Métodos en Biología Celular

ELISA

Introducción
Dispositivos empleados en ELISA
Fases de un ensayo ELISA
Tipos de ensayo ELISA
Marcadores enzimáticos más comunmente utilizados

Introducción

La técnica ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) se basa en la detección de

un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o
indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede
ser medido espectofotométricamente. Este principio tiene muchas de las propiedades de
un inmunoensayo ideal : es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos
económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre
la fracción retenida y la fracción libre.

Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la

señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas,...) que han permitido elevar la sensibilidad
de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.

Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se
precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos : diagnóstico clínico,
detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos
monoclonales, etc..

Dispositivos empleados en ELISA

Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes a las
actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado para aumentar su capacidad de
absorción de moléculas y con fondos de pocillo ópticamente claros para poder realizar
las medidas de densidad óptica en instrumentos específicos, espectrofotómetros de
lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se están
desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con 384 y 1536 pocillos,
adecuados para los sistemas de 'screening' masivo de los sistemas robotizados (HTS,
'High troughput system')

Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada
uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotómetro
convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el
visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que
sólo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden
con las necesarias para determinar la densidad óptica de los cromógenos más
comúnmente utilizados.
Fases de un ensayo ELISA

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes :

Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa

alcalina,...). El anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e
indirectos, sandwich, etc.. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de
antígeno.
Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o
antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran
afinidad por proteínas.
Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la
placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo)
o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario
marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal
al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el
caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno
marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frio frente a una cantidad fija de
antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.
Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las
moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato
enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante
espectrofotometría. En el esquema se muestra la reacción asociada a un ELISA directo.

Tipos de ensayos ELISA

Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la

cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución
(por ej. en el clonaje de anticuerpos monoclonales), o la determinación de la subclase
(idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan
recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el
antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la
solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del
mismo tipo de las analizadas (sangre, orina, ...) pero en las que se tenga la certeza de la
ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones
donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido).

ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior.
Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos
anticuerpos : uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el
primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de
señál debida a la unión de dos o más anticuerpo secunadarios por cada primario. Es el
ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo
secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran
cantidad de antígenos.
ELISA 'sandwich'. (ensayo de captura de antígeno y detección mediante
inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo
con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se
aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el
pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que
elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-
antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en
la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo
tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que
permite el segundo anticuerpo.

Marcadores enzimáticos más comúnmente utilizados

En la tabla siguiente se recogen los marcadores enzimáticos más comúnmente

empleados en ensayos ELISA, los sustratos que se emplean para su revelado y el modo
de prepararlos.

ELISA es el acrónimo de la descripción en ingles de una técnica de inmunoensayo:

("Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay" es decir en español Ensayo por
inmunoabsorción ligado a enzimas) y que se basa en la detección de un antígeno
inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente
producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido
espectrofotométricamente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un
inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realize, mediante el uso de la fase
sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.

Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la

señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad
de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.

Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se
precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico,
detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos
monoclonales, etc..

Contenido [ocultar]
1 Dispositivos empleados en ELISA
2 Fases de un ensayo ELISA
3 Tipos de ensayos ELISA
4 Marcadores enzimáticos más comúnmente utilizados
5 Enlaces externos

[editar] Dispositivos empleados en ELISA

Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes a las
actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado para aumentar su capacidad de
adsorción (fenómeno de superficie) de moléculas y con fondos de pocillo ópticamente
claros para poder realizar las medidas de densidad óptica en instrumentos específicos,
espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA.
Actualmente se están desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con
384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de 'screening' masivo de los sistemas
robotizados (HTS, 'High-throughput system')

Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada
uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotómetro
convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el
visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que
sólo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden
con las necesarias para determinar la densidad óptica de los cromógenos más
comúnmente utilizados.

[editar] Fases de un ensayo ELISA

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:

Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa

alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e
indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de
antígeno.
Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o
antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran
afinidad por proteínas.
Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la
placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo)
o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario
marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal
al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el
caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno
marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de
antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.
Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las
moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato
enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante
espectrofotometría.
[editar] Tipos de ensayos ELISA
Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la
cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución
(por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinación de la
subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan
recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el
antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la
solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del
mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la
ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones
donde se encuentra el antígeno buscado).
ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos
anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el
primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de
señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el
ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo
secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran
cantidad de antígenos.
ELISA sándwich (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante
inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo
con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se
aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el
pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que
elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-
antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en
la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo
tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que
permite el segundo anticuerpo.
[editar] Marcadores enzimáticos más comúnmente utilizados
En la tabla siguiente se recogen los marcadores enzimáticos más comúnmente
empleados en ensayos ELISA, los sustratos que se emplean para su revelado y el modo
de prepararlos.

Enzima Sustrato Tampón

HRPO (peroxidasa de rábano) OPD 10 mg/25 mL de tampón citrato sódico 0.15 M pH
5; añadir microL de 30% peróxido de hidrógeno 30%
TMB 2.5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampón citrato sódico 0.1M pH 6;
añadir 5 microL de peróxido de hidrógeno 30%
ABTS 60 mg/100 mL de tampón citrato sódico 0.1 M pH 6; añadir 35 microL de
peróxido de hidrógeno 30%; parar con fluoruro sódico 1.25%; leer a 405 nm
DAB 10 mg/20 mL de tampón Tris 50 mM pH 7.4; filtrar y añadir 20 microL de
peróxido de hidrógeno 1%
CNP 6 mg en 1 mL de metanol; añadir 10 mL de tampón Tris 50 mM pH 7.4; filtrar y
añadir 40 microL de peróxido de hidrógeno 30%
AEC 80 mg en 1 mL de N,N'-dimetilformamida + 200 microL de tampón acetato 0.1 M
pH 4.5; filtrar y añadir 50 microL de peróxido de hidrógeno 30%
ASA 80 mg/100 mL de agua destilada caliente; ajustar a pH 6.0 con 1 mM NaOH y
añadir 10 % por volumen de 0.05% peróxido de hidrógeno; parar con 25 microL de
NaOH 1 M
AP (Fosfatasa alcalina) PNPP 5 mg/5 mL de tampón dietanolamina-HCl 0.1 M pH 9.8
+1 mM cloruro de magnesio
NAPFB (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo
de vidrio, (B) 10 mg de sal Fast Blue BB/ 10 ml de tampón Tris 0.05M pH 9.2 - 2 mM
cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar.
NAPR (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de
vidrio, (B) 10 mg de sal Red BB/ 10 ml de tampón Tris 0.05M pH 9.2 - 2 mM cloruro
de magnesio. Mezclar A + B y filtrar.
BCIP 1 mg/mL en solución AMP (2-amino-2-metil-propanol)
beta-G ONPG 2.5 mg/ml en tampón fosfato sódico 0.1 MpH 7.0 + 1 mM cloruro de
magnesio + 0.1 M beta-mercaptoetanol
ureasa BP 8 mg/1.48 ml de 0.01M NaOH; llevarlo a 100 ml con agua desionizada;
añadir 100 mg de urea y EDTA a 0.2 mM; ajustar el pH a 4.8 con 1 mM NaOH o HCl;
almacenar a 4 °C
PG IS Añadir a cada placa de ELISA 25 microL de cada uno de los reactivos siguientes
en secuencia : (A) 1% (peso/vol) gelatina en 0.1 M tampón fosfayo pH 7.0, (B) 1%
(peso/vol) almidón en agua destilada caliente, (C) 3.04 mg/mL de benzil-penicilina en
0.1 M tampón fosfato pH 7.0 (5000 U/mL), (D) 0.01 N ioduro en 0.1 M KI solución
stock (en una botella oscura)

WESTERN BLOT

Antecedentes
Antes de la aparición del Western blot, ya existían diversas técnicas capaces de detectar
un antígeno determinado en una muestra, como la inmunoelectroforesis, la
inmunodifusión doble de Ouchterlony, la inmunoprecipitación...

La aparición del Western no fue posible hasta la aparición de las membranas. En 1975,
Edwin Southern demostró que la nitrocelulosa era capaz de capturar ácidos nucleicos
separados previamente por electroforesis. De esta forma, se permitía el análisis de una
mezcla compleja de moléculas de ADN, como un genoma tratado con enzimas de
restricción.[6] Se desarrolló así el Southern blot, usando el nombre del descubridor
como epónimo; es por ello que tanto esta técnica como sus derivadas (Western blot,
Northern blot...) se escriben con mayúscula.

Más tarde, Towbin (1979) y Burnette (1981) demostraron que también era capaz de
unirse a proteínas. Ya en 1986, Millipore desarrolló la primera membrana de PVDF
diseñada para la transferencia de proteínas, la membrana de transferencia
ImmobilonTM PVDF. Porteriormente fue llamada membrana de transferencia
Immobilon-PTM para diferenciarse de otras membranas.

[editar] Pasos del Western blot

[editar] Preparación de la muestra
Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular:

Una pequeña cantidad del tejido se introduce en un buffer de extracción. Después se

procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para grandes volúmenes de
muestra), con un homogenizador (para muestras pequeñas) o por sonicación. Por último
se centrifuga para obtener las proteínas en el sobrenadante, la fracción no precipitada.[7]
Las células pueden lisarse por uno de esos métodos mecánicos. También pueden usarse
detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y solubilicen las proteínas. A veces
se añaden proteasas e inhibidores de fosfatasas que evitan la digestión por las enzimas
celulares de las proteínas y de las fosfoproteínas, respectivamente.[8]
Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4ºC) para evitar la desnaturalización
proteica. Para separar proteínas de compartimentos y orgánulos celulares es preciso
combinar técnicas mecánicas - como filtraciones y centrifugaciones - y bioquímicas.
Electroforesis en gel
Artículo principal: Electroforesis en gel
Las proteínas de la muestra serán separadas mediante una electroforesis en gel en
función de uno o varios (en las electroforesis bidimensionales) de estos criterios: punto
isoeléctrico, peso molecular y carga eléctrica. La naturaleza de la separación depende
del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel.

La electroforesis en gel más frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de
poliacrilamida y de tampón con dodecilsulfato (SDS). En esta técnica las proteínas
sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la pérdida de las estructuras
secundaria y terciaria (por ejemplo, reduciendo los puentes disulfuro (S-S) a grupos tiol
(SH + SH)) y mantiene los polipéptidos en este estado desnaturalizado. De este modo,
la estructura tridimensional de las proteínas no influye en la electroforesis, y pueden
separarse únicamente en función del tamaño.

Transferencia
Para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos, se las transfiere
desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta
transferencia puede realizarse por difusión, por vacío o por acción de un campo
eléctrico (electrotransferencia).
Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad de
unir proteínas de forma inespecífica (es decir, se adhieren a todas las proteínas con
idéntica afinidad):

las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza de las

interacciones membrana - proteína, se sabe con cierta seguridad que se trata de
interacciones no covalentes de naturaleza hidrófóba.
en las membranas de PVDF, la unión está basada en interacciones hidrofóbicas y de
dipolos entre la membrana y las proteínas. Como particularidad, deben ser humedecidas
con metanol o etanol antes de exponerlas a tampones acuosos, debido a su alta
hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.
Las membranas de nitrocelulosa son más baratas que las de PVDF, aunque son también
más frágiles, tienden a tornarse quebradizas cuando se secan y no pueden ser sometidas
a varias pruebas consecutivas.[9]

También pueden usarse otros soportes, como las membranas de nylon o el papel
activado. Sin embargo, no son tan usados como los anteriores.

Difusión simple
En la transferencia por difusión simple se ponen en contacto las superficies del gel
electroforético y de la membrana y, sobre ésta, se dispone un taco de papeles de filtro.
Con el fin de facilitar el proceso, puede ponerse encima una placa de vidrio y un objeto
pesado. Este montaje se coloca sobre un tampón, que ascenderá por capilaridad hacia el
papel de filtro arrastrando consigo las proteínas. Al llegar a la membrana, quedarán
retenidas en ella.

Este protocolo no está muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de proteína
transferida a la membrana es muy baja, mucho menor que con la electrotransferencia.
Sin embargo, ha ganado cierta popularidad por una modificación que permite obtener
múltiples transferencias de un mismo gel, permitiendo de esta forma realizar varias
pruebas sobre geles virtualmente idénticos. Esta modificación es viable cuando no es
necesaria una transferencia cuantitativa de proteína.

Transferencia al vacío
En esta técnica, se añade el poder de succión de una bomba conectada a un sistema de
secado de planchas de gel, el cual lleva las proteínas desde el gel hasta la superficie de
la membrana de nitrocelulosa. Este método es válido tanto para proteínas de alto como
de bajo peso molecular.

Electrotransferencia
Este método se basa en una corriente eléctrica y un tampón de transferencia para llevar
las proteínas desde el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito los
siguientes elementos (del polo negativo o cátodo al positivo o ánodo): esponja, varios
papeles de filtro empapados en buffer de transferencia, gel, membrana, más papeles de
filtro empapados y otra esponja. Este montaje, llamado coloquialmente sandwich, se
dispone en el sistema de transferencia y se aplica una corriente eléctrica, de magnitud
acorde a los materiales empleados, al tiempo disponible,... Las proteínas del gel se
desplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana.
Tras la transferencia, se suele proceder a la tinción del gel con Coomassie Brilliant Blue
(un colorante de proteínas) para comprobar que en efecto una parte importante del
material proteico ha pasado a la membrana.

La electrotransferencia es hoy en día la técnica de transferencia más usada gracias a la

velocidad del proceso y al elevado porcentaje de proteína que se transfiere
(especialmente en comparación con las otras técnicas).

Bloqueo
Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse proteínas de forma inespecífica,
es preciso bloquear los lugares de unión que han quedado libres tras la transferencia. En
caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado en la detección puede
unirse a ellos, dificultando la distinción del complejo antígeno-antígeno que se forma
con la proteína que se busca.

En el bloqueo se incuba la membrana con una solución de proteínas, típicamente de

albúmina de suero bovino o ASB (más conocida por sus siglas en inglés, BSA) o leche
en polvo, con una diminuta fracción de detergente, como Tween 20 o Tritón X-100. Las
proteínas en solución se unirán a todos aquellos lugares de unión de la membrana que
no estén ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo sólo
podrá unirse a su antígeno específico, reduciendo así el ruido de fondo y los falsos
positivos.

[editar] Detección
En la detección se comprueba la presencia en la membrana de una determinada proteína.
Para ello se emplea un anticuerpo específico contra ella unido a enzima que, en
presencia de su sustrato, catalice una reacción colorimétrica (produce color). De esta
forma, se hace patente la unión con el antígeno, la proteína, así como su localización.

El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos pasos, aunque ahora es posible la

detección en un único paso, lo cual es útil en ciertos campos.

Método en dos pasos

Los dos pasos de los que consta este método de detección son la unión del anticuerpo
primario y la del anticuerpo secundario.
Anticuerpo primario

El primer paso es permitir la unión de un anticuerpo primario contra la proteína

buscada. Éste se consigue inoculando dicha proteína o uno de sus epítopos (regiones
capaces de desencadenar la respuesta inmune) a un animal (como un conejo o una
cabra) o a un cultivo celular. Además, como la proteína se ha desnaturalizado durante la
electroforesis en gel, es preciso que el anticuerpo reconozca específicamente la proteína
desnaturalizada. La presencia del elemento extraño debería desencadenar una respuesta
inmune cuyo resultado incluya la producción del anticuerpo, primario en este caso, ya
que reconoce la proteína.

Así pues, tras el bloqueo se incuba en agitación moderada la membrana con una
disolución de anticuerpo primario (0,5 - 5 μg/ml). La disolución consiste en un tampón
salino, con cloruro de sodio por lo general, con un pH cercano a la neutralidad, una
pequeña fracción de detergente y, en ocasiones, proteínas disueltas, como ASB o leche
en polvo. La membrana junto con la disolución pueden ser introducidas en una pequeña
bolsa de plástico. Esta incubación puede durar desde 30 minutos a una noche entera. La
temperatura a la que puede tener lugar es igualmente variada; en general, las elevadas
temperaturas favorecen las uniones más específicas.

[editar] Anticuerpo secundario

Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se

expone al anticuerpo secundario. Éste reconoce de forma específica una región concreta
del anticuerpo primario. Suelen estar marcados para ser detectables (unión a biotina, a
una enzima reporter como laa fosfatasa alcalina o la peroxidasa del rábano (HRP), etc.).
Varios de estos anticuerpos se unirán a cada anticuerpo primario, amplificando la señal.

Los anticuerpos secundarios proceden de animales o de cultivos de hibridomas de

origen animal. Por ejemplo, un anticuerpo secundario "anti-ratón" es aquel capaz de
reconoces casi todos los anticuerpos primarios obtenidos de ratones. Igualmente hay
anticuerpos "anti-cabra", "anti-conejo"... Su uso presenta ciertas ventajas: económicas,
por permitir a un laboratorio compartir una única fuente de anticuerpos secundarios; y
dan resultados mucho más consistentes.

También pueden emplearse proteínas no anticuerpos, como las proteínas A y G.

[editar] Radiactividad

Es una alternativa al uso de anticuerpos secundarios que consiste en proteínas de unión

a anticuerpos marcadas radiactivamente. Esta proteína puede ser, por ejemplo, la
proteína A de Staphylococcus aureus13 o la proteína G14 marcadas con 125I (un isótopo
radiactivo de yodo). Las proteínas mencionadas tienen la capacidad de unirse a
anticuerpos de forma inespecífica, por lo que se unirán al primario.

Este método apenas se usa actualmente, por ser significativamente más caro, peligroso y
lento que los otros. Sin embargo, presenta ventajas: es muy sensible, da bandas que
permiten una precisa cuantificación; y la imagen autoradiográfica puede ser reproducida
fácilmente y con gran precisión para su publicación.11

[editar] Anticuerpo unido a una enzima

Un mecanismo de detección simple y rápido consiste en unir al anticuerpo secundario
enzimas que catalicen la transformación de un sustrato soluble en un producto insoluble.
De esta forma, en el posterior análisis quedará una mancha allí donde esté la proteína de
interés. Enzimas como la peroxidasa de rábano (HRP) o una fosfatasa alcalina son
válidas para este mecanismo.11 Por ejemplo, la peroxidasa puede catalizar la oxidación
del 4-cloronaftol en presencia de un 1% de peróxido de hidrógeno. El resultado es que
el primero forma una mancha de precipitado oscura.15 Otras técnicas, como ELISA o
ELISPOT, también emplean este método de detección.

Otro método más sofisticado consiste en la unión de una enzima que catalice una
reacción quimioluminiscente. Las anteriormente citadas enzimas también son válidas en
este caso, aunque cada una usa un agente quimioluminiscente diferente. En el caso de la
peroxidasa, cataliza la oxidación del luminol en presencia de peróxido de hidrógeno. La
fosfatasa alcalina cataliza la defosforilación del adamantil-1-2-dioxetano fosfato,
reacción que genera luz. Si se coloca una película fotográfica sobre la membrana, la
exposición a la luz que se desprende en la reacción permite detectar la actividad
enzimática.

[editar] Marcaje fluorescente

Otro método basado en el mismo principio emplea anticuerpos unidos a fluorocromos

del infrarrojo cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 - difenil - 3 (2H) - furanona (MDPF) o
el rojo Nilo. Estos compuestos emiten una cantidad de luz constante (estado estático)
cuando se excitan de manera constante, permitiendo una detección muy precisa y una
cuantificación del antígeno más exacta que la de la quimioluminiscencia, que se realiza
durante un estado dinámico.

El rojo Nilo no es puede usarse para teñir bandas en membranas de PVDF; sin embargo
es posible realizar la tinción en el gel SDS - PAGE y luego transferirlo a la membrana
de PVDF. Esto último presenta una ventaja, y es que no es necesario realizar una tinción
del gel para comprobar la transferencia proteica.

Sistema avidina/estreptavidina

También puede usarse la estreptavidina, de Streptomyces avidinii, capaz de unirse

específicamente a biotina. Este método apenas se usa actualmente, por ser
significativamente más caro, peligroso y lento que los otros.

Detección con oro

Otra técnica, conocida como Golden blot, consiste en la detección de los anticuerpos
primarios con proteína A unida a partículas de oro. El resultado es una membrana con
manchas rojas, causadas por el oro, allí donde está la proteína. La sensibilidad del
método puede incrementarse con una tinción fotoquímica de plata: el oro cataliza la
reducción de los iones plata a plata metálica en presencia de otro agente reductor, como
la hidroquinona; la plata forma de este modo unas manchas visibles bajo microscopio
óptico. Se consigue así una sensibilidad comparable a la de las técnicas radiactivas.
Método en un paso

Históricamente la detección se ha realizado en dos pasos por la relativa facilidad que

supone producir anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto ofrece
a investigadores y empresas enormes ventajas en lo que a flexibilidad se refiere, y añade
un efecto amplificador al proceso. Sin embargo, debido a la llegada de los análisis de
proteínas de alto rendimiento y los menores límites de detección ha crecido el interés
por desarrollar sistemas de detección en un solo paso que aumentarían la rapidez del
proceso al tiempo que reducen los consumibles. Esto requiere un anticuerpo que
reconozca al mismo tiempo la proteína de interés y una "etiqueta" detectable. Se incuba
de manera similar al anticuerpo primario del proceso en dos pasos, y, tras una serie de
lavados, ya se puede detectar directamente.

Análisis

Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la detección de aquellas

que sí se han unido a la proteína de interés.

Detección colorimétrica

La detección colorimétrica depende de la incubación del Western blot con un sustrato

que reacciona gracias a la enzima reporter (una peroxidasa, por ejemplo) unida al
anticuerpo secundario. Pasa así de ser un compuesto soluble a una forma insoluble de
otro color que precipita cerca de la enzima tiñendo así la membrana. Se procede después
a un lavado en el que se elimina el tinte soluble. La cuantificación proteica se evalúa por
densitometría (cuan intensa es la mancha) o por espectrometría.

Detección quimioluminiscente

La detección quimioluminiscente requieren la incubación de la membrana con un

sustrato, que emitirá luminiscencia al ser expuesto al reporter que trae unido el
anticuerpo secundario. La luz emitida es captada por una película fotográfica o, más
recientemente, por cámaras CCD, que toman una imagen digital del Western blot. Se
analiza la imagen por densitometría para evaluar la cantidad relativa de mancha y
cuantifica el resultado en términos de densidad óptica. Actualmente hay programas que
permiten realizar análisis más profundos si se aplican ciertos estándares, como la
obtención del peso molecular.
[editar] Detección radiactiva

Los marcadores radiactivos no requieren sustratos enzimáticos; en su lugar se coloca

una película fotográfica contra el Western blot y la actividad radiactiva del marcador
provoca la aparición en ella de regiones oscuras. Éstas se corresponderán con las bandas
de las proteínas de interés. Su alto precio y su riesgo para la salud y la seguridad han
provocado su desuso en los últimos tiempos.

Detección fluorescente

En la detección con marcadores fluorescentes se procede a la excitación lumínica de

éstos que les provoca una excitación. Ésta es detectable por un fotosensor, como una
cámara CCD equipado con los filtros de emisión apropiados. Se consigue así una
imagen digital del Western blot que puede ser analizado para obtener el peso molecular
o la cuantificación proteica. La fluorescencia es considerada uno de los métodos de
análisis más sensibles.

[editar] Exploraciones secundarias

Una característica de las membranas de PVDF, de la que carecen las de nitrocelulosa, es

su capacidad de quitar los anticuerpos y volver a explorar la membrana con otros
anticuerpos. Aunque hay protocolos que permiten hacer lo mismo en membranas de
nitrocelulosa, la robustez de las de PVDF facilita la eliminación de los anticuerpos,
permitiendo más reusos antes de que el ruido de fondo es tan grande que impide
continuar con los experimentos. Otra diferencia es que, a diferencia de la nitrocelulosa,
el PVDF debe ser empapado en etanol, isopropanol o metanol al 95% antes de ser
usado. Además, las membranas de PVDF tienden a ser más delgadas y más resistentes a
los daños durante su uso.

[editar] Aplicaciones

[editar] Investigación

Actualmente, el Western blot es una de las técnicas más usadas en el estudio de la

biología molecular.19
[editar] Diagnóstico

• Prueba de VIH: se buscan, mediante Western blot, los anticuerpos anti-VIH en

una muestra de suero humano. Se transfieren a una membrana las proteínas de
células que, se sabe, están infectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero
que hay que probar con esta membrana. Este paso es equivalente a la incubación
con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos anti-VIH en el suero, serán estos
los que realizen el papel de anticuerpo primario. Se lava, para eliminar los
anticuerpos no unidos, y la membrana se vuelve a incubar con un anticuerpo
secundario anti-humano unido a una enzima-señal. La aparición de bandas
indica la presencia de proteínas contra las cuales el suero del paciente contiene
anticuerpos, es decir, el paciente es seropositivo.
• Se emplea como prueba definitiva de la encefalopatía espongiforme bovina,
comúnmente llamada "enfermedad de las vacas locas".
• Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot.
• En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la
presencia del FIV en gatos.