Inmunofluorescencia indirecta: La inmunofluorescencia indirecta (IFI) es una de las tcnicas ms utilizadas en los estudios de autoinmunidad debido a su fcil manejo

y estandarizacin. Sin embargo, la lectura e interpretacin requieren de amplia experiencia. La tcnica se basa en el reconocimiento de los anticuerpos que reconocen estructuras antignicas celulares nativas. La interaccin se evidencia por medio de un anticuerpo antiinmunoglobulina humana, producido en conejo, cabra o cobayo, dirigido contra las fracciones constantes (Fc) de las inmunoglobulinas IgG, IgA y/o IgM. Este anticuerpo antiinmunoglobulina humano est conjugado o acoplado a un fluorforo (generalmente isotiocianato de fluorescena [FITC]). Los resultados del reconocimiento de los antgenos por los autoanticuerpos presentes en el suero, plasma o cualquier otro lquido, se evalan en un microscopio de epifluorescencia. Actualmente, la IFI se utiliza en los estudios de autoinmunidad para la deteccin de anticuerpos anti-DNA de doble cadena (DNAcd) o DNA nativo (DNAn) utilizando como sustrato Crithidia luciliae. Para la deteccin de anticuerpos que reconocen antgenos nucleares se utilizan como sustratos lneas celulares epiteliales humanas como las clulas HEp-2 o las clulas HeLa. En el caso de los anticuerpos contra componentes de los grnulos primarios y especficos de los polimorfonucleares o anticuerpos anticitoplasma de neutrfilos (ANCA), se utilizan neutrfilos fijados con etanol y formalina; y para los anticuerpos que reconocen antgenos rgano-especficos, se utilizan como sustratos cortes de tejidos especficos (v. g. tiroides, esfago, estmago, glndulas suprarrenales, glndulas salivales, etc.).
INMUNODDIFUSION DOBLE: La inmunodifusin doble de Ouchterlony es un mtodo inmunolgico sencillo y rutinariamente usado en el laboratorio clnico para la deteccin de antgenos o anticuerpos en una muestra biolgica. Es considerado el proceso estndar para la deteccin de Antgenos Nucleares Extraibles (ENA) Gracias a que las molculas de inmunoglobulina tienen por lo menos dos sitios para unirse con el antgeno, es decir son por lo menos divalentes; a que normalmente son policlonales y a que las molculas de antgeno tienen generalmente ms de un determinante antignico, el encuentro entre las dos poblaciones, l a de antgenos y la de sus inmunoglobulinas especficas, resulta en la formacin de una red tridimensional entre ellas. Esta red o complejo, Ag-Ig, facilita fagocitosis del antgeno in vivo ; y, siendo lo suficientemente grande para ser visible, se utiliza in vitro para demostrar la presencia de antgenos especficos para una Ig de especificidad determinada. Diversas tcnicas tales como, inmunodifusin radial, inmunoelectroforesis e inmunodifusin doble utilizan la formacin de complejos Ag-Ig para detectar antgenos. En este ejercicio haremos inmunodifusin doble.

En esta tcnica se prepara un gel de agarosa, en el cual se colocan, a una distancia de varios mm una de otra, las dos poblaciones. Tanto las inmunoglobulinas como los antgenos migran por difusin y en minutos, o pocas horas, se encuentran. Si hay especificidad entre ellas y estn presentes en las concentraciones apropiadas se forma en pocas horas, el complejo Ag-Ig que es visible como una lnea blanca. Esta lnea se forma en el frente del encuen tro de las dos poblaciones y es por lo tanto perpendicular a la direccin de migracin entre ellas. Generalmente se quiere comparar la presencia de antgeno en diversas muestras, entonces las diversas muestras se colocan a distancias equidistantes de la preparacin de Ig. Si dos preparaciones colocadas en la vecindad una de otra contienen el antgeno sus lneas de complejo Ag-Ig, tambin llamadas lneas de precipitacin, se fusionan y aparecen como un arco contnuo. Ensayo inmunoenzimatico: El ELISA es una de las tcnicas ms utilizadas para identificar o confirmar la especificidad de los anticuerpos presentes en las muestras de los pacientes con enfermedades autoinmunes. Adems, por su fcil estandarizacin, manejo y variedad de antgenos disponibles, ha desplazado notablemente a otras tcnicas como el radio inmune ensayo para la deteccin de anticuerpos anti-DNAcd (conocido tambin como prueba de Farr), ya que no utiliza radionclidos, lo que hace que sea una tcnica accesible y de bajo riesgo. Si bien existen diferentes tipos de ELISA, el mas utilizado en el laboratorio de diagnostico de autoinmunidad es el ELISA indirecto, el cual se fundamenta en el reconocimiento de los anticuerpos especficos presentes en las muestras de los pacientes, mediante un anti- uerpo dirigido ontra a regio n F hu ana de ua quier isotipo gG g o g e in usive de ua quier su ase gG gG gG gG g o g os anti uerpos anti-F esta n unidos a en i as o o la peroxidasa o la fosfatasa alcalina. Los antgenos utilizados en las placas de ELISA pueden ser nativos re o inantes antgeno o p eto o epopo espe fi o o sintti os eptopo espe fi o Despus de per itir a intera in de os anti uerpos de as muestras de los pacientes con el antgeno pegado a la placa de ELISA, se realizan lavados para eliminar los anticuerpos inespecficos y se agrega el anticuerpo antiinmuno globulina humana unido a enzima, permitiendo la interaccin por un tiempo determinado. Posteriormente, se adiciona la solucin que contiene el sustrato cromo gni o espe fi o de a en i a 0 , 5, 50 - etra eti en idina para a pero idasa o p-nitrofeni fosfato para a fosfatasa a a ina e ua a iara de o or en funcin de la cantidad de anticuerpos conjugados con la enzima y cuya cantidad depende de los anticuerpos del paciente que reconocieron al antgeno pegado a la placa. En otras palabras, la intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo del paciente unido al antgeno3 (fig. 4). La tcnica puede ser cualitativa si solo se requiere conocer si existen o no anticuerpos con reactividad por determinado antgeno o cuantitativa si se requiere conocer la cantidad de anticuerpos presentes en las muestras, para lo cual el ensayo debe incluir una curva patrn de reactividad especifica. El ELISA tiene como ventaja que no se necesita un equipo sofisticado para su lectura. Ensayo Luminomtrico Mltiple:

En los ltimos aos el ensayo luminomtrico mltiple (ELM) se ha vuelto popular, debido a que permite la deteccin de hasta 100 diferentes autoanticuerpos que reconocen el mismo numero de antgenos en una sola determinacin y con un volumen pequeo de muestra (aproximadamente 50 mL). Estas son las ventajas mas importantes del ensayo comparado con el ELISA, ya que para realizar el mismo nu ero de deter ina iones espe fi as por E S se requeriran 00 p a as y 5 de muestra. La tcnica es una variante del ELISA indirecto, pero la deteccin es distinta: en el ELISA se utiliza un compuesto cromogenico, en tanto que en el ELM la deteccin se realiza por fluorescencia, con lo que la sensibilidad del ensayo es mayor. El ELM se fundamenta en la deteccin n de anticuerpos que reaccionan contra antgenos especficos, los cuales recubren esferas que contienen diferentes proporciones de un fluorforo (combinaciones de un fluoruro rojo y otro infrarrojo). La determinacin de la cantidad de anticuerpo unido al antgeno se revela por la interaccin de un anticuerpo anti-inmunoglobulina humana conjugado on iotina osterior- ente se adi iona un onjugado estreptavidina-fi oeritrina E E ensayo se ee en un a u in etro instru ento que tiene e is o prin ipio que e ito etro de f ujo De anera reve Cuando se hacen pasar por un dete tor de f uores en ia as i ro esferas que ontienen os o p ejos antgeno-anti uerpo- estreptavidina- E e o orante de as i roesferas y a E se e itan por ha es de u de ongitudes de onda de 5 y n respe tiva ente a u de a ser que pasa por el filtro de longitud de onda de 635 nm excita al fluorforo de la microesfera, lo que permite la identificacin de los antgenos y el lser que pasa por el filtro de 488nm excita a la PE conjugada con estreptavidina, permitiendo la deteccin de a antidad de anti uerpo espe fi o presente en la muestra del paciente. Anticuerpos rgano especfico Mediante IFI se identifica la reactividad de los auto anticuerpos presentes en las muestras de pacientes con enfermedades auto- inmunes, los cuales reconocen antgenos espe fi os de deter inados rganos ara ara teri ar e o os antgenos especficos reconocidos por los anticuerpos, es necesario utilizar ELISA que ontienen os antgenos espe fi os ara a dete in de anti - cuerpos rgano espe fi o se e p ean a ini as que ontienen ortes de tejidos de rganos en su mayora de primates. Entre estos cortes se cuentan: glndulas adrenales, musculo cardiaco, esfago (para identificar anticuerpos antiendomisio), rin (para identificar anticuerpos anti membrana basal glomerular) y pncreas (para identificar anticuerpos anti clulas de los islotes pancreticos).