyes Aguayo
M en C. Luis A. Gordillo Reséndiz
Dra. Betsabé Rodríguez Pérez
M. en C. Heidi J. Amezcua Hempel
Abril, 2022
 Cuaderno de
Trabajo
PRACTICA No. 5 “INTRODUCCIÓN A LA ENZIMOLOGÍA CLÍNICA

INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA:

A. Definir: isoenzima, coenzima y cofactor.

Isoenzima:Son formas moleculares diferentes de una enzima que comparten

una actividad catalítica común (Market y Moller,1959). Es decir, se trata de
moléculas diferentes que catalizan la misma reacción bioquímica.

Coenzima: Molécula orgánica, frecuentemente derivada de las vitaminas, que se

una a una molécula proteica (apoenzima) para formar una enzima activa
(holoenzima).

Cofactor: Molécula pequeña necesaria para la actividad de muchas enzimas.

Son iones metálicos o moléculas orgánicas que participan con las enzimas en la
realización de la actividad enzimática.

B. Indicar el fundamento de la determinación de isoenzimas por

electroforesis en gel de agarosa.

La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y

caracterizar ácidos nucleicos o proteínas de distintas procedencias. Los geles se
comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en
función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño van a
emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Además, si en
dicha electroforesis se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de
DNA de tamaño conocido) se puede calcular el tamaño aproximado del DNA en
estudio.

La electroforesis es el único método que permite detectar todas las formas

moleculares de la L-lactato deshidrogenasa. Se han utilizado diversos soportes
como el gel de agarosa. El tipo de soporte afecta la resolución de las isoenzimas
se efectúa, sobre el soporte en el que se ha realizado la electroforesis, una
reacción específica con L- lactato y NAD. El NADH formado puede cuantificarse
por espectrometría de fluorescencia en fase sólida.

C. Definir la unidad Kat (Katal) e indicar por qué no es común emplear

como unidad de reporte de la actividad enzimática.

Katal. Es la unidad de medida de la actividad catalítica, derivada del Sistema

Internacional de Unidades.Un katal se define como la actividad catalítica
responsable de la transformación de un mol de compuesto por segundo.

Kat= mol/s

D. Realizar un cuadro comparativo de los factores que afectan la actividad

enzimática, considerando al paciente, la muestra y el método de
determinación.

Paciente Temperatura, pH, enzima y concentración de

sustrato.

Muestra Concentración de sustrato y enzima, tiempo de

 Cuaderno de
Trabajo
uso, luz, toma de muestra correcta y
temperatura.

Método de determinación Temperatura, luz, tiempo de uso, concentración

de sustrato y enzima.

E. Realizar en el cuaderno de trabajo el diagrama de flujo (ver apéndice A)

con todos los pasos a seguir en esta práctica.
 Cuaderno de
Trabajo
RESULTADOS
1.- Identificación de las moléculas que dan la absorbancia

De acuerdo con los insertos correspondientes a cada enzima, determina la molécula que da la
absorbancia en cada reacción.

Enzima Molécula que da la absorbancia

(Inserto de Spinreact)
LDH NADH
AST NADH
ALT NADH
ALP p-Nitrofenol
Lipasa Metilresorufina

2.- La gamma-glutamil transferasa (GGT) cataliza la transferencia de un grupo γ-glutamilo de la

γ-glutamil-p-nitroanilida al dipéptido aceptor glicilglicina, según la siguiente reacción:

La velocidad de formación del ácido 5-amino-2-nitrobenzoico, determinado fotometricamente, es

proporcional a la concentración catalítica de GGT en la muestra ensayada.

Con los datos mostrados a continuación, calcule el coeficiente de absortividad molar (ε) de la molécula
que produce la absorbancia.

Con los datos obtenidos anteriormente, recalcule el factor utilizando los siguientes volúmenes:

Finalmente calcule la actividad enzimática en unidad internacional (UI/L) y katal (Kat/L) de la γ-glutamil
transferasa, utilizando las siguientes absorbancias y el factor que recalculaste.
 Cuaderno de
Trabajo

Cálculos de ΔAbs/min

(|4|−|3|)+(|3|−|2|)+(|2|−|1|) (0.602−0.593)+(0.593−0.581)+(0.581−0.568)
Δ ¿ = Δ ¿ =
|| ||
¿ =0.01
min 3 min min 3 min

Cálculos de obtención de factores

VT 1.2 mL+ 0.11mL

Factor (umol / L)= Factor (umol / L)= =1288.44
( ε )(LP)(VS) −3 −1 −1
( 9.243 x 1 0 L/c m umol )(1 cm)(0.11 mL)

Cálculos del coeficiente de absortividad molar

VT 1 mL +0.1 mL −3 −1 −1
ε= ε= =9.243 x 1 0 L/c m umol
(Factor )(LP)( VS) (1190)(1 cm)(0.1 mL)

Cálculos de actividad enzimática

UI /L= Δ ¿ ( Factor )¿ 0,0113 Δ ¿ (1288.444 umol/ L)=14.559 ≈ 15UI / L¿

|| ||
min min

UI 1 Kat 6
Kat / L=( )( ) ( 15UI )( 1 Kat )=2.7 x 10−7 Kat /L( 1 x 1 0 uKat )=0.27 uKat
L 60 x 1 0 UI
6
L 60 x 1 06 UI 1 Katal L

ANÁLISIS DE RESULTADOS

La enzimología clínica es la aplicación del conocimiento de las enzimas humanas en el diagnóstico,

tratamiento y pronóstico de la enfermedad.
Las enzimas se pueden utilizar para el diagnóstico de enfermedades porque son marcadoras de
enfermedades o disfunciones, por sus características- propiedades.
Cada órgano o fluido en el cuerpo tiene una cantidad determinada de enzimas intracelulares, cuando
hay daño o muerte celular, esto se traduce en un cambio en los niveles de cantidad de enzima y,
como consecuencia se producirá una alteración de la actividad enzimática, por lo que, midiendo este
cambio en la cantidad de enzima mediante diferentes procedimientos, podemos deducir que el
individuo se encuentra en un estado patológico. Por tanto, es de vital importancia la caracterización de
las enzimas. Es importante resaltar que las decisiones diagnósticas se deben tomar integrando la
historia clínica los estudios de laboratorio, y para el presente tema el perfil enzimático PE.
A continuación se muestra una tabla de la distribución de las enzimas con valor clínico según el
órgano.
 Cuaderno de
Trabajo

Tabla de enzimas y su importancia clínica. Obetinda de

https://editorial.unam.edu.ar/images/documentos_digitales/e34_Enzimologa_clnica.pdf

Los líquidos biológicos que se usan con más frecuencia a la hora de determinar actividades
enzimáticas son: * Suero (es la muestra más frecuente) * Plasma (obtenida con heparina) * Orina *
Líquidos serosos (Peritoneal, Pleural y Pericárdico) * Líquido cefalorraquídeo * Líquido sinovial.

La acción de las enzimas es muy necesaria para los organismos vivos y no vivos (virus) ya que las
reacciones sin catalizar son lentas y las posibilidades que tienen una molécula de cambiar en un
ambiente estable como es el medio biológico son muy bajas sin embargo, la actividad de una enzima
también llega a ser regulada por varios factores que si llegaran a experimentar cambios que aunque
sean mínimos podrían dirigir a un fallo en la función de la enzima y por lo tanto detener su actividad.

Cambios en la Temperatura pueden provocar modificaciones en la estructura molecular de la enzima y

por lo tanto hacer que pierda su función, la disminución o aumento del pH puede cambiar el estado
ionizado de alguno de sus cofactores y provocar que estos no se unan a la enzima provocando la
pérdida de actividad. La concentración disminuida del sustrato o la enzima dificulta la unión enzima-
sustrato y por lo tanto la reacción biológica funcional se volvería lenta e incluso inexistente. Otros
factores pre-analiticos como analiticos que pueden afectar en la determinación de la actividad
enzimática o que pueden generar falsos positivos/negativos son una toma de muestra incorrecta que
al hemolizar la sangre se provoca la liberación de enzimas y por lo tanto una determinación
aumentada de actividad enzimática, una errónea longitud de onda de lectura en el espectrofotómetro
no nos brinda evidencia exacta de la cantidad de enzima que hay en la muestra.
 Cuaderno de
Trabajo
El ΔAbs/min nos demuestra la forma en que una enzima se une a su sustrato y promueve la reacción
que generara un producto específico con respecto al tiempo.
En nuestro caso, la GGT tuvo una ΔAbs/min = 0.0113 y al multiplicarla por el factor obtenido se
determinó la actividad enzimática de 15 UI/L o 0.27 uKat/L que son las unidades solicitadas por la IUB
(Unión Internacional de Bioquímica), IFCC (Federación Internacional de Química Clínica) y la IUPAC
(Unión Internacional de Química Pura y Aplicada) para reportar la actividad enzimática. Ambas
unidades (UI y Kat) no solo indican la actividad enzimática de la enzima en cuestión sino que al mismo
tiempo reflejan la concentración de la enzima en el medio analizado. La ΔAbs/min se obtiene a raíz de
realizar varias lecturas de absorbancia en un espectrofotómetro (durante cierta cantidad de minutos)
ya sea de productos generados o reactivos utilizados por la enzima en una reacción a una longitud de
onda específica que es determinada después de hacer una curva de calibración donde se estima a
qué longitud de onda en nm absorbe una mayor cantidad de fotones nuestra molécula en cuestión, si
la longitud de onda utilizada es la incorrecta puede llegarse a la conclusión errónea de que hay menos
enzima de la que en realidad hay en el medio.

La obtención del factor para estimar las UI/L se logra considerando el coeficiente de absortividad
molecular (ε ) de la molécula analizada, el volumen total del sistema y de la muestra utilizada así como
el ancho de la celda de lectura del espectrofotómetro. El coeficiente de absortividad molecular nos
indica la capacidad que tiene para absorber fotones a determinada longitud de onda una molécula
específica (a mayor ε , mayor absorbancia). Ambos (factor y ε ) dependen totalmente del volumen de la
muestra utilizada y del volumen total de los sistemas por lo que cambios en dichos volúmenes obligan
al analista a recalcular únicamente el factor (siempre y cuando no se modifique la longitud de onda de
lectura y la molécula a analizar) ya que si no se recalcula, existirán variaciones en los resultados que
conlleva a diagnósticos erróneos.

CONCLUSIONES:

Como futuros licenciados en bioquímica Diagnóstica es importante conocer el papel que juegan las
enzimas en el cuerpo humano y a partir de que líquidos biológicos se pueden cuantificar.
Es fundamental la determinación de los perfiles enzimáticos en los laboratorios clínicos pues estos nos
dirán si existe alguna alteración cuantitativa en las enzimas, el órgano que puede estar afectado y nos
acercará a descubrir el origen etiológico de dicha alteración para que posteriormente se pueda
administrar un tratamiento eficiente al paciente.

REFERENCIAS CONSULTADAS

● Dufour, D.R., Lott, J.A., Henry, J.B. (2010) Enzimología clínica. En Henry, J.B.Laboratorio en el
diagnóstico clínico. Madrid: Marbán Libros.
● EcuRed. (s. f.). Cofactor - EcuRed. Recuperado 4 de abril de 2022, de https://www.ecured.cu/Cofactor
● Padilla C, Diez J, Martínez G, Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y
caracterización electrofoética de DNA plasmídico
https://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-mol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS
%20ACS%20NUCLEICOS%20GELES%20AGAROSA.pdf
● Gonzáles F. Caracterización mediante isoenzima. INEA.
http://fernando.gonzalez.unileon.es/Libro/catorce.pdf
● Montalvo, C. A. & Lugo M. A. (2016).ELECTROFORESIS: FUNDAMENTOS,AVANCES Y
APLICACIONES.EPISTEMUS.