DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y PARÁMETROS DE LA ECUACIÓN DE

MICHAELIS-MENTEN (Vmax y Km)

DETERMINATION OF ENZYMATIC ACTIVITY AND PARAMETERS OF THE MICHAELIS-
MENTEN EQUATION (Vmax and Km)
Sara Ávila1, José Herazo1, Angie Lopez1, Julieth Suarez1

RESUMEN
Las propiedades catalíticas de las enzimas generalmente son evaluadas por medición y análisis de velocidades
de reacción. Sin embargo, analizando el curso de tiempo completo puede ser ventajoso porque contiene
información adicional sobre las propiedades de las enzimas. Con el objetivo de determinar las propiedades
enzimáticas, es necesario usar modelos como lo son los de Michaelis-Menten, que nos permiten calcular la
velocidad intrínseca de reacción. Para la elaboración de esta experiencia en el laboratorio de biotecnología de la
universidad de córdoba se determinó la actividad enzimática de la maltodextrina, en diferentes concentraciones
y posteriormente se llevó a un birreactor a un pH de 3.04; obteniéndose así las concentraciones y los parámetros
del modelo experimental de Michaelis y Menten.
.
Palabras clave: Ecuación de Michaelis-Menten, análisis de cinética enzimática, biorreactor, enzima
Glucoamilasa (GA).

1. INTRODUCCIÓN y teórica (Michaelis et al 1913; Chaudhury et al

La caracterización de las enzimas de acuerdo con
los detalles de sus parámetros cinéticos es crucial
para diversos campos de investigación, incluida la
bioquímica, la biotecnología, la farmaceutica y la
medicina (Murphy et al 2002). Las actividades
enzimáticas se caracterizan típicamente en términos
de tasas iniciales que se determinan a diversas
concentraciones de sustrato. Sin embargo, los
análisis de las curvas de progreso completas a lo
largo del tiempo pueden ser ventajosos, porque los
cursos de tiempo contienen información adicional
relacionada con las propiedades de la enzima. El
punto importante sobre el monitoreo del progreso de
una reacción de esta manera es que en cualquier
experimento individual, los datos cinéticos se
pueden obtener no solo en las concentraciones
iniciales del sustrato, sino también en cada
concentración entre este valor y aquel al final de la
reacción (Duggleby 2001; Goliˇcnik 2011). Debido
a los importantes roles la dinámica de la enzima se
investiga exhaustivamente de manera experimental
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2008).
Leonor Michaelis y Maud Menten en 1913,
revolucionaron la comprensión de la comunidad
científica de la cinética enzimática con la
publicación de su famoso artículo Die Kinetik der
Invertinwirkung. La importancia de su trabajo
condujo al inicio de una de las ecuaciones
matemáticas más importantes en la bioquímica a la
cual se le atribuye la ecuación de Michaelis-
Menten (Ecu. 1).
Vmax [S]
v= (Ecu. 1)
Km+[ S]
Esencialmente, la ecuación relaciona la velocidad
inicial de formación del producto (v) con la
concentración del sustrato [S], a través de dos
parámetros cinéticos:, La velocidad máxima de
reacción (Vmax) para una concentración enzimática
dada y la constante de Michaelis-Menten (Km) que
es la concentración de sustrato a la cual la velocidad
de reacción es la mitad del máximo. Viktor Henri en
1902 menciono que la cinética típica de Michaelis-
Menten puede explicarse y derivarse mediante el
mecanismo de reacción (esquema 1), el cual se basa
en la ley de acción de masas asumiendo condiciones
de estado casi estacionario, y describe la actividad
catalítica para grandes conjuntos de moléculas
enzimáticas mediante el uso de la ecuación
diferencial ordinaria (Hui & Yong 2019; M. Yi &
Q. Liu 2010)
K1 K2
E + S ↔ ES → E + P
K-1
Esquema 1. Un modelo cinético típico de Michaelis-Menten
en el que E es la enzima, S es el sustrato, ES es el complejo
enzima-sustrato y P es el producto. k1 es la constante de
velocidad de asociación, mientras que k-1 y k2 son constantes
de velocidad de disociación de ES a E + S y de ES a E + P,
respectivamente. Relativo a la ecuación. (1), Km = (k1 + k2) /
k-1 y Vmax = k2 [E] T donde [E] T es la concentración total
de enzimas activas.
Cabe mencionar que a menudo podemos tener
fácilmente condiciones metabólicas de estado
estacionario en las células. El éxito del enfoque
clásico de Michaelis Menten se debe en parte al
hecho de que la mayoría de las reacciones
enzimáticas se investigan in vitro, en un tubo de
ensayo de una solución acuosa donde es diluida la
enzima. Por lo tanto, la ecuación de velocidad es
Tabla 1. Detalles de sustratos y microorganismos utilizados para la producción de glucoamilasa
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una descripción confiable de la actividad enzimatica
(M. Yi & Q. Liu 2010).
La enzima Glucoamilasa (GA) son utilizan
ampliamente en las industrias de alimentos y
bebidas, para la producción de jarabe de glucosa,
jarabe de maíz con alto contenido de fructosa,
cerveza, salsa de soja, bebidas alcohólicas, etc. Es
producida principalmente por especies fúngicas
entre las cuales Aspergillus niger, Aspergillus
awamori y Rhizopus oryzae son las más utilizadas
por la industria. Sin embargo, existen otros
microrganismo por la que se puede obtener dicha
enzima (Tabla 1). La producción de enzimas por
mohos es generalmente extracelular, lo que hace
que su procesamiento posterior sea rentable y
menos lento. Como cualquier otra producción de
enzimas, GA también depende de la selección de
cepa microbiana, sustrato, medio y fermentación
proceso y en parámetros fisicoquímicos como
tiempo de incubación, temperatura, pH, humedad
relativa [en fermentación en estado sólido (SSF)],
inhibidores, accesibilidad al oxígeno, etc. La
producción puede llevarse a cabo mediante
fermentación sumergida (SmF) o SSF dependiendo
sobre el cultivo microbiano y el sustrato en uso
(Negi et al 2017).
Nota: SmF, fermentación sumergida; SSF, fermentación en estado sólido.
Fuente: Negi et al 2017

Por lo anterior, el objetivo del presente laboratorio
es medir la acividad enzimática de una glucoamilasa
fúngica (A. niger) y los parámetros de Michaelis-
Menten (Vmax y Km) en diferentes condiciones de
reacción (Concentraciones de sustrato, Velocidad de
agitación y temperatura).
2. MATERIALES Y METODOS
Se contó con soluciones de maltosa a diferentes
concentraciones (1%, 2%, 3%,4%, 5%, 6%, 7% y
8%) en biorreactores de 500 ml, Con un pH optimo
y velocidades de agitación, para posteriormente
realizar una dilución en agua destilada de la enzima
glucoamilasa fúngica (a. niger) a (densidad 1,2
gr/ml). Se adicionó 1 ml de solución enzimática en
cada biorreactor agitado continuamente, teniendo en
cuenta las condiciones ambientales de cada trabajo.
Se tomó 1 ml de muestra en los siguientes tiempos:
0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, y 70 minutos de
biorreacción. Se inactivó la enzima en agua
hirviendo (100ºC) por un tiempo de 5 minutos, y
posterior choque térmico en baño de hielo.
Finalmente, se determinó la concentración de
glucosa en cada muestra utilizando la técnica del
DNS.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Modelo matemático de Langmuir
A partir de los datos experimentales que se obtuvieron de la actividad enzimática de GA para las ocho
concentraciones, encontramos que el modelo de Lineweaver-Burk es el que representa mejor dicha
actividad como se puede observar en la figura (1). Dicho modelo con un coeficiente de correlación de
R²= 0,3688 nos proporciono los parámetros cinéticos importantes como Km (20400,33) y
Vmax(0,02283314). Cabe resaltar que el coeficiente de correlación obtenido a partir de los datos
experimentales no es muy significativo, una razón puede ser por la variabilidad presentada al tomar los
datos, errores experimentales que ocasionaron la presencia de datos distantes al resto.

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 1.60E+07
1.40E+07
1.20E+07

1/r (µmol/ml*min)
1.00E+07 f(x) = 43.7961439448441 x + 893453.440806277
8.00E+06 R² = 0.368766801647027
6.00E+06
4.00E+06
2.00E+06
0.00E+00
0 50000 100000 150000 200000 250000

1/S (mol/l)

Figura 1. Modelo de Lineweaver-Burk

3.2 Actividad enzimática de la glucoamilasa fúngica (a. Niger)

En la tabla (2) se resume la actividad enzimática de la glucoamilasa fúngica (A. Niger) expresada en U.I
(cantidad de la enzima que produce 1 mol de glucosa/minuto) y en AGU (1 AGU es la cantidad de enzima
que fragmenta 1 mol de maltosa/minuto) utilizada durante el experimento.

Tabla 2. Actividad enzimática de la glucoamilasa fúngica (A. Niger)

Enzima Peso molecular 76000 g/mol
Densidad (g/ml) 1.2
Cantidad (ml) 0.5
Cantidad (g) 0.6
Cantidad (mol) 7.89473684210E-6
Cantidad ( μmol) 7.8947368420999994854
Cantidad(moles/200ml) 3.94736842E-8
Recambio mol de glucosa/mol 34,55
enzima*min

3.3 Formación de producto en función del tiempo ([P] vs [t]) y calcular las velocidades iniciales para
cada concentración de sustrato.

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 3.4 Velocidades iniciales en función de cada concentración de sustrato ([Vel.] vs [S]).

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 Velocidad inicial vs concentración
8
7
6

Velocidad inicial
5
4
3
2
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Concentración

3.5 Parámetros de Michaelis-Menten (Vmax y Km) utilizando los métodos de Limeweaver-Burk, Eadie-
Hofstee y Langmuir

Langmuir
1.4
f(x) = 64.0746068424462 x − 1.08908610520668
1.2 R² = 0.852681379086036
1
0.8 Series2
S/r

0.6 Linear (Series2)

0.4
0.2
0
0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045
S

Vm= 0,0156
Km=-0,01698

4. CONCLUSIÓN

Se concluye que la velocidad de una reacción enzimática es variable, por lo tanto, es directamente
proporcional a la concentración de la enzima Como se evidencia en la figura (velocidades iniciales VS
concentración), lo cual concuerda con lo estipulado por Michaelis-Menten que mencionan la velocidad
de la reacción (representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la concentración sustrato
[S]. por lo tanto, a mayor [E] se incremente la velocidad, esto es aceptable dependiendo de la cantidad
de sustrato suministrada.
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 Los parámetros de Michaelis-Menten (Vmax y Km) que fueron calculados utilizando los métodos de
Limeweaver-Burk, Eadie-Hofstee y Langmuir fueron Vm= 0,0156 ( velocidad máxima de reacción de
1.36 mol de glucosa convertida / ml.) y Km=-0,01698 eso evidencia que la constante de Michaelis-
Menten (Km) que es la concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es la mitad del
máximo es bastante baja por ende demuestra que la enzima que posee mayor afinidad con el sustrato.

5. BIBLIOGRAFÍA
Duggleby, R. G. (2001). Quantitative Analysis of the Time Courses of Enzyme-Catalyzed Reactions. Methods,
24(2), 168–174. doi:10.1006/meth.2001.1177
Goličnik, M. (2011). Evaluation of enzyme kinetic parameters using explicit analytic approximations to the
solution of the Michaelis–Menten equation. Biochemical Engineering Journal, 53(2), 234–238.
doi:10.1016/j.bej.2010.10.012
Lujan, D. y Salcedo, J. (2004). Manual de laboratorio para Biotecnología Alimentaria. Universidad de Córdoba,
Montería, pg 43-47.
L. Michaelis, M.L. Menten, Biochem. Z. 49 (1913) 333
Murphy, E. F., Gilmour, S. G., & Crabbe, M. J. C. (2002). Effective experimental design: enzyme kinetics in the
bioinformatics era. Drug Discovery Today, 7(20), s187–s191. doi:10.1016/s1359-6446(02)02384-x 

Negi, S., & Vibha, K. (2017). Amylolytic Enzymes. Current Developments in Biotechnology and
Bioengineering, 25–46. doi:10.1016/b978-0-444-63662-1.00002-6
S. Chaudhury, D Chatterjee, B.J. Cherayil, J. Chem. Phys 129 (2008) 075104
Yi, M., & Liu, Q. (2010). Michaelis–Menten mechanism for single-enzyme and multi-enzyme system under
stochastic noise and spatial diffusion. Physica A: Statistical Mechanics and Its Applications, 389(18), 3791–
3803. doi:10.1016/j.physa.2010.05.041
Wen Hui Leow, J., & Chun Yong Chan, E. (2019). Atypical Michaelis-Menten kinetics in cytochrome P450
enzymes: a focus on substrate inhibition. Biochemical Pharmacology. doi:10.1016/j.bcp.2019.08.017

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