Practica No.

1: Frotis en fresco y Tinción de Gram – Microbiología

ELABORACIÓN DE FROTIS EN FRESCO Y TINCIÓN DE GRAM

DIANA CAROLINA PITALUA CORREA1
1. Estudiantes de medicina, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Sucre. Informe de laboratorio de
MICROBIOLOGIA.

RESUMEN
La Microbiología es la ciencia que estudia los microorganismos, bacterias, hongos, protistas
y parásitos y otros agentes como virus, viroides y priones. Es claro, que los microorganismos
cumplen funciones esenciales en todos los ecosistemas; estableciendo relaciones mutualistas,
parasíticas o neutras entre ellos y con los demás organismos. los microorganismos, se
clasifican en cuatro grupos: bacterias, virus, hongos y parásitos; cada uno de estos grupos
posee aspectos diferentes en cuanto a su relación, estructura, morfología, nutrición y
reproducción; para el estudio de éstos se utilizan diversas técnicas que van desde
procedimientos de laboratorio que se implementaron hace más de un siglo, hasta técnicas de
ADN recombinante, genómicas que han expandido la visión del mundo microbiológico en la
última década; En el siguiente informe de laboratorio se presenta la descripción de un
procedimiento en el cual se llevó a cabo la elaboración de un frotis en fresco y la tinción de
Gram con el fin de contrastar las bacterias presentes en un medio de cultivo , para identificar
la presencia de bacterias según su grupo taxonómico: Gram positivas y Gram negativas. el
objetivo de nuestra práctica estará encaminado hacia las bacterias, al conocer su morfología a
través de una frotis que posteriormente será expuesta a la coloración Gram, la cual nos
permitirá diferenciar entre bacterias Gram negativas y Gram positivas.

PROPOSITOS DE LA PRÁCTICA

● Elaborar correctamente frotis a partir de colonias obtenidas en cultivo o de muestras

clínicas.
● Realizar correctamente una coloración de Gram.
● Observar microorganismos en preparaciones en fresco.
Observar bacterias en preparaciones fijas coloreadas con la coloración de Gram.
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MARCO TEÓRICO
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el
microscopio óptico más sin embargo los exámenes en fresco permite visualizar los
microorganismos sin necesidad de fijarlos ni teñirlos, y por tanto vivos. Los microorganismos
en general no presentan demasiado contraste respecto al medio que les rodea. A pesar de ello
es posible verlos sin necesidad de teñirlos gracias a la refringencia que despiden y sobre todo
a su capacidad de movimiento en medios líquidos, la elaboración de un frotis en fresco es
una técnica que apenas se utiliza en el diagnóstico microbiológico, porque ofrece muy poca
información en cuanto a la estructura y composición de las bacterias. Solamente puede tener
utilidad en la comprobación de la motilidad de los microorganismos.

Cuando se desea realizar una clasificación taxonómica de las bacterias que se están
observando a vista de microscopio, ya se presenta una dificultad puesto que no hay manera de
identificar cuáles bacterias son Gram positivas o cuales son Gram negativas y es por eso que
se hace necesario la utilización de la técnica de tinción de Gram, denominada así por el
bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844.

Los fundamentos de la técnica se basa en las diferencias entre las paredes celulares de las
bacterias Gram positivas y Gram negativas La pared celular de las bacterias Gram positivas
posee una gruesa capa de peptidoglucano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado
en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido
lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el
peptidoglucano. Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada,
y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a
la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglucano unida a una
membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína,
fosfolípido y lipopolisacárido. (Ver figura 1)Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen
diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el
peptidoglucano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y
las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas. La
diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana
externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla
de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para
poder retener el complejo de crista violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este
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complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram
positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de
peptidoglucanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa
deshidratando los poros cerrándose, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea, posteriormente al utilizar un
colorante de contraste como la safranina se teñirá de color rosado las bacterias Gram
negativas, lo que permitirá diferenciar cuales son las bacterias Gram negativas( color rosado)
y cuáles son las Gram positivas( azul/violáceo) por los colores que poseen cada tipo.

Figura 1. Esquema de las diferencias estructurales entre bacterias Gram negativas y Gram positivas.

MATERIALES
● Colorantes para la coloración de Gram.
-Cristal violeta
-Solución de Lugol
-Alcohol- Acetona
-Safranina
● Cultivos de bacterias( cocos y bacilos)
● Láminas portaobjetos
● Láminas cubreobjetos
● Solución salina
● El frotis preparado en la primera parte de laboratorio.
● Mechero de gas
● Agua corriente.
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PROCEDIMIENTO PARA ELABORACIÓN DEL FROTIS

1. Se Calentó el asa de inoculación hasta que esté al rojo.

2. Se tomó la porción de la muestra (o una colonia del cultivo) que se va a examinar por
medio de una asa o escobillón

3. Se Colocó la muestra sobre un portaobjetos limpio y sin grasa, debidamente marcado

4. Se Trazó con la muestra un espiral desde el centro a la periferia. Se colocó una pequeña
gota de solución salina sobre el portaobjetos antes de realizar el frotis y se disolvió la
muestra.

5. Se calentó nuevamente el asa para desinfectarla.

6. Se Dejó secar el frotis al medio ambiente.

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7. Se Fijó pasándolo tres veces a través de la llama con la muestra hacia arriba.

PROCEDIMIENTO DE LA COLORACIÓN

1. Se vertió el cristal violeta sobre el portaobjetos y se dejó actuar por 1 minuto.

2. Se Enjuago con agua corriente y dejo escurrir

3. Se Agregó la solución de lugol y dejo actuar por 1 minuto

4. Se dejó Escurrir la solución y se enjuago el portaobjetos con agua corriente

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5. Se Decoloró con el alcohol-acetona por 5 segundos y se enjuago con agua corriente.

6. Se agregó la solución de Safranina y se dejó actuar por 5 segundos, Se enjuago, escurrió

y dejo secar

7. Se llevaron las láminas al microscopio y se observaron.

RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

Muestras en el microscopio óptico, obteniendo como resultado las siguientes imágenes:

Imagen: Fotografía de Escherichia coli, aumento 40x Imagen: Fotografía de Escherichia coli, aumento 100x

Según la clasificación de la forma, al observar la imagen es simple darnos cuenta que la

bacteria Escherichia coli es un Bacilo corto gram negativos no esporulados, flagelados. Así
mismo, es importante destacar que Escherichia coli pertecene a las bacterias Gram negativas,
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fundamento que queda en evidencia al momento de la coloración de Gram, porque no

denotan una coloración azul-violetta característica de la Gram positivas, sino rosada. Esta
característica está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular, reflejando así, un
tipo natural de organización bacteriana. La afinidad tintorial es en sí mismo lo que permite
dividir a las bacterias en 1) Gram positivas (violetas) que retienen el colorante principal tras
la decoloración con alcohol o alcohol-acetona y 2) Gram negativas (rojas) que pierden el
colorante principal tras la decoloración por lo que es necesario aplicar un colorante de
contraste para visualizarlas. Esta diferencia de coloración está basada, como se explicó
anteriormente, en la diferencia estructural de la pared. En las Grampositivas el colorante se
fija fuertemente al peptidoglucano que lo "retiene" e impide que "salga" con el decolorante.
En las Gramnegativas el colorante es retenido con menos fuerza, al ser más delgada la capa
de peptidoglucano, logra salir. Además la mayor cantidad de lípidos presentes hace que el
colorante se elimine al solubiliarse los lípidos en el alcohol, por lo que se hace lógico porque
las bacterias Gram negativas tienen un color más suave que el de las bacterias Gram
positivas. Es por esto, que a través de la tinción de Gram pueden valorarse la afinidad
tintorial, forma y agrupaciones de las bacterias.

Imagen: Fotografía de Escherichia coli, diferentes muestras. Aumento 100x

En esta imagen se puede observar un detalle muy interesante acerca de la Escherichia coli,
pues a simple vista parece que tuviera una forma de coco, y es por ello, que a veces se les
designa el término coco-bacilo. Sin embargo, al observar bien su morfología se ve claramente
que es una bacteria en forma de bacilo, pero acortada, casi como un coco, y posee flagelos en
la periferia.
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Imagen: Fotografía de Staphylococcus aureus. Aumento 100x

Por su parte, el género Staphylococcus está formado por cocos Gram positivos, con un
diámetro de 0.5 a 1.5 μm, agrupados como células únicas, en pares, tétradas, cadenas cortas o
formando racimos de uvas. Se introdujo el nombre de Staphylococcus, del griego staphyle
que significa racimo de uvas, para describir a los cocos responsables de inflamación y
supuración. Son bacterias no móviles, no esporuladas, no poseen cápsula. 7Así mismo, S.
aureus pertenece a las bacterias cocaceas, éstas permanecen unidas luego de su división
dando origen a distintas agrupaciones que facilitan su identificación presuntiva. Las coceas se
pueden dividir en varios planos, dando origen a un racimo de uva, característica presente en
los estafilococos (Staphylococcus). Así, dependiente del grado de adhesividad entre las
células microbianas pueden llegar a formar racimos. Al observar la imagen, podemos denotar
las características antes mencionadas en ambas imágenes.

CAUSAS DE ERROR
Una reacción Gram positiva falsa
 Frotis fijado antes de estar seco o demasiado grueso
 Colorante Cristal-Violeta con sedimento (filtrarlo).
 El Lugol no se escurrió completamente.
 No se decoloró suficientemente.
 La solución de Safranina se dejó por demasiado tiempo.
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Una reacción Gram negativa falsa

 No se dejó actuar suficiente la solución de yodo.
 La preparación se sobre-decoloró.

Por tanto, las equivocaciones del operador, son los que demarcaran resultados factibles o
erróneos, por lo que se hace necesario que se trabaje con sumo cuidado y siguiendo cada
requerimiento.

CONCLUSIÓN

En la práctica, se logró realizar observar y diferenciar, con su respectiva tinción de Gram,

logrando así, su visualización por medio del microscopio óptico, la tinción de Gram la
cual nos brindó la oportunidad a vista de microscopio de observar las bacterias Gram
positivas, Gram negativas y con esto aprender a identificarlas según el tipo de tinción que
tengan y su morfología. En resumen, los microorganismos son de gran interés por su
importancia clínica, ambiental y biotecnológica. Algunos de ellos son agentes causales de
diversas enfermedades infecciosas (SIDA, tuberculosis, mal de Chagas, algunos cánceres,
diversas enfermedades en plantas y animales, etc.) y otros producen compuestos que
combaten infecciones (antibióticos). Así, la Microbiología permite conocer el mundo de
los microorganismos, entender su importancia y aprovechar la diversidad de sus
funciones para mejorar la calidad de vida del hombre.

CUESTIONARIO

 Investigar causas que alteran la coloración de Gram.

Los factores que alteran la tinción de gram son:

- Edad de la bacteria
- Errores del operador

- Uso de antibióticos
- Condiciones de cultivo
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- Actividad de sus autolisinas

A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram, este método debe ser valorado con
precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células (cultivos viejos de
bacterias Gram positivas pueden perder capas de peptidoglucano y teñirse como Gram
negativas) y la técnica empleada (al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr
el riesgo de que bacterias Gram positivas se tiñan como Gram negativas); el uso de
antibióticos puede dañar su pared celular.

 ¿Cuáles son las bacterias resistentes a la coloración de Gram?

- Mycobacterias: Hace parte de las bacterias ácido-alcohol resistentes, éstas no

pueden ser clasificados según la tinción de Gram, porque son resistentes a la
decoloración.
- Mycoplasmas: No tienen pared de peptidoglucano.
- Formas L: Pérdidas ocasional de la pared.
- Protoplastos: Eliminación total de la pared de peptidoglucano.
- Esferoplastos: Eliminación parcial de la pared de peptidoglucano.

Las bacterias que carecen, ya sea parcial o completa, pérdida de la pared de peptidoglucano,
no pueden teñirse por medio de esta tinción, porque esta coloración se basa principalmente en
la resistencia de la pared de petidoglucano de las bacterias, su capacidad de retener o no el
colorante.

 ¿Qué fin tiene la fijación de las muestras al realizar un frotis bacteriano?

La frotis es una extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con
objeto de separar lo más posible los microorganismos para obtener una imagen clara y nítida.
Posteriormente el frotis debe ser fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los
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métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin
que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijación de una extensión
bacteriana hace que las bacterias quedan inactivadas y adheridas al vidrio alternando lo
menos posible la morfología bacteriana y las posibles agrupaciones que puede haber.

 Señale cuatro géneros bacterianos Gram positivos y cuatro Gram negativos.

Géneros bacterianos Gram positivos:

- Género Staphylococus
- Género Streptococos
- Género Enterococcus
- Género bacillus
Géneros bacterianos Gram negativos:
- Género Escherichia
- Género Neisseria
- Género Salmonella
- Género Brucella

BIBLIOGRAFÍA

1. Técnicas de tinción Fundamentos. Disponible en:

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
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2. MICROBIOLOGÍA y BIOTECNOLOGÍA. Disponible en: http://www.lourdes-

luengo.org/unidadesbio/microbiologia/25Microbiologia.pdf

3. Fundamentos de la tinción de Gram. Disponible en:

https://es.scribd.com/doc/5368278/Fundamentos-de-la-tincion-de-Gram

4. Preparaciones de frotis en fresco. Disponible en

:http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/5
6/cap304.htm.

5. Tinción de Gram. Disponible en:

http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/moodle/pluginfile.php/233464/mod_resource/con
tent/0/2._PRACTICA_TINCIONES_ESPECIALES_EN_MICROBIOLOGIA.pdf)

6. Tinción de Gram Fundamentos. Disponible en: ,http://www.telmeds.org/wp-

content/uploads/2016/11/Tincion-de-Gram.pdf

7. Laboratorio de Microbiología. Universidad de Panamá

8. Bacterias Gram positivas y Gram negativas. Disponible en

:https://www.ejemplos.co/20-ejemplos-de-bacterias-gram-positivas-y-gram-negativas/