Tema 6.- Métodos inmunológicos aplicados en el Laboratorio.

Objetivos:
1. Interpretar los métodos de diagnóstico inmunológico más empleados en el
Laboratorio Clínico para evaluar el estado de salud o enfermedad del
humano.

 Introducción

Gran parte de los progresos alcanzados por la biología moderna se deben al

perfeccionamiento de los métodos analíticos de medida. La introducción de los
procedimientos basados en las reacciones inmunológicas ha representado un
importante avance en el análisis de sustancias de interés en biología animal y
vegetal difíciles de medir empleando los métodos bioquímicos habituales.
Dentro de los procedimientos inmunológicos, los más útiles y prácticos son
aquellos que se basan en la especificidad de la unión Ag-Ac. La propiedad que
tienen las Igs de unirse a un Ag, la especificidad de esta unión y el hecho de
que pueda ser visualizable por los fenómenos de precipitación, aglutinación y
otros mecanismos indirectos (marcaje con fluoresceína, con radioisótopos o
con enzimas) hacen que estos métodos se empleen ampliamente.

Contenidos:
 Métodos inmunológicos: concepto, principios que los rigen. Especificidad y
sensibilidad. Amplificadores de respuesta inmune y su aplicación a los
métodos en el laboratorio. Métodos más frecuentes en el Laboratorio
Clínico.

Desarrollo

Todos los métodos agrupados bajo la denominación común de

inmunoensayos se basan en la reacción de un antigeno con su anticuerpo
específico para determinar la concentración de antigeno o de anticuerpo, los
cuales pueden estar marcados o sin marcar,..Estas tecnicas hacen posible la
medición de sustancias presentes en muy pequeñas cantidades en los fluidos
biológicos en el orden de los microgramos, nanogramos y picogramos.
Principios generales de lo inmunoanalisis
En los ensayo inmunológicos se pueden utilizar reactivos marcados o sin
marcar, en el caso de los ensayos donde no hay marcaje existe limitaciones en
cuanto a la sensibilidad ya que deben producirse grandes complejos antigeno
anticuerpo para ser detectados. Como por ejemplo en la inmuno precipitación y
la aglutinación
En los ensayos que utilizan el marcaje
Los sistemas basados en el anticuerpo como reactivo pueden ser de dos
tipos
Tipo 1 exceso de anticuerpo.
 Anticuerpo + sustancia analizar ¡ es igual a complejo antigeno anticuerpo +
anticuerpo residual
Tipo 2 exceso de antigeno
Anticuerpo + analizado es igual a complejo antigeno anticuerpo + analizado
residual
En el tipo 1 se basa en medir la distribución del anticuerpo residual el cual
esta marcado.
En el tipo 2 se basa en medir la distribución del antígeno residual el cual
esta marcado.

Especificidad y sensibilidad
Existe un gran numero de ensayos inmunológicos que difieren entre si en
cuanto a su sensibilidad y especificidad. Los anticuerpos que son potentes y
tiene una alta afinidad, son sensibles pero su especificidad puede verse
afectada ya que pueden aparecer reacciones cruzadas indeseables, en tanto
los antisueros débiles tiene una alta especificidad pero son poco sensibles.

Anticuerpos monoclonales y policlonales

Anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos monoclonales se definen como anticuerpos uniformes y
homogéneos dirigidos hacia un solo determinante antigénico que se producen
de manera continua a partir de un mismo clon celular. El empleo de los mismo
ha quedado establecido en el laboratorio clínico en terrenos muy diversos como
química clínica, microbiología, inmunóloga, banco de sangre etc.
Ventajas
Derivan de un clon aislado por lo que constituyen un reactivo bien definido
Su producción permite la obtención de cantidades ilimitadas del mismo
reactivo con carácter homogéneo
Puede prepararse con soluciones de ag no purificada
Su especificidad y afinidad están bien definidas
Limitaciones
Afinidad fija . que si es baja puede no ser util para el ensayo analítico
Actividad biológica limitada o características poco habituales como las crió
globulinas
Falta de propiedades precipitantes o aglutinantes
Sensibilidad poco habitual a los cambios de ph o de concentración de sal

Anticuerpos policlonales.

Se obtiene por inmunización a partir de especies animales

Limitación
Falta de características uniformes de un lote a otro
Amplias variaciones en cuanta a clase y tipo, afinidad y especificidad
dentro un mismo antisuero.

Amplificadores de la respuesta inmune

 La amplificación de la respuesta inmune puede lograrse a traves del
marcaje con radioisótopos Como en el radioinmunoanalisis en el cual se marca
la sustancia a analizar y el ensayo inmunoradimetrico en el cual se marca el
anticuerpo reactivo
Con partículas como eritrocitos o látex
Con sustancias fluorescentes como en los ensayos luminiscentes y
quimioluminiscente.
Marcando los anticuerpos con enzimas acopladas a una reacción química
calorimétrica como en el ensayo inmuno enzimático ELISA

Métodos inmunológicos utilizados más frecuentemente en el laboratorio

clínico

Métodos de precipitación
Se basa en la creación de un precipitado al combinarse grandes cantidades
de antígeno anticuerpo el cual es medible. Existe un punto óptimo de
precipitación o punto de equivalencia en el cual existen las concentraciones
óptimas de ag y ag para la precipitación del complejo la formación de éste
complejo, ademas de las concentraciones del ag y el ab están influenciadas por
otros factores como la temperatura el ph y la concentración iónica del medio.
Ejemplo de tecnicas en las que se utiliza las reacción de precipitación
tenemos la inmunodifusión simple, en la cual se incorpora anticuerpo a una
preparación de gel en un tubo y luego se adiciona en la superficie la sustancia
a analizar en este caso se formar una línea de precipitación en el punto de
equivalencia . esta distancia del en la formación de la línea de precipitación al
punto de aplicación se compara con soluciones Standard, y la inmunodifusión
radial en la cual gel con el anticuerpo incorporado se deposita en una placa
petri a la cual se le abren pocillos y se depositan las sustancias a analizar y
además soluciones Standard, la distancia del anillo de precipitación al punto
de aplicación es proporcional a la concentración del antigeno que se calcula
basado en el anillo formado en la aplicación de la solución Standard,
Pruebas nefelométricos se basa en la turbidez resultante de la formación
del complejo ag ab la cual va ser directamente proporcional a la concentración
del antigeno, dicha turbidez es medida por dispositivos que miden la dispersión
de la luz al pasar un haz luminoso a traves de la solución que contiene el
complejo ag ab

Inmunoanalisis de partículas

Son de fácil aplicación y se basan en la utilización de partículas como

látex, eritrocitos, sales de colorantes para el marcaje del ag o el ab.
Pruebas de aglutinación de partículas: se basa en la obtención del
complejo antigeno anticuerpo mediante la reacción de aglomeración en la cual
uno de ambos va a estar recubierto de un trasportador corpuscular como látex,
eritrocitos, etc.
 Esta prueba es semicuantitativa y puede ser valorada visualmente con o
sin la ayuda del microscopio.
Sus principales ventajas son el alto grado de sensibilidad y la gran
diversidad de sustancias que pueden ser detectadas con el uso de ag o ab
recubiertos.
A pesar de ser una prueba simple, debe tener una correcta interpretación,
con un estricto programa de control de la calidad, que incluya las condiciones
del medio dela reacción como por ejemplo en la reacción del anti D
Este método es ampliamente usado en el laboratorio de banco de sangre,
para la detección de la proteína C reactiva, el factor reumatoideo, la prueba de
la antiglobulina de Coombs y otras.

Enzimo inmunoanalisis
Este método utiliza enzimas como marcador inmunogenico, al producirse
el complejo ag ab la enzima es liberada provocando la modificación del
sustrato, dando lugar al producto de la reacción enzimática el cual es medible
y proporcional a la concentración del complejo

Los ELISA son muy sencillos de aplicar. Se plantea que son tan sensibles
Como los RIA, sin el peligro del manejo de sustancias peligrosas como los
isótopos. Su costo en el mercado es, por lo general, inferior.
Las desventajas principales son la necesidad de cumplir, de manera estricta,
con los tiempos de incubación y la precisión en todos los pasos, para obtener
resultados confiables.
La adición de una enzima a la reacción inmunológica hace que este ensayo
dependa, además, de todos los factores que intervienen en la velocidad de una
reacción enzimática: pH, temperatura, tiempo, concentración de sustrato,
concentración de enzima y, sobre todo, la presencia de sustancias inhibidoras
o activadoras de la reacción de color (es conocido el efecto de compuestos
nitrogenados naturales como la urea y la creatinina .
Este método es ampliamente utilizado en el laboratorio por ejemplo en la
detección de ab y anticuerpos específicos, para medir la concentración de
hormonas y otras sustancias.

FLUORESCENCIA
La fluorescencia es una variante muy particular de los inmunoensayos que, por
su gran especificidad, sensibilidad y la introducción de tecnologías
automatizadas, ha alcanzado un alto grado de desarrollo.
Esta técnica se basa, como su nombre lo indica, en la utilización de sustancias
que son capaces de absorber energía luminosa y emitirla a otra longitud de
onda (fluorescencia). Su principal desventaja es que muchos otros compuestos
presentes en el suero son capaces de emitir fluorescencia, como la bilirrubina y
algunas proteínas. Por esta razón se han desarrollado tecnologías basadas en
lo que se ha denominado fluorescencia de tiempo prolongado.
Tiene como ventaja que es un ensayo simple sin necesidad de añadir otros
compuestos biológicos como las enzimas o reactivos radioisotopicos.

. Al inicio de estos ensayos fueron usadas sustancias naturales: se utilizaban

células de insectos que poseían el sistema luciferinaluciferasa
Las variantes más extendidas son las quimioluminiscencias, en las que la señal
luminosa se emite por una reacción química.
Las aplicaciones de los métodos luminiscentes son similares a las de otros
inmunoensayos, es decir, para la medición de sustancias a bajas
concentraciones.
.
RADIOINMUNOENSAYO
Este ensayo se basa en la reacción de una proteína(anticuerpo específico) con
un antígeno marcado isotópicamente, y con un antígeno endógeno, el que se
quiere determinar..
Por la Ley de acción de masas, los sitios de unión del anticuerpo serán
ocupados por los antígenos marcado y endógeno, en forma proporcional a las
concentraciones relativas que tienen en el medio de reacción.
Para ello es imprescindible que se cumplan dos condiciones: que el anticuerpo
se encuentre en concentración limitada (para que haya concurrencia entre
antígeno marcado y no marcado por sus sitios de unión), y que haya similar
avidez de ambos antígenos, por los sitios de unión del anticuerpo.
Las características más importantes de un anticuerpo para que sea utilizado en
el RIA son: alta especificidad, gran avidez por el antígeno y elevado título. El
anticuerpo debe ser utilizado en una concentración conocida y limitada, para
que la reacción se mantenga en la llamada zona de equivalencia.

El uso de anticuerpos monoclonales mejoró de manera notable la eficiencia de

las técnicas isotópicas y disminuyó, en mucho, el efecto de reacción cruzada
entre proteínas, el cual se presentaba con los antisueros policlonales .. Estos
anticuerpos reconocen un epítopo específico de la proteína que se desea
detectar, y pueden utilizarse en combinación se fija uno a la superficie, y se
marca el otro, como se aprecia en las técnicas sándwich y en el ensayo
Inmunorradiométrico (IRMA).
El RIA se utiliza en la actualidad para determinar hormonas, vitaminas,
neuropéptidos, monoaminas y otras sustancias que se encuentran en
pequeñas concentraciones en los fluidos biológicos y en otros muchos medios.
Las ventajas principales son su especificidad, sensibilidad y reproducibilidad
que, unidas a la constancia de la señal isotópica y a la duración, hacen de este
método uno de los más robustos de la tecnología moderna.
Las desventajas son la necesidad de equipos especiales y el uso de isótopos
radiactivos, lo que implica la sujeción a múltiples normas para la utilización,
conservación y desecho de estos productos, de acuerdo con las legislaciones
de cada país y con las normativas internacionales.

Dosificación de inmunoglobulinas. Interés Clinico

 Su dosificación en suero (habitualmente mediante nefelometría o también
por inmunodifusión radial simple) es: a) esencial ante la sospecha de una
inmunodeficiencia primaria o secundaria aunque la electroforesis del suero sea
normal; la dosificación de subclases de la IgG (dosificadas por ELISA o
nefelometría) es obligada ante casos de predisposición a infecciones,
principalmente respiratorias, con valores normales o poco disminuidos de la
fracción gamma electroforética, situación que puede corresponder a un déficit
selectivo de IgG2