Métodos de Determinación de Hormonas tiroideas

Inmunoensayo

Inmunoensayo es una prueba que usa complejos de anticuerpo y antígeno como medio
para generar un resultado perceptible. Un complejo anticuerpo: antígeno también es
conocido como inmuno-complejo. “Inmuno” se refiere a una respuesta inmunológica
que hace que el cuerpo genere anticuerpos, y “ensayo” se refiere a una prueba.
Entonces, un inmunoensayo es una prueba que utiliza inmunocomplejos cuando se
unen los anticuerpos y los antígenos

Categorías de las Técnicas de Inmunoensayo

Inmunoensayo competitivo

En los formatos competitivos, el analito sin marcar (generalmente antígeno) en la

muestra se mide por su capacidad para competir con un antígeno marcado en el
inmunoensayo. El antígeno sin marcar bloquea la capacidad del antígeno marcado de
unirse puesto que ese punto de unión en el anticuerpo ya se encuentra ocupado.

Inmunoensayo no competitivo (sándwich)

Los formatos de ensayo no competitivos generalmente proporcionan el nivel más alto

de sensibilidad y especificidad del ensayo y se aplican a la medición de analitos críticos
como pueden ser los marcadores cardíacos y de hepatitis. A este formato se lo conoce
como ensayo “sandwich” ya que el analito está unido (como un sandwich) entre dos
reactivos de anticuerpo muy específicos

Inmunoensayos homogéneos no requieren la separación de los complejos no unidos de

los complejos unidos y de ahí que sean más rápidos y más fáciles de llevar a cabo que
los inmunoensayos heterogéneos.

Inmunoensayos heterogéneos requieren la separación de los complejos no unidos, a

menudo utilizando un reactivo de fase sólida como una partícula magnética o una
esfera plástica.
Inmunoensayo por quimioluminiscencia
Los compuestos quimioluminiscentes también pueden usarse para
marcar analitos. Los compuestos quimioluminiscentes son distintos
de los marcados radioactivos, fluorescentes, y enzimáticos.
Una marca quimioluminiscente produce luz cuando se lo combina
con un reactivo “trigger”. Aunque muchos instrumentos en el
laboratorio clínico se basan en la tecnología quimioluminiscente, el
tipo específico de marca varía y a menudo está patentado, y por
ello puede variar la performance.
Los pasos de la reacción para ChemiFlex
® (marca comercial de la
versión de CMIA de Abbott) son muy similares a los de MEIA
descriptos anteriormente, y se los compara en la Figura 2-10.
Ambos utilizan la tecnología de ensayo sándwich no competitiva
para medir analitos. Recuerde que en
estos dos inmunoensayos
no competitivos, la
concentración de señal
medida es directamente
proporcional a la
concentración de analito
presente en la muestra.
Las técnicas de MEIA y CMIA usan micropartículas para fijar
anticuerpos, pero existen otras similitudes y diferencias también. La marca, la etapa de
separación y la tecnología de
medición difieren entre estas dos técnicas.
Inmunoensayo por fluorescencia polarizada
Inmunoensayo por Polarización de Fluorescencia (FPIA) es un tipo
de inmunoensayo homogéneo competitivo por fluorescencia. Con
la unión competitiva, el antígeno de una muestra y el reactivo
marcado antígeno-fluoresceína (AgF) compiten por los puntos de
unión en el anticuerpo. Como inmunoensayo homogéneo, la
reacción se lleva a cabo en una solución de reacción simple, y el
complejo Ab-AgF no requiere un paso de lavado para separarlo de
la marca AgF “libre”.
FPIA utiliza tres conceptos claves para medir analitos específicos
en un formato homogéneo: fluorescencia, rotación de moléculas en
la solución y luz polarizada.
Fluorescencia: La fluoresceína es una marca fluorescente. Absorbe
la energía de la luz a 490nm y libera esta energía a una longitud de
onda superior (520nm) como luz fluorescente.
Rotación de Moléculas en la Solución: Las moléculas más grandes
rotan más lentamente en la solución que las moléculas más
pequeñas. Este principio puede utilizarse para distinguir entre la
molécula más pequeña antígeno-fluoresceína: AgF, que rota
rápidamente, y los complejos Ab-AgF más grandes , que rotan
lentamente en la solución.
Luz Polarizada: La tecnología de polarización por fluorescencia distingue la marca
antígeno-fluoresceína (AgF) del antígenofluoresceína (Ab-AgF) unido al anticuerpo por
sus diferentes propiedades de polarización por fluorescencia cuando son expuestos a
la luz polarizada. La luz polarizada describe ondas de luz que solamente están
presentes en un plano simple del espacio. Cuando la luz polarizada es absorbida por la
molécula más pequeña AgF, la AgF tiene la capacidad de rotar su posición en la
solución rápidamente antes de que la luz sea emitida como fluorescencia. La luz
emitida se liberará en un plano diferente del espacio de donde fue absorbido y por
consiguiente se la denomina luz no polarizada. Con el complejo Ab-AgF de mayor
tamaño, la misma luz polarizada absorbida se libera como fluorescencia polarizada ya
que cuanto más grande sea el complejo Ab-AgF no rota tan rápidamente en la solución.
La luz es liberada en el mismo plano del espacio como energía de la luz absorbida, y el
detector puede medirla. Los resultados de FPIA se muestran como una curva inversa
por cuanto a valores bajos de analito del paciente producen una señal más alta (en
este caso, la señal es luz polarizada).
Una señal alta a niveles bajos de analitos del paciente dan como resultado un ensayo
muy sensible
Ensayo inmunoadsorbente ligado a enzima (ELISA)
Un ELISA es un ensayo inmunológico comúnmente utilizado para medir anticuerpos o
antígenos, incluidas proteínas o glicoproteínas, en muestras biológicas. Como otros
inmunoensayos dependen de la unión de anticuerpos a sus objetivos para facilitar la
detección.
Tipos de diagrama de prueba ELISA
Con un ELISA directo, los antígenos o anticuerpos en una muestra se adsorben
directamente en la placa de prueba de una manera no específica. A continuación, se
aplica a los pocillos un anticuerpo de detección conjugado o un antígeno específico
para la diana. A continuación, se realiza una detecciónel sustrato se utiliza para
producir un cambio de color medible que se puede cuantificar en un lector de placas.
Como este ensayo tiene pocos pasos, es más rápido y ofrece menos oportunidades
para la introducción de errores que los otros métodos ELISA. Sin embargo, como el
paso de adsorción no es específico, el ruido de fondo puede ser alto. La ausencia de
un anticuerpo secundariopaso significa que no hay amplificación de la señal, lo que
reduce la sensibilidad del ensayo. También requiere la creación de anticuerpos /
antígenos de detección conjugados para cada objetivo requerido.
prueba ELISA indirecta
desarrollado originalmente en 1978 5 para la detección de albúmina sérica humana, el
ELISA indirecto, o iELISA, funciona de manera muy similar al ELISA directo, excepto
por la adición de un paso de anticuerpo secundario. Esto permite la amplificación de la
señal de prueba, superando la limitación de laELISA directo. También niega la
necesidad de anticuerpos / antígenos de detección conjugados específicos del objetivo,
ya que el anticuerpo secundario conjugado solo necesita ser específico de la especie
para el anticuerpo primario. Cuando los antígenos totales de la muestra se unen a las
placas, como el ELISA directo, el ruido de fondo permaneceSin embargo, si el ensayo
se utiliza para la detección de anticuerpos de la muestra, el antígeno diana purificado
se recubre en las placas, y el anticuerpo primario proviene de la muestra. Esto reduce
en gran medida el ruido de fondo y, en consecuencia, estos ensayos son los más
populares para determinar anticuerpos.títulos en muestras.
Las desventajas del ELISA indirecto incluyen un protocolo más largo con más
oportunidades de errores y potencial de reactividad cruzada con el anticuerpo
secundario
ELISA sándwich
desarrollado en 1977 6 como su nombre indica, el ELISA sándwich empalma el
antígeno entre los anticuerpos. La técnica puede emplear el formato ELISA directo o
indirecto el ELISA sándwich que se muestra arriba se basa en el ELISA indirecto
excepto que en lugar de la unión no específica de antígenosa la placa de ensayo, el
anticuerpo de captura hace que este sea un proceso específico. Esta combinación
mejora aún más la sensibilidad y la especificidad del ensayo.
Sin embargo, requieren la determinación de pares de anticuerpos de captura y
detección compatibles para funcionar eficazmente con lo que la reactividad cruzada
puede ser problemática. Este ensayo también suele tener la mayoría de los pasos, lo
que ofrece una mayor oportunidad de error. Debido a la naturaleza selectiva dela etapa
de unión al antígeno, los ELISA sándwich son particularmente útiles cuando el antígeno
está en una mezcla compleja ya que no se requiere la purificación del antígeno.
ELISA competitivo
Un ELISA competitivo, también conocido como ELISA de inhibición o ELISA de
bloqueo, es posiblemente la más compleja de las técnicas de ELISA. Desarrollada
originalmente en 1976 7 para la detección de coriogonadotropina humana, el ensayo
funciona detectando la interferencia a un nivel de señal de salida esperado,
produciendo una relación inversa. Cuanto más objetivo haya en la muestra aplicada,
menor será la señal de salida del ensayo. Múltiples formatosson posibles para lo cual
los otros tipos de ELISA se pueden adaptar a un formato competitivo. Sin embargo, hay
dos principios generales; el antígeno o anticuerpo de la muestra compite con una
referencia por unirse a una cantidad limitada de anticuerpo o antígeno marcado,
respectivamente. Alternativamente, muestrael antígeno o el anticuerpo pueden
competir con una referencia marcada por unirse a una cantidad limitada de anticuerpo
o antígeno, respectivamente.
El ELISA competitivo tendrá algunas de las mismas ventajas y limitaciones que el
formato del que se ha adaptado. Sin embargo, puede ser útil cuando el antígeno es
pequeño, lo que limita la capacidad de dos anticuerpos para unirse al mismo tiempo,
como se requiere para elsándwich ELISA, o cuando solo hay un anticuerpo disponible.
Radioinmunoensayos (IRMA)
El radioinmunoensayo o radioinmunoanálisis (o abreviado RIA del inglés
Radioimmunoassay) es un tipo de inmunoensayo o método radioinmunométrico que se
basa en la formación específica de los complejos antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) lo que le
dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los métodos radiológicos
(Isótopos radiactivos). La técnica ha sido prácticamente reemplazada por el método
ELISA el cual mide la unión Ag-Ac mediante colorimetrías en lugar de radiometrías.
Casi todas las moléculas pueden ser antigénicas y esto se usa para que los
anticuerpos puedan unirse a esa molécula y marcarla radiactivamente. Una buena
manera de provocar que una molécula sea antigénica está basada en que un hapteno
combinado con un coadyuvante da respuesta inmune.
El fundamento es muy sencillo:
Se mezcla una cantidad constante de antígeno marcado radioactivamente y una
cantidad constante de un anticuerpo para ese antígeno
Se produce la reacción entre antígeno (Ag) y anticuerpo (Ac) se separa la fracción de
antígeno que se ha unido de la que permanece libre se determina la radioactividad.
Si la muestra contiene además antígeno frío (no marcado), éste competirá con el
marcado para unirse al anticuerpo, y se observará un descenso en la medida de la
radioactividad
Este descenso es proporcional a la concentración de antígeno frío en la muestra.
RIA directo
El RIA se basa en la competencia existente entre el anticuerpo, un antígeno no
marcado y una cantidad conocida del antígeno marcado para formar los complejos
AgAc o Ag*Ac. Con estos tres componentes (Ag, Ag* y Ac) puede realizarse el ensayo
en el que manteniendo constante la cantidad de Ag* y Ac se observará que a mayor
cantidad de Ag menos Ag* queda unido a la cantidad fija de Ac (y por tanto menos
radiactividad), lo que permitirá relacionar la radiactividad con la concentración de Ag.
1Se obtienen anticuerpos específicos, para ello se inyectan en un animal pequeñas
cantidades en varias dosis del antígeno muy purificado. El animal generará anticuerpos
que podrán ser recogidos del plasma sanguíneo.
2Se marca el antígeno radiactivamente. El antígeno marcado debe seguir siendo
reconocible por el anticuerpo.
3Se añaden Ac a una placa de titulación y quedan unidos al soporte sólido, tras lo que
se agrega el Ag* en cantidad conocida y el Ag de la muestra problema.
4Se elimina el antígeno no unido por decantación y lavado, y se determina la cantidad
de marcaje unido.
5Se interpola el valor obtenido en la recta de calibración que debe haberse realizado
con anterioridad.
6Para la realización del calibrado se dispone de varios tubos en los que se añaden una
cantidad fija de Ac y de Ag* y una cantidad variable de Ag a la que se añade suero
normal para enrasar al mismo volumen. Así obtendríamos una tabla como la adjunta.
RIA de inhibición
Usado cuando no se puede marcar el antígeno.
1Se inmoviliza una cantidad constante de antígeno en un soporte sólido. Se suele
saturar con BSA, leche en polvo o caseína para que no se una nada más al soporte.
2Se añade una cantidad constante de Anticuerpo marcado y el antígeno frío a medir (o
de calibrado). En este paso se establece una competencia en la que el Ac se une al Ag
fijo al soporte o al problema.
3Se eliminan el anticuerpo no inmovilizado y el antígeno soluble y se determina la
cantidad de anticuerpo marcado que se ha inmovilizado.
4Se construye una curva de calibrado representando la cantidad de anticuerpo
marcado inmovilizado frente a la concentración de antígeno soluble añadida o bien se
interpola la radiactividad medida en esta curva de calibrado.
RIA de sándwich (IRMA)
1Se inmoviliza una concentración fija del Ac1 (no marcado) en un soporte sólido. Tras
lo que se satura el soporte.
2Se añade la muestra problema (o de calibrado) de Ag.
3Se añade Ac*2 (marcado) que se una a otro epítopo del Ag.
4Eliminación del Ac*2 no unido.
5Se determina la cantidad de anticuerpo marcado unido.
6A partir de una recta patrón se interpola el valor obtenido para saber la concentración
de Ag presente o bien se realiza la recta de calibrado
https://es.wikipedia.org/wiki/Inmunoensayo
http://www.alergomed.org/uploads/1/0/0/2/10021998/lectura_prctica_-
_inmunoensayos_1.pdf
http://www.news-courier.com/analysis/articles/an-introduction-to-the-enzyme-linked-
immunosorbent-assay-elisa-test-350024
https://es.wikipedia.org/wiki/Radioinmunoensayo
http://www.ehu.eus/biomoleculas/isotopos/ria.htm