Azúcares reductores

Resultados Prueba de Benedict

1. Reportar el resultado de la prueba de Benedict y explicar en cada caso

a. En las soluciones de diferentes carbohidratos: por qué da positivo o negativo (carbono

anomérico libre - tipo de enlace glucosídico).

Porque hay monosacaridos y disacaridos que pueden o no reducir el Cu+2 a Cu+, para
eso cabe resaltar que el reactivo de Benedict contiene carbonato de sodio, que
alcaliniza la solución. El sulfato de cobre aporta el Cu2+ para que se reduzca en
presencia de los azúcares reductores. Además, contiene citrato de sodio, que forma
complejos poco ionizados con el cobre, de color azul, y así evita que se pierda el
cobre II en forma de precipitado de Cu(OH)2, antes de que éste reaccione con los
carbohidratos. Entonces dependiendo del color que muestre la prueba se sabe si la
prueba es + o -

b. En las muestras: cuál es el carbohidrato presente, por el cual el resultado es positivo o

negativo.

Glucosa.

a.

Muestra Resulta Justifique el resultado obtenido según fundamento

do bioquímico

(- ) (+) (2+)
(3+) (4+)

1. Glucosa
200mg/dL +4 Puesto que el color depende de la concentración
del azúcar reductor. Es positivo debido a que la
glucosa es un reductor de Cu2+ y como el Cu(OH)
puede perder agua y da ese precipitado de color
rojo ladrillo.

2. Glucosa
50mg/dL +2 Sigue siendo glucosa solo que en menor
concentración, entonces produce un color
amarillento debido a que el Cu+ ya no puede
formar complejo con el citrato y reacciona con los
iones OH– presentes en la solución para formar el
hidróxido de cobre I amarillo, Cu(OH), que
precipita
 3. Suero (1:2)
+1

4. Fructosa
200mg/dL +3 También es un monosacárido, entonces se
considera un azúcar reductor. debido a su alta
concentración, pudo absorber más agua de ahí su
color naranja

5. Sacarosa
200mg/dL _ No es un azúcar reductor, debido a que no tiene
ningún carbono anomérico libre, por ende no se
pueden abrir de la forma hemiacetálica. Como el
reactivo de benedict contiene el citrato de sodio,
que forma complejos poco ionizados con el cobre,
de color azul, así se va a mantener ya que el Cu+2
no se pierde

6. Lactosa
200mg/dL +3 La lactosa es un de los pocos disacáridos que es
un reductor de glucosa ya que si se pueden abrir de
la forma hemiacetal a la forma lineal y reducir los
iones de cobre

7. Leche (1:10)
+2 La leche tiene como componente la lactosa
(disacárido, que si funciona como azúcar reductor),
por ende va a dar positivo a la prueba, pero al estar
tan diluida presenta una coloración baja, como el
amarilo

8. Leche
deslactosad +2
a (1:10)

9. Almidón
200mg/dL _ El almidón no es un monosacárido, es un
polisacárido, naturalmente no reductor, lo que
provoca que la prueba de negativa

2 ¿Cuál es el fundamento bioquímico que explica que las proteínas precipitan a

altas temperaturas?
El calor y el medio alcalino favorece que el carbohidrato se convierta en su enediol,
rompiéndose luego en dos fragmentos altamente reductores. Éstos, con sus
electrones expuestos, reducen el Cu++ a Cu+ .

¿En cuál(es) de las muestras se demuestra este proceso de precipitación de

proteínas por calor?

Resultados Determinación colorimétrica de glucosa con reactivo enzimático

Tubo Abs505nm Concentración (con unidades)

Patrón 0,0255 100 mg/dL

Suero (1/2) 0,120 471 mg/dL

Leche (1/10) 0,023 90 mg/dL

Leche 0,749
deslactosada
(1/10) 2937 mg/dL

Observaciones:

Integración y comparación de los métodos de determinación de glucosa

1. Explique los resultados obtenidos con este método y con la prueba de

Benedict.

R/ En el método de la glucosa oxidasa los resultados obtenidos son de tipo cuantitativo,

pues de esta reacción se adquiere un producto coloreado llamado (Quinonimina Roja) a
partir de esta se puede calcular la concentración de glucosa con ayuda del
espectrofotómetro, debido a que la concentración de la muestra es directamente
proporcional a la concentración de la muestra que se desea obtener. En el empleo del
 reactivo de Benedict los resultados obtenidos son de tipo cualitativo, esto debido a que
este método reacciona específicamente con los azúcares reductores que se observan
por un cambio de coloración.

2. A la vista de los resultados obtenidos, compare desde varios puntos de

vista los dos métodos de determinación de glucosa utilizados en esta
práctica.

R/ El Benedict reacciona sobre cualquier azúcar reductor, por lo que no es tan

específico; por otro lado, con el reactivo enzimático (glucosa oxidasa) es una
enzima con una especificidad de sustrato absoluta, pues sólo reacciona con la
Beta-D-Glucosas.

3. Explique las diferencias entre un método enzimático de punto final y un

método enzimático de tipo cinético?

Punto final o de equilibrio: Se incuba la muestra y el reactivo durante un

tiempo y temperatura determinados para que se complete totalmente la
reacción. Se mide después de pasar el tiempo de incubación.

Tipo cinético: Se mide la velocidad de reacción mediante la medida de

variación de la absorbancia en el tiempo y esto se relaciona con la
concentración. Es una medición continua, se mide en tiempos continuos. Se
puede medir la cantidad de sustrato no transformado o la cantidad de
producto formado.

4. ¿Cuál es el efecto de la temperatura en la prueba de Benedict y en la

prueba de glucosa oxidasa?

R/ En la prueba de Benedict el calor junto con el medio alcalino favorecen que el

carbohidrato se convierta en su enediol, rompiéndose en dos fragmentos
altamente reductores. Estos reducen el Cu++ a Cu+. El Cu+ ya no puede
formar complejo con el citrato y reacciona con los iones OH- presentes para
formar el precipitado Cu(OH). Con respecto a la glucosa oxidasa su
actividad máxima se encuentra entre los 20° y 45°C y se inactiva a una
temperatura >60°C.

GLUCOSA OXIDASA: Con cierto efecto de la temperatura del medio ocurre la

aceleración de la reacción a consecuencia de la activación de las moléculas
 de sustrato, a la vez, incluso un aumento pequeño de la temperatura
conduce al debilitamiento de los enlaces que mantiene la conformación de
las moléculas de las enzimas, necesarias para la manifestación de su
actividad catalítica.

BENEDICT: La prueba de Benedict es otra de las reacciones de oxidación, que

como conocemos, nos ayuda al reconocimiento de azúcares reductores.

Analice y responda los siguientes ejemplos aplicados

En el método enzimático para determinación de glucosa se obtuvieron los
siguientes resultados

MUESTRA ABSORBANCIA

PATRÓN (100 0,500

mg/dL)

SUERO 1 0,540

SUERO 2 0,300

LECHE SIN DILUIR Variable (inestable)

entre 0,300 y 0,350

LECHE DILUIDA 0,110

1/50

¿Qué conclusiones puede usted obtener a partir de estos resultados?

Entre más glucosa se oxide, mayor absorbancia va a haber por concentración de
quimiocina.

1. Se puede observar que el suero 1 tiene una mayor concentración que el suero 2,
lo cual se podría interpretar como una hipoglicemia.

2. Los resultados de la leche sin diluir y la leche diluida no se debería tomar en

cuenta ya que la leche no debería reaccionar con el reactivo de glucosa oxidada.

3. Discuta las posibles causas de la absorbancia inestable de la leche ¿qué haría

usted con esta muestra?

R/ Para poder interpretar los resultados de las dos muestras de leche, se necesita
que estas sean deslactosadas o agregarle lactasa a la leche normal para poder
medir la concentración de glucosa en leche.

¿Cuál es el resultado esperado para las siguientes muestras en la prueba de

Benedict? ¿Por qué se obtiene ese resultado? Explique

a) El almidón es un polisacárido y no es reductor, lo que indica que es negativa.

b) Al incubar almidón con amilasa está misma va a causar hidrólisis de los enlaces glicosídicos del
almidón de manera que va a haber glucosa libre que puede reaccionar, lo que indica que es
positiva.

c) La proteasa rompe enlaces peptídicos por lo tanto la prueba va a indicar que es negativa
Espectrofotometría
Recuerde que, para la presentación de los reportes, debe saber responder o
interpretar todas las preguntas que salen en el manual de laboratorio, aunque no se
encuentren aquí. Además debe explicar el fundamento de los métodos de la
práctica.

Espectro de
absorción

Resultados virtuales y ejercicios:

1. Elaboración de un espectro de absorción

Con los datos que tiene en la página 17 del manual de laboratorio, elabore los
correspondientes espectros de absorción A vs. λ, indique cuál es el pico de
absorción de cada una.

pico: 500nm
 pico: 430nm

pico: 630nm

2. Espectro de absorción de una misma sustancia en medio ácido y medio básico

Compare los espectros de absorción del verde de bromocresol en medio ácido y en

medio alcalino. Explique a qué se deben las diferencias

El verde bromocresol en medio alcalino tiene unas longitudes de onda y

absorbancias más dispersas y altas a comparación con el medio ácido. Todo esto se
debe a esos cambios de pH que traen consigo ionizante para el compuesto
alterando evidentemente las cargas moleculares y provocando desplazamientos de
los espectros UV. Se puede concluir que el espectro de absorción es mayor en un
medio alcalino.

3. Espectro de absorción con más de un pico

En el laboratorio se obtuvieron los siguientes resultados de una solución del
colorante Verde brillante. El colorante consta de una sola molécula.

¿Cómo se puede explicar que se observen dos picos de absorción diferentes?

Como ya bien sabemos todos los compuestos pueden absorber la luz de manera
diferente, también depende del tipo de partículas que posean, entonces se deduce
que

Verde Brillante

Longitud de
onda (nm) Absorbancia

590 0.436

600 0.556

610 0.740

620 0.917

630 0.921

640 0.700

650 0.424

660 0.223
 670 0.557

680 0.049

4. Espectro de absorción de una muestra compuesta

Dibuje el espectro de absorción aproximado de una muestra que contiene dos

componentes: uno presenta su máxima absorción a 450nm y el otro a 590 nm.

5. Espectro de absorción de una muestra de composición desconocida

Si al realizar un espectro de absorción de una solución de composición desconocida

se observaran tres picos de máxima absorción a diferentes longitudes de onda,
¿qué posibles explicaciones tiene este resultado?

En el caso de una mezcla, al no haber una superposición de las bandas de

absorción propias de cada componente, se puede determinar independientemente
cada una de ellas . Sin embargo en este caso donde la solución de concentración es
desconocida tiene bandas de absorción sobrepuesta y tomando en cuenta que la
absorbancia es una propiedad aditiva, por tanto va a usar una longitud de onda
determinada y la absorbancia de la mezcla es la suma de las absorbancia de cada
componente a una longitud de onda dada

Recta de calibración
Resultados obtenidos:

1. Completar el cuadro con los resultados obtenidos y hacer el gráfico Abs vs

conc. Incluir la ecuación de la recta y el R2.
 2. Determinar para cada tubo el coeficiente de absortividad (ε), en μM-1·cm-1.
Sacar el promedio de los ε que sean similares. Anotar en la tabla.

3. Calcular la concentración de la incógnita con el promedio de ε aplicado en

la fórmula de la Ley de Beer.

4. Calcularla también mediante los otros tres métodos explicados en el

manual de laboratorio.

1.

Vol de Vol de [colorante] Abs630nm ε

colorante agua
15μM (μM) Cálculo de
la
incógnita:

1 0 1500 µL 0 (blanco) 0 --

2 300 µL 1200 µL 3 μM 0,376 0,125

3 600 µL 900 µL 6 μM 0,744 0,124

4 900 µL 600 µL 9 μM 1,132 0,126

5 1200 µL 300 µL 12 μM 1,503 0,125

Promedio de ε: 0,125

INCÓGNITA azul Abs630 --> Concentració

n: 52μM
Dilución: ___1/7__
 0,938

Se necesita el promedio de ε

(0,125+0,124+0,126+0,125)
--------------------------------------- = 0, 125
4
Luego de la ley de Beer} A= ε * C* I
0,938= 0,125*C*1
C= 7,5 μM ---> la concentración diluida
7,5 μM * 7 = 52,2 -----> la concentración No diluida

O si lo sacamos con la ecuación de la recta

y=0,126* C + 0,0035
0,938= 0,126 * C + 0,0035
C= 7,42 μM -----> la concentración diluida
7,42* 7 = 52 μM -----> la concentración No diluida

En este método, se necesita la Abs del patron lo más cercana a la incognita

0,938
--------- X 9 = 7,5 ---> 52μM
1,132

último método hacerlo directamente en canva

Ejercicio:
1. Observe los siguientes resultados. Analice e indique en cada caso cuál es
el rango lineal, cómo se debe utilizar esta información, qué limitantes se
observan, cuáles de los tubos se podrían utilizar como patrón para aplicar la
ley de Beer, etc.
Caso A:

Caso B:

¿Cuál de las dos líneas es más correcta como recta de calibración? Explique.
Proteínas: Precipitación con sulfato de
amonio.
Recuerde que para la presentación de los reportes,
además de lo solicitado aquí, debe saber responder o
interpretar todas las preguntas que salen en el manual de
laboratorio y explicar el fundamento de los métodos de la
práctica.

1. Haga un esquema del procedimiento de precipitación de

proteínas de suero con sulfato de amonio.

2. Calcule la concentración de sulfato de amonio a la cual precipitaron las

globulinas y la albúmina. Muestre los cálculos.En este caso, la
concentración se suele presentar en forma del % de saturación de
sulfato de amonio. Por ejemplo, si se toma 1mL de muestra y se
mezcla con 1mL de una solución de (NH4)2SO4 al 100% de
saturación, la mezcla estará en una concentración de 50% de
saturación con sulfato de amonio.

Cn1*V1=Cn2*V2

fracción de globulina=FG

Fracción de Albúmina=FA

% saturación FG * 2,5mL= 100% * 1,00 mL

% saturación FG= 40%

% saturación FA * 4,5mL= (1,50mL * 40%) + (3,00 * 100%)

% saturación FA= 80%

3. ¿Por qué unas proteínas precipitan con mayor y otras con menor
concentración de sales?

Al aumentar la concentración salina del medio, la sal requiere de muchas

moléculas de agua para disolverse, de forma que las retira de la
superficie de las proteínas.Las proteínas se disuelven porque forman
numerosos puentes de hidrógeno con el agua del entorno. Esto
provoca una fuerte disminución de su solubilidad, lo que lleva a su
precipitación. Pero no todas las proteínas precipitan con la misma
concentración de sal, por lo que este método es útil para separar unas
proteínas de otras. La mayoría de las proteínas pueden ser
resuspendidas en agua u otra solución acuosa sin perder su
estabilidad y recuperando su estructura y su función.

4. Explique qué sucede con la estructura primaria, secundaria y terciaria

de las proteínas en el proceso de precipitación con sulfato de amonio

Se pierden las estructuras secundaria y terciaria (y cuaternaria si la

tuviere), La pérdida de estructura varía, según el agente
desnaturalizante; la transformación puede ser reversible, o irreversible
(que es el caso más común). La desnaturalización no involucra
pérdida de estructura primaria.
P4- Determinación de proteínas

Resultados e interpretación

1. Reporte las absorbancias y la concentración obtenidas de las muestras, a partir de los

ensayos con Biuret, Verde de Bromocresol y por medición de absorbancia a 280 nm. KARI

Tubo Abs 540 [ ] por Abs [ ] por Abs 280 Concentración

nm biuret 625nm VBC nm de proteínas

Patrón 0,900 80 mg/mL 1,504 80mg/mL 1,250 80mg/mL

Gelatina 0,038 3,38 mg/L 0,001 0,053 0,194 12,42 mg/mL

mg/mL

Clara 0,485 43,11 0,189 10,05 0,423 27,07 mg/mL

mg/mL mg/mL

Suero 0,844 82,13 0,437 77,3 - -

mg/mL mg/mL

2. ¿Hay alguna discrepancia entre los resultados obtenidos por los diferentes métodos?
¿Cómo se explica? KARI
Evidentemente hay una gran discrepancia entre los resultados de las pruebas, esto
se debe a que como ya sabemos, el reactivo de biuret reacciona ante la presencia de
la determinación de las proteínas totales del suero, esto significa que capta más de
una proteína, mientras que el verde bromocresol es específico ya que detecta la
albúmina presente en el suero, por eso vemos una disminución en las
concentraciones. y por último la absorbancia a 280nm permite detectar la presencia
de proteínas que contienen muy baja concentración de tirosina y triptófano, entonces
las concentraciones dependen de la presencia de estas moléculas.

3. Comparando los resultados de Abs280nm con los demás resultados de concentración de

proteínas, ¿qué se puede deducir acerca de la composición de aminoácidos de la gelatina?
Explique. LUIS

Al comparar los resultados de Absorbancia en el rango de 280 nm, se logra

evidenciar la presencia de proteína en cada una de las muestras. Está en menor
cantidad en la gelatina, ya que su presencia de aminoácidos es de bajo valor
nutricional, pocos esenciales y se suelen repetir. Al contar con poca variedad de
aminoácidos y el triptófano y tirosina no ser una parte considerable de su estructura
si se compara con las otras muestras se aprecia una disminución considerable.
4. Según los resultados anteriores, ¿cuál es el porcentaje de albúmina del total de proteínas
de la clara de huevo? MEYYY
El porcentaje de albúmina es de 13%, ya que se resolvería por una regla de tres,
siendo 80 mg/mL el 100% y 10,05 mg/mL el otro dato para obtener el porcentaje que
deseamos obtener.

5. Según los resultados anteriores, ¿cuál es el porcentaje de albúmina del total de proteínas
del suero? MEYYY
El porcentaje de albúmina es de 97%, ya que se resolvería por una regla de tres,
siendo 80 mg/mL el 100% y 77,3 mg/mL el otro dato para obtener el porcentaje que
deseamos obtener.

6. ¿Cuál es la concentración normal de albúmina y de globulinas en sangre? Calcule la

concentración de albúmina y la de globulinas en el suero. Compare sus resultados con los
valores normales. LUIS

En sangre la concentración de albúmina es de 35-52 g/L y globulina de 20-35 g/L.

Como resultado experimental el valor de albúmina en el suero es de 0,23 g/L y
globulina 0,21 g/L, al compararlos con los normales estos se encuentran por debajo
de los valores normales.

7. Reporte las absorbancias y la concentración obtenidas de las muestras de suero y las

fracciones obtenidas mediante precipitación con sulfato de amonio, en los ensayos con
Biuret y Verde de Bromocresol. Analice y explique los resultados obtenidos.

Tubo Abs 540 nm Concentración Abs 625nm Concentració

por Biuret n por VBC

Patrón 0,900 80mg/mL 1,504 80mg/mL

Suero - - - -

Fracción 0,164 14,58 mg/mL 0,055 2,93 mg/mL

globulinas

Fracción 0,090 8 mg/dL 0,119 6,33 mg/mL

albúminas

Nota: no se realizó el suero ya que no había.

Todos los reportes deben incluir también el fundamento de los métodos de forma
esquemática y si hay otras preguntas en el manual.
Cinética enzimática, GOD

Aquí tiene resultados de la práctica de cinética enzimática, para utilizarlos como si lo

hubieran hecho de forma presencial.

Transcurso de la reacción en el tiempo

Resultados
1. Con los siguientes datos obtenidos en el laboratorio, represente gráficamente Abs
505 vs. tiempo de la reacción, para observar el progreso de esta. Ejes con título y unidades
correctas. Luis PW

2. Según el gráfico ¿la transformación de sustrato en producto es lineal a lo largo de

todo el tiempo de reacción? Luis PW

Sí, se observa una constante transformación de sustrato en producto a lo largo del

tiempo de 0 min a 3 min.
3. Si el gráfico no fuera lineal al final del tiempo de reacción ¿a qué se podría deber?
Luis PW

A la presencia de una planicie, por ser tiempo es probable que todo el sustrato se
haya transformado en producto.

4. ¿Cómo se debe utilizar la información obtenida de este experimento para la

selección del tiempo del ensayo estándar de la glucosa oxidasa? Luis PW

Según la información obtenida en este experimento para la glucosa oxidasa, se

podría seleccionar un tiempo dentro del rango de 1 min, 2 min o 3 min. Ya que a lo
largo de estos intervalos de tiempo hay una constante transformación de sustrato a
producto.

Efecto de la temperatura

Resultados

5. Con los siguientes datos de absorbancia obtenidos en el laboratorio, calcule la

actividad en cada temperatura y represente gráficamente Actividad vs. Temperatura. Ejes
con título y unidades correctas.
Coloque la imagen del gráfico a la derecha. Luis PW

Tubo Abs 505 Abs 505 DAbs 505 Actividad

# t=0 t=1min (U/mL)

1 0,051 0,66
0,055 0,106

2 0,139 1,79
0,065 0,204

3 0,199 2,57
0,071 0,270

4 0,226 2,91
0,069 0,295

5 0,001 0,01
0,045 0,046

Análisis:
6. ¿Por qué aumenta la velocidad de la reacción cuando se incrementa la temperatura?
MEYYYYY

● La energía cinética empieza a aumentar conforme aumentamos la temperatura

en un rango en el cual no supere la temperatura máxima para evitar que la
enzima se desnaturaliza.
7. ¿Por qué disminuye la velocidad de la reacción cuando aumenta la temperatura aún
más? ¿Por qué la temperatura muy alta tiene este efecto sobre la actividad de las enzimas?
MEYYYYYY

● Cuando se aumenta demasiada la temperatura llega un punto en el cual la

enzima se desnaturaliza y su velocidad comienza a disminuir.

Efecto del pH Resultados

8. Con los siguientes datos de absorbancia obtenidos en el laboratorio, calcule la actividad

en cada pH y represente gráficamente Actividad vs. pH. Ejes con título y unidades
correctas. (Kenneth)

Tubo pH Abs 505 Abs 505 △ Abs 505 Actividad

t=0 t=1 (U/mL)

1 5 0,043 0,053 0,010 0,13

2 6 0,059 0,128 0,069 0,89

3 7 0,068 0,246 0,18 2,3

4 8 0,071 0,233 0,16 2,1

5 9 0,068 0,166 0,098 1,7

Análisis:

9. ¿Por qué influye el pH en la actividad de las enzimas? MEY

● Cuando se tiene un pH ácido hay mayor cantidad de protones, el punto

isoeléctrico cambia, grupos funcionales se protonan y quedan cargados con
cargas positivas. Esto provoca que su conformación cambie y genere que el
sustrato no se pueda unir o que pierda la afinidad ya que la estructura
tridimensional cambió.
10. ¿Cuál sería el pH óptimo de la GOD, según estos resultados? ¿Coincide con lo
esperado? Acerca de la GOD: (sofi)
● Según los datos el pH en el que se observa mayor actividad de la enzima es en
el pH 7, es decir a un pH neutro, más ácido o más alcalino y dicha actividad
decrece, lo cual concuerda con los rangos óptimos de la actividad de la
enzima, los cuales van de 4 a 7, ya que la composición del buffer y otros
compuestos presentes en solución afectan la actividad, cabe mencionar que
otras fuentes dan el pH óptimo de la GOD en 5.5 en cuyo caso si habría una
gran diferencia entre los resultados y lo esperado

11. ¿Cómo o para qué se utiliza la glucosa oxidasa en la clínica? (sofi)

● La glucosa oxidasa es utilizada para la determinación de sustancias. En el

reactivo de determinación de glucosa, la enzima glucosa oxidasa transforma
rápidamente toda la glucosa que se encuentra en la muestra en
gluconolactona y H2O2, que a su vez, mediante la ayuda de otras enzimas
presentes en el mismo reactivo, reacciona con ciertos cromógenos,
produciendo un compuesto coloreado.

12. ¿Esta enzima está presente en algún tejido humano? ¿De dónde se obtiene
normalmente esta enzima? (sofi)
● Esta enzima se obtiene de los organismos Aspergillus niger y Penicillium glaucum,
posterior de esto se purifica para utilizarse en diversas aplicaciones, en el cuerpo
humano no existe la GOD.

Cinética enzimática, Colinesterasa

Utilice los resultados obtenidos por todos los estudiantes de la mesa en la práctica
presencial, para completar esta parte del reporte.

Efecto de la concentración de sustrato:

1. Reporte los resultados y cálculos en los espacios correspondientes: MEYYYY

2. Grafique actividad enzimática vs concentración de sustrato (no el volumen).

3. Representar el gráfico de Lineweaver y Burk, 1/v vs. 1/[S]. NOTA: Hacerlo en Excel, se
debe hacer sin línea, solo con los puntos. Hacer clic derecho en un punto para agregar una
línea de tendencia lineal, que corte el eje x y el eje y. También se debe alargar el eje x hacia
el lado negativo hasta donde la recta cruza el eje. Presentar en el gráfico la ecuación de la
recta y el R2.

4. Calcule los parámetros cinéticos de la enzima: Km y Vmax, teniendo en cuenta que el

punto de corte de la recta con el eje x es -1/Km, y el punto de corte con el eje y es 1/Vmax.
NOTA: En Excel, determinarlo mediante la ecuación de la recta. En el siguiente enlace
(https://www.youtube.com/watch?v=LunDARY_i80) se explica cómo alargar la recta para
que toque el eje ¨X¨, así como el cálculo de Km y Vmax.

5. ¿A qué se debe que la velocidad deje de aumentar cuando la cantidad de sustrato es

muy alta? ¿Cómo se le llama este efecto? (Kenneth)
R/ Al tener la concentración de sustrato elevada va haber una saturación por parte
de los sitios activos de la enzima y de esta manera dejaría de aumentar la velocidad.

6. Si se hiciera este mismo experimento con dos sustratos diferentes (propioniltiocolina y

acetiltiocolina), se determinarían dos Km diferentes. ¿Cómo se interpretaría estas
diferencias en términos de la afinidad de la enzima por uno y otro sustrato? (Kenneth)

R/ Al tener una diferente km esto representa que se necesita una diferente

concentración de sustrato para llegar a la mitad de la velocidad máxima por tanto
esto se traduce en que uno de los 2 sustratos va a ser más afín a la enzima.

Efecto de la cantidad de enzima:

7. Reporte los resultados en los espacios correspondientes MEYYY

Tubo Vol de suero Abs 405 Abs 405 △Abs Actividad

(μL) t=0 t=1 405/min (U/mL)

1 20 0,104 0,416 0,312 2,87

2 50 0,298 0,792 0,494 4,54

3 100 0,261 1,510 1,25 11,5

4 200 0,268 2,550 2,28 21,0

8. Grafique actividad enzimática vs concentración de enzima. Sofi

9. Describa de un modo sencillo el efecto de la cantidad de enzima en la velocidad de la

reacción, según se observa en el gráfico Actividad vs. cantidad de enzima. ¿El aumento es
lineal o se curva al final? Sofi
● La velocidad de la reacción aumenta cuando hay mayor concentración de enzimas
(en este caso la cantidad de uL de suero diluido). En el gráfico se observa como al
aumentar la cantidad de suero también prolifera la actividad enzimática, generando
así un aumento lineal.

10. Si se observara una curva cuando la cantidad de enzima es muy alta, ¿a qué se
debería? (Kenneth)
R/ La curva va en aumento ya que entre más enzima más actividad hay, debido a que
hay un punto Vmax en que se gasta el producto y no hay sitios activos para la
enzima.

11. ¿A qué se debe el incremento de la velocidad cuando aumenta la cantidad de enzima

presente?
R/Todo esto se debe a que hay mayor cantidad de sitios activos en los sustratos,
entonces esto provoca que haya mayor actividad, pero si tienen las condiciones
necesarias.

Efecto de los posibles inhibidores:

12. Reporte los resultados y cálculos en los espacios correspondientes (KARINA)

Tubo Posible Abs 405 Abs 405 △ Abs Actividad Volumen % de

inhibidor t=0 t=1 min 405 (U/mL) (μL) actividad
 1 Ninguno 0,438 1,028 0,590 5,42 0 100
(control)

2 Quinidina 0,321 0,578 0,257 2,36 20 43,5

10ppm

3 Quinidina a 0,332 0,465 0,133 1,22 40 22,5

10 ppm

4 CuSO4 0,5% 0,357 0,549 0,192 1,76 20 32,5

5 CuSO4 0,5% 0,439 0,726 0,287 2,64 40 48,7

6 KCl 0,2M 0,397 0,953 0,556 5,11 20 94,3

7 KCl 0,2M 0,423 1,027 0,604 5,55 40 102

13. Calcule el % de inhibición para cada concentración de los diferentes inhibidores

(KARINA)

Tubo Posible inhibidor y su volumen Posible inhibidor y su % de

concentración en el tubo inhibición

1 Ninguno (control) Ninguno (control) 0

2 Quinidina 10ppm-- 20 (μL) Quinidina: 0,16 56,46

3 Quinidina a 10ppm--40 (μL) Quinidina: 0,32 77,49

4 CuSO4 0,5%--20 (μL) CuSO4: 0,008% 67,53

5 CuSO4 0,5%--40 (μL) CuSO4: 0,016% 51,29

6 KCl 0,2M--20 (μL) KCl:3,2 mM 5,72

7 KCl 0,2M--40 (μL) KCl: 6,4 mM 2,4

14. Represente en un gráfico de barras el efecto de las sustancias en la actividad de la

enzima, similar al propuesto en el manual de laboratorio. (En el eje “y”, 100% corresponde
al valor de la actividad del tubo control, en el cual la cantidad de solución de inhibidor es
cero). (Karina)
15. Investigue el posible tipo de inhibición que ejercen estas sustancias. MEYYY
R/ La quinidina es un inhibidor competitivo de la enzima colinesterasa, en el gráfico
podemos observar que ambos son inhibidores ya que disminuyen la actividad
enzimática, el CuSO4 disminuye menos la actividad enzimática que la quinidina, pero
ninguno de los dos fue activador.
↓
16. Discuta y justifique si los datos y los gráficos obtenidos para los diferentes parámetros
eran los esperados. Explique la razón tanto si obtuvo resultados esperados como si no los
obtuvo. (Kenneth)

R/ Sustancias como la quinidina que se esperaba tener un efecto inhibidor

efectivamente se apreció una reducción en el porcentaje de actividad de la
colinesterasa. El CuSO4 al 1% tuvo cierta actividad inhibidora al agregar 20 mL, pero
al agregar 40 mL se esperaría una actividad inhibidora más fuerte, sin embargo, esto
no fue así, esto se puede atribuir al hecho de una mala lectura a la hora de detener el
cronómetro al minuto transcurrido o al contrario a la hora de leer la actividad a t = 0.
Por último, el KCl parece tener un efecto potenciador sobre la actividad de la enzima,
porque lejos de inhibir su acción, fue más alta incluso que la del control.

Con respecto al efecto en la cantidad de la enzima, si se obtuvieron los resultados

esperados ya que la actividad enzimática aumenta conforme aumenta la cantidad de
la enzima. En tubo 5 hubo un inconveniente ya que se llegó al valor máximo que
puede leer el espectrofotómetro. Con respecto al efecto de los inhibidores, se obtuvo
un resultado no esperado con respecto al KCL 0,2 M, puesto que teóricamente esta
sustancia no debería haber inhibido el sustrato (Butiriltiocolina 30mM), sin embargo,
en los resultados podemos apreciar cómo disminuyó la actividad. Con respecto al
efecto de la temperatura, el resultado obtenido fue el esperado. Debido a que a bajas
y altas temperaturas la enzima pierde su función (al ser desnaturalizada), obteniendo
el gráfico esperado donde podemos apreciar la baja de la actividad enzimática. Con
respecto a la influencia de la concentración de sustrato y determinación de Vmax y
Km también fueron los esperados ya que se puede observar en el gráfico de
“Actividad vs [S]” de la pregunta 4 cómo aumenta la velocidad de reacción al
incrementar la concentración de sustrato en los diferentes experimentos.
 1. Presentar los cuatro gráficos con los datos que se obtuvieron en su mesa de
laboratorio de las 4 diluciones diferentes de una misma bebida.

Explicar brevemente cuáles no eran adecuadas para calcular el IC50 y cuáles sí y por qué

Los gráficos más indicados para calcular el IC50 son el gráfico 2 y el gráfico 3, debido a que
por el comportamiento lineal que tiene, nos permite interpretar con mayor facilidad y con
más precisión la mitad de la absorbancia, y así calcular el volumen necesario para llegar a
ese punto, ya que la presencia de los antioxidantes en la bebida no estaban ni tan diluidos
ni tan concentrados, lo que nos permite tener un rango adecuado para su manipulación;
mientras que los gráficos 1 y 4, al utilizar las muestras más diluidas y más concentradas, es
decir los extremos, su comportamiento de linealidad es muy impreciso, es por esto que para
calcular el IC50 no es recomendable utilizar estos gráficos.

2. Elaborar un solo gráfico con los datos de 2 muestras diferentes: la de su mesa y

una más. Rotulado correctamente (unidades, ejes, leyenda), incluye la ecuación de
la recta.
 3. Calcular el IC50 de esas dos muestras con la ecuación de la recta (mostrar los
cálculos).

y = -0,0793x + 0,818

0,450 = -0,0793x + 0,818

X = 4,64

4. Recopilar en la tabla los IC50 de cuatro de las muestras diferentes que se

midieron en el laboratorio e indicar cuál presenta mayor actividad antioxidante
según este método. Investigar y anotar en la tabla cuál o cuáles son los
antioxidantes que se espera que estén presentes en cada muestra.

Muestra IC50: Vol Antioxidantes presentes

(µL)

1. Vino 2,72 Polifenoles como ácidos fenólicos y

flavonoides

2. Juego de 9,94 Vitamina C, Vitamina A

Naranja

3. Té verde de 4,64 Vitamina C, Vitamina E, carotinoides,

manzana polifenoles

4. Juego de 15,96 Polifenoles (quercetina, flavonoides)

manzana

Muestra con mayor capacidad antioxidante: Vino

5. Explique qué es el DPPH y el fundamento del método.

El radical libre DPPH es utilizado para comparar la capacidad antioxidante de alimentos,

bebidas o suplementos de consumo común, que contienen moléculas presumiblemente
antioxidantes. El DPPH es un radical libre que puede obtenerse directamente sin una
preparación previa
Este radical en metanol forma una solución de color púrpura o morado, con un pico máximo
de absorción a 517nm. Al reaccionar con un antioxidante, cambia la estructura de la
molécula, y el color de la solución se vuelve amarillo. La disminución de la absorbancia a
517nm es proporcional a la concentración de antioxidantes o a la capacidad antioxidante de
la muestra de alimento o bebida. Este método, se basa en la reducción de la absorbancia
medida a 515 nm del radical DPPH•, por antioxidantes. Con modificaciones el método se
basa en la medida de la absorbancia del radical DPPH• 100 µM (3,9 mL) disuelto en metanol
al 80%, a la longitud de onda de 517 nm. Se añade 0,1 mL de la muestra o patrón, la
mezcla se homogeniza cuidadosamente, y se mantiene en la oscuridad durante 30 minutos.

Las medidas de absorbancia a 517 nm se realizan antes de añadir la muestra (A0) y

pasados los 30 y 60 minutos (Af). La concentración de DPPH• en el medio de reacción se
calcula a partir de una curva de calibración obtenida por regresión lineal.
 1. Calcular la concentración de MDA en mM (µmol/L), utilizando la fórmula.

Abs 532nm Resultado (µmol/L)

Paciente A 1,186 38,01

Paciente B 0,141 4,519

Paciente C 0,548 17,56

Paciente D 3,000 96,15

2. ¿Qué se puede interpretar, comparando los resultados de los tres pacientes?

● De los 4 pacientes, el sistema antioxidante que está funcionando
mejor es el del paciente B debido a que presenta un resultado de MDA
más bajo.

3. ¿Están establecidos los valores normales de MDA? Comente.

● Los valores normales de MDA no están establecidos debido a que
estos pueden variar mucho dependiendo de la población.

4. Explicar el fundamento del método y cada parte de la fórmula para calcular la

concentración de MDA:
Fundamento del método: La MDA nos indica la cantidad de peroxidación lipídica del
paciente. Entre más alta sea esta mayor cantidad de radicales libres se encuentran
en el paciente. Eso nos refleja que entre mayor de el resultado de la MDA menor va
a ser el equilibrio que logra el sistema antioxidante de la persona
a. ¿Por qué se multiplica por 106?
● Se multiplica por 106 para que el resultado nos de en µM
b. ¿Por qué se divide entre 1,56 x 105?
● Se divide entre 1,56 x105 ya que es una constante. Este número
solo lo veríamos si nos lo indican
c. ¿Por qué se multiplica por 2,5 y se divide por 0,5?
● En esta fórmula se multiplica por 2,5 que es el volumen final del
tubo. El volumen final del tubo es la suma de los volúmenes del
suero, ácido TCL, buffer Tris y ácido tiobarbitúrico. Puede cambiar
dependiendo del procedimiento y volúmenes usados en laboratorio
● Se divide entre 0,5 debido a que es el volumen utilizado en la
muestra. Puede cambiar dependiendo del procedimiento
1)

¿Cuál es la concentración de ADN obtenida con cada método para cada tipo celular?
(complete el siguiente cuadro). Asuma la épsilon que se dio en la discusión virtual.

Método 1 Método 2 Método 3

115 60 32,5

60 95 38,5

38 47,5 49,5

b) Para cada tipo celular, ¿con cuál metodología se extrae la mayor cantidad de ADN?

Cultivo E. coli: método 1

Sangre: método 2

Células epiteliales: método 3

c) ¿Cuál es la relación Abs260/Abs280 obtenida con cada metodología para cada tipo
celular? (complete el siguiente cuadro)

Método 1 Método 2 Método 3

1,67 1,71 0,87

 0,63 1,94 1,15

0,87 1,86 1,48

d) Para cada tipo celular, ¿con cuál metodología se obtiene el ADN más puro? Cultivo
E.coli: método 2
Sangre: método 2
Células epiteliales: método 2

e) Para cada tipo celular, ¿cuál metodología escogería para realizar la extracción de ADN y
por qué?

Cultivo E.coli: Protocolo con Kit

Sangre: Protocolo con Kit
Células epiteliales: Protocolo con Kit

La decisión dependería del costo disponible para trabajar.

El método tradicional tiene un costo más bajo, pero cuenta con más interferentes, requiere
de más experiencia para llevarlo a cabo y que se den resultados confiables.
Por otro lado el método de kit tiende a ser más estandarizado y automatizado, además
presenta un mayor rendimiento, por lo cual si está al alcance, se escogería la metodología
de Kit comercial.

2) Usted tiene tres cultivos de tres bacterias distintas, pero desconoce cuántas moléculas de
ADN tienen y su tamaño. Para averiguar esto, extrae ADN, y realiza una corrida
electroforética. Luego de la corrida, obtiene la siguiente imagen:

I. ¿Qué se obtuvo de la extracción de ADN de la bacteria 1?

Con esta bacteria se puede observar que sus moléculas son grandes a comparación con
las otras. Debido a su posición, esto indica que tiene el mayor tamaño de molécula, por lo
tanto no pudo avanzar más, lo podemos ver gracias al marcador de pares de bases.
también con el grosor de la banda se puede ver que hay una concentración elevada de ADN

II. ¿Qué se obtuvo de la extracción de ADN de la bacteria 2?

En el caso 2, esta concentración de ADN de la bacteria 2 se encuentra justamente

en el medio de ambas pruebas, lo que indica que su tamaño es menor que la
bacteria 1, pero mayor que la bacteria 3. En el caso de su concentración está en
igual proporción debido a que el grosor de la banda no cambió en comparación con
la bacteria 1
 III. ¿Qué se obtuvo de la extracción de ADN de la bacteria 3?
Evidentemente, esta bacteria tiene la menor tamaño, pero igual que las anteriores su
concentración de ADN se mantuvo igual al de las otras bacterias.

IV. ¿Hay posibilidad de que alguna de las tres bacterias sea la misma? Explique
brevemente
Creemos que no pueden ser las mismas bacterias debido a que cada una se comportó
diferente según sus tamaños moleculares. Por ende son materiales genéticos diferentes

V. ¿Considera que hay algún error en el proceso de extracción o electroforesis del

ADN? Explique brevemente

Es posible que sucediera algún tipo de contaminación con ARN, porque se observa que en
las bacterias 2 y 3 tuvieron unas bandas más transparentes o también puede significar una
tendencia de hacer como un tipo de barrido o degradación (se le conoce como smear)y eso
evidencia un error

3. Compare el método de extracción tradicional con el realizado con un kit. Considere en la

comparación no solo ventajas de costos y tiempos, sino el tipo de reactivos y moléculas
usadas en cada una de las fases de extracción.

Extracción con Kit:

● su rendimiento se maneja prácticamente en mg, porque son cantidades muy
pequeñas.
 ● evita la manipulación de materiales o sustancias tóxicas.
● su duración es muy corta aproximadamente 3h.
● Este método es más caro.
● usualmente los resultados son más íntegros.
● como hay menos manipulación se logra desperdiciar menos y reducir los errores.
extracción tradicional:
● Su rendimiento es de mg a g.
● se tiene myor manipulación de sustancias tóxicas.
● puede durar varios días en obtener el resultado debido a tantos pasos por realizar.
● es un poco más barato, se puede usar mientras cumpla con las expectativas
los resultados no siempre pueden ser íntegros