ELISA indirecto - PCR en

tiempo real
Estudiante: Constanza Valentina Mamani Laura
Grupo: I1
Dra. Norka Orihuela Tejerina
 Introducción-ELISA INDIRECTO
En ciencias biológicas, específicamente en el campo de la inmunología, la palabra
ELISA, es el acrónimo de Enzyme-linked immunosorbent assay o ensayo de
inmunoabsorbente ligado a enzimas, el cual es un método que permite la
cuantificación de un marcador de interés en una muestra biológica. Dicho marcador
puede ser un anticuerpo, una hormona, un péptido o una proteína.
 Principio Elisa Indirecto
Es un proceso de unión de dos pasos el cual implica el uso de un anticuerpo
primario y un anticuerpo secundario marcado. Esta prueba se basa en una placa de
micro titulación de poliestireno con 96 pocillos, que va de forma horizontal (1-12)
y vertical (A-H), en el fondo de cada pocillo se encuentra un anticuerpo
específico, en la que se agrega la muestra que contiene el virus, luego se le agrega
la enzima, que en este caso es la peroxidasa, y después el sustrato (tetrametil
benceno) que va a dar la reacción colorimétrica (reacción química).
 Fundamento de la ELISA INDIRECTO
¿Cómo funciona el método?
Un en ensayo ELISA requiere, en términos generales, de tres componentes esenciales: el antígeno a
detectar o cuantificar, un anticuerpo específico para ese antígeno conjugado a una enzima que genere
una reacción cuantificable y un sistema que permita estimar la cantidad de antígeno presente en la
muestra a partir de la reacción enzimática que se genere. El resto de detalles variará dependiendo del
tipo de ELISA.

El ELISA indirecto es un proceso de unión de dos pasos que implica el uso de un anticuerpo primario y
un anticuerpo secundario marcado. En este método, el anticuerpo primario se incuba con los pocillos de
una placa recubiertos con antígeno. A continuación, se agrega un anticuerpo secundario marcado que
reconoce el anticuerpo primario. Luego se agrega un sustrato para producir una amplificación de la
señal. Este método se utiliza comúnmente para diagnosticar infecciones por bacterias, virus o parásitos
y cuantificar los anticuerpos contra este antígeno extraño. La detección por ELISA indirecta es versátil,
ya que se pueden usar diferentes marcadores de visualización con el mismo anticuerpo primario. Dado
que se puede unir más de un anticuerpo marcado por objetivo de anticuerpo, se considera que el ELISA
indirecto es altamente sensible y más flexible que el ELISA directo. Sin embargo, puede producirse
reactividad cruzada y una señal no específica con el anticuerpo secundario.
Esquema simplificado de un ensayo ELISA
indirecto
 ¿Qué detecta la prueba Elisa Indirecto?
Detecta reacción antígeno-anticuerpo neutralizante del paciente, En el fondo del
pocillo un anticuerpo específico. Se le agrega la muestra que lleva el antígeno para
que reaccione con el anticuerpo.

• Cuando el ELISA es positivo quiere decir que se han detectado antígenos en la

muestra recogida, y por tanto hay gérmenes presentes.

• Cuando el ELISA es negativo no se han podido detectar antígenos y se considera

que la muestra no está contaminada.
 Utilidad de Prueba-ELISA
 Detectar la presencia de anticuerpos frente a patógenos específicos – ELISA de anticuerpos – Es el
uso más común.
 Determinar la exposición a un patógeno.
 Determinar el estado vacunal de un animal.
 Determinar el momento de la infección (cambio del nivel de anticuerpos) a lo largo del tiempo.
 Detectar la presencia de un patógeno objetivo a través de la detección de proteínas/antígenos del
patógeno objetivo – ELISA de antígenos.
 ¿Cómo se realiza la prueba?
Muestra y reactivos a 25ºC
durante 30 minutos
• 1. Preparación: Consiste en sacar el kit donde están los reactivos, placas y tubos de las muestras ya centrifugadas que se encontraban en
refrigeración. Se atempera el reactivo y muestra, hay que tener los materiales listos (pipetas calibradas, cubrir la mesa de trabajo con papel
absorbente y hacer el protocolo).
• 2. Dilución: Se debe colocar el disolvente de muestra para que de esta manera se proceda a repartir 100 microlitros en cada pocillo. Se hace el
muestreo que es donde se agrega 20 microlitros de la muestra con una pipeta en cada pocillo.
• 3. 1era incubación: Se pone a incubar la muestra en una estufa a 37°C durante 1h. En caso de que los anticuerpos estén en las muestras, estos se
unirán a los antígenos. En el fondo del pocillo se forma una unión Ag-Ac. Una vez terminada la incubación se retira el sobrenadante.
• 4. Lavado: Se saca la muestra de la estufa y se realizan 5-6 lavados con el tampón de lavado para retirar todo lo que no se unió a los antígenos
fijados en la placa.
• 5. Enzima: Se coloca la enzima peroxidasa que será específica a un epítopo de la Ig y se incuba a 37°C por 1h. Este conjugado se debe unir al
complejo que se formó previamente. Una vez terminada la incubación se retira el sobrenadante.
• 6. Lavado: Se realizan entre 5 a 6 lavados con el tampón (de lavado) para eliminar el conjugado que no se unió.
• 7. TMB (tetrametil benceno) sustrato: se fija el sustrato con la enzima que puede ser la enzima peroxidasa para que provoque la reacción química en
posterior (se hace azul)
• 8. 2da incubación: esta será durante 15 minutos en temperatura ambiente. El sustrato provoca una reacción química formando radicales que causan
un cambio de color (reacción colorimétrica).
• 9. Solución stop: Se coloca la solución de stop, el cual junto al TMB va a producir el cambio de color amarillo-anaranjado. Esta solución stop
desnaturaliza la enzima y estabiliza el color para que no se haga más amarillo.
• 10. Lectura de resultado: Se lee y analiza el resultado. Se los puede realizar de forma visual o con ayuda de un espectrofotómetro y colorímetro.
 Interpretación de Resultados

• Resultados positivos fuertes: Los pocillos de color naranja fuerte son positivos porque se presencia una reacción química
mayor, es decir va a haber bastante colorimetría. A más color mayor densidad óptica es decir entre 1500 a 3000,
aproximadamente una densidad óptica de 2500. Naranja fuerte: A2, A6, B1, B6, C1, C3, C4, C5, C6, D1, D5, E9, F1, F11,
G1, G3, H1, H3
• Resultados positivo débil e inespecíficos: los pocillos con color naranja bajo tendrán una densidad óptica de 1500. Los
pocillos de color beige son inespecíficos por la presencia de un color menos intenso u opaco. A menor color menor densidad
óptica es decir tendrá una densidad óptica entre 300 a 500 debido a que su colorimetría es menos intensa. Naranja bajo: A3,
A8, B2, B3, C10, D9, E1, E11, F2, F4, G1, G6, H2. Beige: B8, D6, D7, D10, D12, E2, E4, E5, E8, E10, F9, F12, G7, G8.
• Resultados negativos: Los pocillos sin color son resultados negativos, debido a que en el pocillo no existió anticuerpos
generados por el paciente ya que este nunca presentó la enfermedad. Si no hay color no hay densidad óptica es decir tendrá
una densidad óptica de 0 debido a que no cuenta con colorimetría.
 Ventajas y Desventajas
• Ventajas:
 · No se necesita de un observador experimentado.
 Alta sensibilidad
 Alta especificidad
• Desventajas:
• El alto costo de los equipos automatizados
• Marco de detección muy corto ·
• Algunos sustratos como ortho-fenilendiamina pueden ser cancerígenos
 Agentes infecciosos que pueden ser
diagnosticados con la técnica
*IMPORTANCIA DIAGNÓSTICA VIROLÓGICA*
Se utiliza para detectar anticuerpos específicos (IgM, IgG o Igs totales) en una
muestra para cuantificar las:
respuestas inmunitarias.
IgM especifica de rubéola, citomegalovirus humano, virus hepatitis A, virus
Epstein-Ba.
IgG o Igs totales para VIH y retrovirus.
 Introducción-PCR en tiempo real
• Son pruebas de detección de ácidos nucleícos a través de la Reacción en cadena de la Polimerasa o PCR

Uno de los permanentes e importantes retos en la actualidad es la correcta selección y realización de las pruebas
diagnósticas, su relación clínica, la evaluación con las características de transmisión y la interpretación de los
resultados. Es de suma importancia determinar el posible momento de transmisión para la elección de la técnica
que nos dará un resultado confiable y detectará los marcadores que permitan realizar el diagnóstico. Las pruebas
pueden ser directas, que nos permiten detectar los antígenos o partículas virales; o indirectas, mismas que nos
permiten la localización de inmunoglobulinas que nos proporcionarán información sobre la evolución en la que
se encuentra el paciente. En una primera fase de la infección, se pueden desarrollar pruebas directas con una
mejor efectividad, y en una etapa más avanzada la detección es realizada por pruebas indirectas.
 Fundamento de PCR en tiempo real
• La prueba de la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa en (RT-PCR o qRT-PCR (cuantificada en tiempo
real) en la actualidad es la técnica de referencia y de elección para el diagnóstico clinico, es una técnica molecular de
detección y amplificación de ácidos nucleicos, es decir de material genético, ARN en muestras biológicas clínicas.

• La ejecución de la RT-PCR se realiza en laboratorios de microbiología clínica, necesita personal experto en microbiología
molecular y medidas de bioseguridad. La muestra debe ser en primer lugar inactivada. La PCR es una técnica utilizada para
amplificar secuencias de ADN.

• Consta de dos fases: extracción y amplificación de los ácidos nucleicos. El ARN es monocatenario y muy inestable por lo que
primero debe transcribirse de forma inversa en ADN complementario (ADNc) utilizando una transcriptasa inversa.

• Posteriormente, se utiliza el procedimiento de PCR convencional para amplificar el ADNc. Se utilizan secuencias cortas de
ADNc, cebadores o primers, para seleccionar la parte del genoma a amplificar

• Cambios de temperatura permiten la duplicación de la secuencia del ADN que está siendo copiada, permitiendo la
producción de millones de copias de la secuencia estudiada en unas horas.
Reacción de la polimerasa en cadena
 Procedimiento de PCR-en tiempo real
• En infecciones graves se pueden recoger muestras de vías respiratorias bajas, esputo (si hay
expectoración) o de aspirado endotraqueal o bronquial y lavado broncoalveolar, en las que se
puede encontrar positividad hasta al cabo de 3 semanas tras el inicio de la enfermedad con el RT-
PCR. Para la precisión diagnóstica es necesario que todos los pasos del proceso de las muestras
(recogida, transporte, almacenamiento y procesamiento) sean correctos.
• Para la obtención de la muestra nasofaríngea, los hisopos nasofaríngeos son más estrechos y
flexibles que los orofaríngeos. Las torundas deben ser de dacrón o poliéster. El hisopo se introduce
en una de las fosas nasales y se desplaza por el suelo de la cavidad nasal siguiendo el tabique hasta
la nasofaringe, hasta la muesca de seguridad, sin forzar si se encuentra resistencia . Se gira la
torunda con suavidad durante 5-10 segundos. A continuación, se debe introducir el hisopo en un
medio de transporte adecuado, para virus o universal, romper el mango del hisopo por la muesca y
cerrar el tapón.
 Procedimiento de PCR-en tiempo real
• Las muestras se transportan en frío, a 4º C (3,7,8) embaladas en contenedores bajo normativa de Sustancia
biológica clase B.
 Ventajas y Desventajas
• VENTAJAS:

 LA PCR PERMITE PROCESAR SIMULTANEAMENTE UN ELEVADO NUMERO DE MUESTRAS.

 ES DE COSTO BAJO EN COMPARACION CON OTRAS MUESTRAS MOLECULARES

 PERMITE UN RESULTADO MAS ESPECIFICO PARA EL DIAGNOSTICO CLINICO

• DESVENTAJAS:

• ES LIMITADO
• PUEDE NO ESTAR DISPONIBLE DENTRO DE UN PERIODO CLINICAMENTE RELEVANTE
• SENSIBILIDAD DE LA PRUEBA: AL OBSERVARSE RESTOS INACTIVOS DE MATERAL GENETICO PUEDE SEGUIR
MARCANDO POSITIVO POR LO QUE PUEDE SER CONFUSO.
Agentes infecciosos que
pueden ser diagnosticados
con la técnica
1) SARs-Covid-2
2) VIH
3) VIRUS DE LA HEPATITIS B (VHB)
GRACIAS