Laboratorio de microbiología

Identificación de microorganismos

Integrantes:

Edinson Cabrera Meneses 66419083

Camilo Romero Oñate 66418523

Docente: Claudia Liliana Buitrago Yomayusa

Universidad de Boyacá

Programa-Medicina

Tunja
 2021

Objetivo general

Se realizará un trabajo relacionado con el cultivo de microorganismos no obstante emplear la teoría y

procedimientos científicos para poder aprender técnicas, instrumentos y procedimientos para el
estudio de la misma, comprobar el grado de contaminación y de factores adversos para el estudio
profundización del cultivo o muestra correspondiente.

Objetivos específicos
1. Comprender la importancia de la identificación de los microorganismos infecciosos desde el
agente etiológico hasta su respectivo tratamiento con el fin de la asignación de cada especie a
un aislamiento microbiano.
2. Identificar de los microorganismos el género y especie por medio del crecimiento de cultivo.
3. Definir por medio de la prueba de antibiograma cómo reaccionan y cuales son resistentes y
sensibles en los diferentes antibióticos frente a la bacteria.
Introducción
La identificación de los microorganismos es un proceso de gran importancia para una colección de
cultivos microbianos. Es uno de los requisitos esenciales para que una cepa sea ingresada oficialmente a
una colección y, a su vez, permite direccionar la búsqueda de una aplicación al microorganismo
identificado. Los métodos de identificación se pueden dividir en dos grupos: fenotípicos y genotípicos,
teniendo presente que el fenotipo corresponde a las características que se visualizan en un organismo
como morfología, requerimientos nutricionales o el comportamiento frente a alguna molécula, en tanto
que el genotipo es la información hereditaria completa de un organismo codificado en su ADN. En este
informe utilizaremos los métodos de identificación fenotípicos los cuales nos permiten, usualmente,
identificar aislados microbianos hasta nivel de género y, en algunos casos, hasta nivel de especie en
función del número de observaciones macro y microscópicas.

Para la identificación de las principales características de las colonias bacterianas se utilizara la técnica
de siembra por agotamiento donde se espera obtener a partir de un elevado número de bacterias, un
número reducido de ellas distribuidas individualmente a lo largo de la superficie de la placa de petri. y
cada una de las bacterias originará una colonia.

Posteriormente se realizará la técnica de tinción de gram, lo que nos permitirá diferenciar una bacteria
gram negativa de una gram positiva, de modo que las bacterias gram positivas se tiñen de color violeta y
las gram negativas se tiñen de color rosa o rojo. Mediante las pruebas metabólicas para la identificación
de bacterias gram negativas se conocerá el tipo de género. De modo que podríamos identificar también
el agente etiológico responsable del proceso infeccioso y las implicaciones patogénicas y patológicas.
Para posteriormente poder identificar el antibiótico adecuado para tratar dicha patología, esto mediante
un cultivo masivo donde se podría determinar la sensibilidad de los microorganismos a los antibióticos,
o si es resistente a ciertos antibióticos.
Descripción gráfica y paso a paso del procedimiento

1. Elegir de manera aleatoria una caja de petri con colonias de microorganismos.

2. Se realiza una siembra en el portaobjetos con la ayuda de una asa.

3. Se procede a hacer una tinción de gram con cristal violeta,lugol,alcohol y fucsina.

4. Con ayuda del microscopio se observa la afinidad y la morfología .

 5. Como resultado se obtuvieron bacilos Gram negativos.

6. Vamos a seguir con el uso de pruebas bioquímicas para poder identificar el microorganismo.
7. Luego de incubar por 24 horas aproximadamente las pruebas bioquímicas se va a continuar con
la lectura de reacciones para identificar el microorganismo.
8. Se interpretan los resultados
9. Se continua con un descarte selectivo mediante una tabla de identificación.

10.Finalmente se identifica el microorganismo:Klebsiella rhinoscleromatis

11.Se realiza una siembra masiva para poder identificar la susceptibilidad y resistencia de los
antibióticos.
 Resultados identificación de microorganismos

Técnica de siembra por agotamiento en estría.

Tras el periodo de incubación se observa las colonias presentes en la superficie de la caja de

petri, donde se puede identificar su tamaño (entre 1 a 2 mm), su forma ( circular), su

Tinción de gram.
A partir de la siembra de los microorganismos se procedió a teñir las colonias y mediante el
microscopio se pudo observar una coloración rosa la cual nos indica que son bacterias gram
negativas.
Pruebas metabólicas para la identificación de microorganismos gramnegativos
Citrato

El indicador de pH es el azul de bromotimol el cual en presencia de alcalinidad cambia de color

verde a azul indicando que la prueba es positiva. Cuando no hay cambio de color ni crecimiento
se dice que la pueba es negativa como se muestra en la imagen.
Agar triple azúcar-hierro (TSI)

En este agar donde se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos para
fermentar los hidratos de carbono, el resultado de esta prueba nos indica que el
microorganismo no es fermentador de carbohidratos.
Agar lissina dexcarboxilasa (LIA)

El resultado de esta prueba nos indica que este microorganismo obtuvo una producción de HS2
debido al ennegrecimiento del medio.
Rojo de metilo

En esta prueba que es utilizado para determinar por cuál de las

vías metabólicas la bacteria fermenta la glucosa, VÍA ÁCIDA MIXTA o VÍA BUTILEN GLICOL
ICA, la cual indica como resultado negativo debido a la aparicion de un color amarillo como se
muestra en la imagen.

Agar motilidad, indol, ornitina

En este agar que está diseñado para determinar la movilidad de las bacterias y la capacidad
que tienen para descarboxilar la ornitina y de producir indol, se puede observar que el resultado
obtenido evidencia un anillo rojo en la superficie del medio el cual indica que la prueba es
positiva.

Urea
Para esta prueba se pretende determinar la presencia de la enzima ureasa en algunas
bacterias y la reacción que se determina es el desdoblamiento de la urea por esta enzima a dos
moléculas de amoniaco. En el resultado se aprecia una coloración amarilla indicando que la
prueba es negativa.

Para la lectura de los resultados de identificación de microorganismos gramnegativos se realizó

con la siguiente tabla, en la que podemos identificar el tipo de género de las bacterias
gramnegativas.
Según los resultados de las pruebas, se hace una comparación con la tabla y de esta manera se logra
identificar el microorganismo klebsiella..

Resultado identificación de antibiogramas

Métodos de difusión agar

Una vez identificado el microorganismo se procede a realizar el método de difusión agar donde se
pretende determinar la sensibilidad o resistencia del microorganismo frente al antibiótico. .Después del
periodo de incubación encontramos que el microorganismo (klebsiella) es sensible a los siguientes
antibióticos:
cephalothin: 17 mm aproximadamente

cefepime: 32 mm aproximadamente
ceftazidime: 26 mm aproximadamente

cephalexin: 13 mm aproximadamente
ceftriaxone: 30 mm aproximadamente

antibiótico abreviatura grupo al cual mecanismo de medida en mm interpretación

pertenece el acción cualitativa
antibiótico

KF cefalosporina síntesis de 17 sensible

cephalothin pared celular

FeP cefalosporina síntesis de 32 sensible

cefepime pared celular

ceftazidime CAZ cefalosporina síntesis de 26 sensible

pared celular

cephalexin CL cefalosporina síntesis de 13 sensible

pared celular

ceftriaxone CRO cefalosporina síntesis de 30 sensible

pared celular
 Análisis de resultados

La tinción de Gram diferencia a las bacterias en dos grandes grupos. Se llama bacterias Gram positivas a
aquellas que retienen la tinción azul-violeta, y se denomina bacterias Gram negativas a las que se decoloran y
después se tiñen con safranina. Esta diferencia de tinciones se debe a la estructura de las paredes celulares
de ambos tipos de bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen una pared gruesa compuesta de
peptidoglucanos y polímeros, e impermeable, que hace que resista la decoloración. En cambio, las bacterias
Gram negativas tienen una capa delgada de peptidoglucanos más una bicapa de lipoproteínas que se puede
deshacer con la decoloración.

De esta manera se realizó la diferenciación de los microorganismos entre gram positivos y gram
negativos de una colonia de bacterias, con la tinción de gram, y mediante el microscopio optico se
observo los bacilos de color rosa lo que nos indica que son bacterias gram negativos . Una vez identificado
el microorganismo se procedió a identificar el tipo de género de bacilos gram negativos mediante pruebas
metabólicas para la identificación de microorganismos gramnegativos los cuales la mayoría de las
pruebas se obtuvo resultados negativos, se utilizaron las siguientes pruebas:

● Prueba de citrato que sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como
única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su
metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas
características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y
algunas especies de Salmonella. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como
fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente, y azul de bromotimol, como indicador de
pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y
liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte
alcalinización del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde
a azul.

De acuerdo al análisis de la prueba de citrato se obtuvo como resultado negativo, debido a que
no hubo un cambio de color, apreciando un color verde, entonces se puede decir que la bacteria
no es capaz de metabolizar el citrato.

● ROJO DE METILO Y VOGES PROSKAUER: Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de
un microorganismo de fermentar la glucosa con producción de ácido por la vía ácido mixta o con
producción de un producto final neutro (acetoína) por la vía butanodiólica.
 De esta manera se interpreta que el resultado para la prueba de rojo de metilo es negativo ya
que se aprecia una coloración amarilla lo que constituye una reacción negativa. De haber una
coloración roja, indica la presencia de ácidos provenientes de la fermentación de la glucosa,
constituye un resultado positivo.
● Agar motilidad, indol, ornitina: es un medio de cultivo ampliamente utilizado para la
diferenciación de bacilos Gram negativos entericos, sobre la base de la producción de Indol, la
actividad de la enzima Ornitina decarboxilasa y la capacidad de motilidad.
Los cambios en el pH se verifican gracias al contenido de púrpura de bromocresol. La actividad
de la ornitina decarboxilasa se observa como un viraje hacia el color púrpura, en tanto que la
ausencia de la enzima produce un viraje hacia el color amarillo. La motilidad se observa como un
desplazamiento del desarrollo microbiano desde el inóculo. una vez completado el periodo de
incubacion se Compara los resultados de acuerdo a los siguientes patrones:
Motilidad Resultado positivo: presencia de desarrollo microbiano que se observa como
enturbiamiento del medio de cultivo en todo el tubo, o desplazado fuera de la picadura
de inoculación. Resultado negativo: el desarrollo microbiano está restringido solo en el
trayecto de la picadura de inoculación.
Ornitina decarboxilasa: Resultado positivo: se verifica como alcalinización del medio de
cultivo con un viraje hacia el púrpura. Resultado negativo: se observa acidificación con
viraje hacia el amarillo o no se observan cambios significativos en el pH. 3.- Producción
de Indol: Agregue 3 a 4 gotas de Reactivo de Kovacs sobre la superficie del medio de
cultivo y agite cuidadosamente. Resultado positivo: producción de un compuesto de
color rojo fucsia. Cualquier indicio de color es considerado positivo. Resultado negativo:
ausencia de color rojo fucsia.

Mediante este análisis se compara los resultados que obtuvimos en la práctica; en la

motilidad el resultado fue negativo ya que se observa el desarrollo microbiano esta
restringido solo en el trayecto de la picadura de inoculación, en la ornitina
descarboxilasa el resultado fue negativo debido a que se observa acidificación con
viraje hacia el amarillo o no se observan cambios significativos en el pH y en la
produccion de indol el resultado fue negativo en el que hay ausencia de color rojo fucsia
encambio se aprecia un color amarillo.
Entonces podemos decir mediante este análisis y comparación de interpretación de
resultados (tabla ) que el tipo de género del microorganismo es la klebsiella.
 ● Urea: en este agar se determina la presencia en algunas bacterias de la enzima ureasa que la
reaccion que se determina es el desdoblamiento de la urea por esta enzima a dos moleculas de
amoniaco y se evidencia por el cambio de PH del indicador que es rojo de fenol, el cual en
alcalinidad vira a un color violeta indicando una prueba positiva, si el color es amarillo indica una
prueba negativa.

Asi mismo se interpreta los resultados de la prueba los culaes se evidencia un color amarillo
indicando que la prueba es negativa, por lo que podemos determinar que no hay presencia de la
enzima ureasa en el microorganismo.

De acuerdo al análisis de las diferentes pruebas para la identificación de microorganismos

gramnegativos y mediante la tabla de lectura de resultados( tabla...) se logró la identificación de la
bacteria klebsiella rhinoscleromatis la cual pertenece al género klebsiella pneumoniae y están asociadas
a enfermedades crónicas de las vías aéreas superiores. klebsiella rhinoscleromatis, es el agente del
rinoescleroma, una infección granulomatosa crónica y progresiva del tracto respiratorio superior.

Posteriormente a la identificación de la klebsiella rhinoscleromatis, se procedió a identificar los

antibióticos mediante el método de difusión agar que consiste en depositar, en la superficie de agar de
una placa de petri previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados
con los diferentes antibióticos. Tan pronto el disco impregnado de antibiótico se pone en contacto con la
superficie húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde al agar. El antibiótico difunde
radialmente a través del espesor del agar a partir del disco formándose un gradiente de concentración.
Transcurridas 18-24 horas de incubación los discos aparecen rodeados por una zona de inhibición. La
concentración de antibiótico en la interfase entre bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas se
conoce como concentración crítica y se aproxima a la concentración mínima inhibitoria (CMI) obtenida
por métodos de dilución.

La interpretación de este resultado se realizó tras la medición (en mm) del diámetro de los discos que
aparece en la caja de petri por una zona de inhibición, lo que determina que la klebsiella es sensible a los
antibióticos cephalothin, cefepime, ceftazidime, cephalexin y ceftriaxone, logrando así identificar los
antibióticos que podrían tratar la klebsiella rhinoscleromatis (rinoescleroma).

Conclusiones

1. Debido a las pruebas de identificación que son fundamentales para la identificación del
microorganismo como el de gram y las pruebas bioquímicas ya que se reconocen y se diferencia las
bacterias tanto las Gram positivas como las Gram negativas. En complemento a esto, las pruebas
positivas de citrato, indol, mio,rojo metilo distingue la bacteria Klebsiella rhinoscleromatis de otras.
2. En esta práctica de laboratorio por medio de las pruebas bioquímicas y de identificación se
clasifican diferentes grupos de bacterias y tiene como objetivo la identificación de familias sin embargo
la identificación de especie es muy compleja debido a la serie de procedimientos que se tienen que
emplear para llegar a ese resultado.

3. En los resultados del antibiograma es de vital importancia llevar a cabo el debido procedimiento
como medidas respectivas frente al sensidisco ya que puede verse afectado el halo de inhibición. Por
medio de este nos da la medida de la potencia y magnitud del antibiótico frente al microorganismo el
cual va a arrojar los resultados de resistencia y sensibilidad del antibiótico administrado en el agar.

Bibliografía

https://www.medigraphic.com/pdfs/cosmetica/dcm-2018/dcm182n.pdf

https://www2.ulpgc.es/hege/almacen/download/35/35729/pruebas_bioquimicas_de_identificacion_
de_bacterias.pdf

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/proskauer.pdf

https://andinamedica.com.pe/wp-content/uploads/2016/08/Medio-MIO.pdf

https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-
procedimientomicrobiologia11.pdf