Pruebas de identificacin bacteriana Identificacin bacteriana

La identificacin es un proceso por el cual debemos determinar a qu especie pertenece una determinada cepa bacteriana, mediante la comparacin de una serie de caractersticas que pueden ser puestas en evidencia en el laboratorio y que han sido estudiadas para la gran mayora de las especies importantes desde el punto de vista de la patologa infecciosa humana. Cuanto ms semejanza haya entre las caractersticas obtenidas en el laboratorio y las que habitualmente presenta una determinada especie, mayor ser la probabilidad de que esa cepa problema pertenezca a dicha especie. Las caractersticas utilizadas en la identificacin de cada grupo de microorganismos dependen de las posibilidades de cada laboratorio, fundamentalmente econmicas y de cualificacin del personal, as como de la epidemiologa especfica de la zona. Las caractersticas que se tienen en cuenta para lograr una correcta identificacin son las siguientes: Caractersticas no bacterianas: ? Paciente: Edad Sexo Patologa ? Muestra: Obtencin Conservacin Transporte

Identificacin bacteriana. Identificacin bacteriana es el ejercicio prctico en el que se ejercercen las pruebas de identificacin bacteriana. En la medicina general es comn que llegue un paciente con sntomas de alguna infeccin bacteriana, el determinar un diagnstico y poder interpretar qu bacteria caus la molestia al paciente es aventurado, pues hay muchas bacterias que causan las mismas enfermedades, por eso es conveniente realizar pruebas de identificacion, que son sumamente importantes para un buen diagnstico de cualquier patologa. Cada gnero, inclusive especie, tiene diferentes reacciones cuando se les enfrentan diferentes reactivos, esto se hace a partir de un cultivo puro, ya la bacteria aislada, con estas pruebas podremos decir casi con exactitud de que gnero y qu especie es esta bacteria. A estas pruebas se les ha como primarias, secundarias y Complementarias. Pruebas Primarias Para la identificacin de las bacterias en el laboratorio es importante conocer sus caractersticas morfolgicas, la reaccin a la tincin de Gram, agrupacin, propiedades, morfologa colonial, reacciones metablicas como produccin de enzimas y reacciones de xidofermentacin. La identificacin bacteriana primaria se basa en los siguientes puntos:

Tincin de Gram: Revela la forma de la bacteria, agrupacin y grupo taxonmico al que pertenece: Gram positivo o Gram negativo.

Tincin de Ziehl Neelsen: Las bacterias Alcohol-cido resistentes (BAAR), son difciles de cultivar, tal vez y en un agar sangre muestre algo de crecimiento, por eso es til esta tincin de identificacin primaria.

Tincin de esporas: La espora es un mecanismo de defensa generalmente de los gneros Bacillus y Clostridium.

Prueba de catalasa: La catalasa es una enzima que descompone al perxido de hidrgeno en oxgeno y agua, esta enzima es similar a la estructura de la hemoglobina. Excluyendo al gnero Streptococcus y algunos otros la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas tienen catalasa.

La base de esta prueba es demostrar la presencia de la enzima catalasa, colocando 2 o 3 gotas al cultivo. El resultado es positivo si en la colonia hay efervescencia. Ejemplos: Catalasa (+): Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas sp. Catalasa (-): Streptococcus spp.

Prueba de oxidasa: Bsicamente es la deteccin de la enzima oxidasa, muy til en la identificacin de bacterias Gram (-). La reaccin de la oxidasa se debe a la presencia del sistema de citocromo-oxidasa, la cual activa citocromos reducidos por oxgeno molecular, por la transferencia de un aceptor al estado terminal del sistema de transferencia de electrones.

El sistema de citocromos est generalmente presente en organismos aerbicos. Un resultado positivo a la oxidasa consiste en una serie de reacciones en las cuales un componente autooxidable del sistema de citocromo es al final catalizado. Utilizando un tubo capilar con tetrametil-p-phenylendiamina al 1%, se adiciona una pequea cantidad a un cultivo bacteriano colocado sobre un papel filtro y obtenemos las siguientes reacciones: una reaccin positiva (presencia de oxidasa) se indica por la apariencia de un color prpura obscuro en el papel, en menos de 10 segundos; al contrario una reaccin negativa, que consiste en una ausencia de color prpura, indica segn los ejemplos: Oxidasa (+): Pasteurella multocida Oxidasa (-): Escherichia coli

cido de la Glucosa: La mayora de las bacterias de inters mdico usan la glucosa como fuente de carbono, como parte importante de su metabolismo. Se determina si la bacteria usa la glucosa produciendo cido y/o gas a partir de dicho carbohidrato. En un tubo con agua peptonada al 1% tapado, y un tubo de Durham, se inocula la bacteria por agitacin teniendo cuidado de no mover el tubo de Durham e incubndolo 24 horas y 37C se obtienen los siguientes resultados.

Si la bacteria usa la glucosa producir cido y/o gas, por lo tanto el agua peptonada se observar rosa, si produce gas, se observar una burbuja en el tubo de Durham. Ejemplos: cido y gas a partir de la glucosa: Escherichia coli Negativo a produccin de gas: Proteus stuartii.

Prueba de O/F: para realizar esta prueba se usa el medio bsico de Hugh y Leisfon con un pH de 7.1. Es un medio semislido de color verde que se inocula por picadura, contiene carbohidratos como: glucosa, lactosa, sacarosa o maltosa al 10%. Como indicador de pH tiene Azul de bromotimol. Se usa en dos tubos, uno sin aceite y otro con acetie o vaselina sellndolo. Se inoculan los dos tubos con la bacteria por picadura y se mantiene a 37C por 24 horas, obtenindose:

TUBO ABIERTO

TUBO SELLADO

INTEPRETACI N

Amarillo

Verde

Oxidacin (aerobio)

Amarillo (anaerobio facultativo) Amarillo

Fermentacin

Verde (anaerobio estricto)

Amarillo

Fermentacin

Verde

Verde

Negativo (NH3)

Prueba de Motilidad: Llamada tambin de la gota suspendida. Algunas bacterias son mviles por presentar flagelo, los flagelos son encontrados principalmente en las formas bacilares y pueden presentarse en nmero y posicin variados(monotricos, peritricos, ect.). La base de esta prueba es determinar si la bacteria es mvil o inmvil. Con un asa de inoculacin se le coloca a un cubreobjetos un poco de muestra y se le agrega una gota de agua destilada. Se coloca sobre un portaobjetos y se observa al microscopio. Podremos observar si las bacterias tienen movimientos rectilneos o curvos y en todas direcciones. Ejemplos: Motilidad (+): como en Pseudomonas auruginosa. Motilidad (-): como en Pasteurella multocida.

Pruebas Secundarias. La identificacin se fundamenta en la comparacin del microganismo que deseamos identificar con los microorganismos de identidad conocida. La exactitud de la identificacin depende de la eficacia del trabajo preparatorio as como su grado. Estas pruebas se clasifican de la siguiente manera:

Simples: Citrato, Malonato, MR-VP, Nitrato y Leche Tornasol. Mltiples: TSI, LIA y SIM. Especiales: Coagulasa, Hialuronidasa y Acriflavina

IDENTIFICACIN DE UNA CEPA BACTERIANA

Existen diferentes sistemas de clasificacin de bacterias, pero el ms comnmente utilizado es el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. La identificacin de una bacteria es su asignacin a un taxn segn una clasificacin dada. Consiste en la determinacin de las caractersticas fenotpicas y/o genotpicas y la comparacin de estas caractersticas con los diferentes taxones de la clasificacin considerada. Las caractersticas a determinar y su nmero depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificacin. A continuacin se propone un esquema de trabajo para la identificacin de

una cepa bacteriana desde el punto de vista bioqumico (Biotipo): 1) Obtener un cultivo puro 2) Examen microscpico de clulas vivas y de frotis teido por coloracin Gram. Se determina as la forma y el Gram del microorganismo en estudio. Tambin es importante determinar la agrupacin y la presencia de esporas y otras caractersticas morfolgicas de inters. 3) Determinar las caractersticas nutricionales (en general se desprenden de los mtodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoauttrofos, fotohetertrofos, quimioauttrofos, quimiohetertrofos. 4) Realizacin de pruebas primarias: En la siguiente tabla, modificada del Cowan & Steel's Manual of Identification of medical bacteria, se utilizan un grupo de pruebas, denominadas pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el gnero, grupo de gneros o en algn caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las pruebas primarias son: Gram, morfologa, catalasa, oxidasa, OF, fermentacin de glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosisy movilidad. 5) Realizacin de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependern del gnero o familia determinado. (ej: produccin de pigmentos, produccin de indol a partir de triptofano, produccin de coagulasa, de fenilalanina deaminasa, etc.) Serotipo A los efectos de realizar identificaciones ms rpidas, o cuando las pruebas bioqumicas no son concluyentes, se recurre al uso de antisueros especficos. Los antgenos bacterianos pueden ser capsulares, somticos (O) que corresponden al lipopolisacrido de la pared de los Gram negativos, flagelares (H), y los antisueros se identifican con esas letras y el nmero o letra del

antgeno

correspondiente.

En una primera identificacin se usan sueros polivalentes y para la caracterizacin serolgica se usan sueros monovalentes dentro de cada tipo de antgeno. Existen en el comercio antisueros para caracterizacin de: Salmonella, Shigella, E.coli, Haemophilus, etc. Tambin se pueden utilizar mtodos de cromatografa gaseosa para identificar productos metablicos, en particular para la identificacin de bacterias anaerobias no esporuladas como: Bacteroides, Fusobacterium, etc.

Se puede expresar el nombre de una cepa de la siguiente manera:

Yersinia gnero

entercoltica especie

4 biotipo

03 serotipo

ENSAYOS BIOQUIMICOS La identificacin de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes. Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioqumicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Existen diferentes sistemas que facilitan la realizacin de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioqumicas para la identificacin de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretacin de

un resultado utilizando un valor numrico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables. Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente an para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentacin de distintos azcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente. A la determinacin de la especie se puede llegar segn diversos sistemas (manuales de identificacin, comerciales, etc.). a) Los comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioqumicas convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en reactivos o pequeos compartimentos con medios listos para sembrar. En todos los casos se emplean cdigos numricos para la interpretacin de resultados. la realizacin de una prueba bioqumica implica: 1) Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o inhibidor y luego de la incubacin visualizar el crecimiento y la degradacin de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la presencia del sustrato, o de algn producto de su degradacin.

2) Cultivar el microorganismo en un medio de propagacin que contenga el sustrato de una enzima inducible y luego de la incubacin demostrar la actividad enzimtica. En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubacin) en un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma ptima, a pH, fuerza inica, atmsfera y temperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para ese test. Si bien existen una gran variedad de pruebas bioqumicas empleadas con fines de identificacin, se enumerarn a continuacin solo las que se utilizan ms frecuentemente, agrupadas segn el tipo de ensayo y se denominan segn su nombre corriente.

1) Enzimas vinculadas con la respiracin a) b) catalasa 2) Descomposicin de azcares simples, cidos orgnicos y otros 2.1) Requerimientos de oxgeno OF (xido-fermentacin) oxidasa

Crecimiento en caldo tioglicolato 2.2) Produccin de cido, o cido y gas Fermentacin de carbohidratos 2.3) Deteccin de enzimas y vas metablicas

a) b) c) d)

RM-VP

(rojo

de

metilo nitro

Voges

Proskauer)

Gluconato O.N.P.G. (orto -D-galactopiransico) Esculina

e) Hipurato 3) Fuente nica de carbono a) b) citrato malonato

c) hipurato para coliformes 4) Utilizacin de compuestos nitrogenados 4.1) Reduccin de nitrato a) b) denitrificacin 4.2) Descomposicin de carbohidratos aminocidos y otros a) b) c) d) e) Urea 5) Ensayos combinados a) b) TSI LIA (Triple (Agar Azcar Hierro Hierro) Lisina) Lisina, indol H2S Fenilalanina arginina, ornitina asimilacin

c) Bilis esculina 6) Deteccin de exoenzimas

a) b) c) d) e) f) accin de (hemolisinas) 7) Miscelneos a) b) c) produccin de pigmentos 8) Test de crecimiento o inhibicin a) b) c) Antibiticos proteasas,

lecitinasa coagulasa amilasas celulasas desoxirribonucleasas microorganismos sobre la sangre

KCN Bilis

Temperatura NaCl

TABLA MODIFICADA DE COWANS & STEEL PARA IDENTIFICACION DE BATERIAS HETERTROFAS

tincin gram (cultivo fresco) forma agrupacin crecimiento + aerobio crecimiento anaerobio esporas movilidad + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + coco coco coco coco racim racim caden tetrad os os as as bast bast Bast bast bast bast bast bast n n n n n n n n coco pare s + + + + + + + +

catalase + oxidase fermentaci n de

+ o + o + o + o + o +o + + + + + + + + (o+ + )

glucosa acido o

a a X X X X X X X X X X X X X X X X X X X O F F O

acido+gas O/F Micrococcu s Staphyloco ccus Streptococc us Lactococcu s Enterococc us Leuconosto c Pediococcu s Aerococcus Lactobacillu s Clostridium Bacillus Alcaligenes Pseudomon as Enterobact erias Aeromonas Chromobac terium Neisseria