UNIVERSIDAD DE SUCRE

Prueba de ELISA
INMUNOLOGIA

2012

MEDICINA IV

Being one of the components (antigen or antibody) labeled with an enzyme and insolubilized on a support (immunosorbent) antigen-antibody reactionwill be immobilized and. Palabras claves: anticuerpos.Prueba de ELISA PRUEBA DE ELISA KAREN CUELLO HERAZO1.ELYZABETH MONTERROZA CARRIAZO1 .La prueba puede desarrollarse en diferentes modalidades pero en todas ellas la reacción final se revela mediante un enzima que modifica un substrato que adquiere color. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y. It is very sensitive and specific tests. be easily revealed by adding a specific substratethat the enzyme acting produce a color visible to the naked eye or quantified using a spectrophotometer or colorimeter. antígenos. so that the resulting conjugates are both immunological and enzymatic activity. Estudiante de medicina cuarto semestre de la universidad de sucre. therefore. Martes 24 de Enero del 2012 ABSTRAT Immunoassay tests are based on an antigen-antibody reaction that takes place on a solid support (usually a plastic microplate) to which an antigen is adsorbed oranticuerpo. de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.espectrofotómetro. RESUMEN Las pruebas inmunoenzimáticas se basan en una reacción antígeno anticuerpo que tiene lugar sobre un soporte sólido (normalmente una microplaca de plástico) a la que se ha adsorbido un antígeno o un anticuerpo.JUAN TUIRAN PALENCIA 1. enzimas. Se trata de pruebas muy sensibles y específica. The ELISA is based on the use of antigens or antibodies labeled with an enzyme.WHITNEY SIERRA CHAVEZ 1. . sustrato. ELISA.La test may develop in different ways but in all the final reaction is revealed by an enzyme that modifies a substrate that acquires color. por tanto. El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima.

Existen diversas variaciones al método de ELISA para detectar y cuantificar ligandos de alto peso molecular (>30 000 daltons). Para lo cual se añade sustrato enzimático y se mide la reacción catalítica entre la enzima y el sustrato. 3) la actividad enzimática o reactividad inmunológica de los conjugados se preserva y permanece estable durante el análisis y el almacenamiento. que puede ser un antígeno. produciendo un cambio de color amplificado y que se detecta con facilidad.En el método ELISA de inhibición el cambio de color se reduce. La prueba ELISA se basa en varias teorias: 1)El antígeno y anticuerpo pueden enlazarse a una superficie portadora insoluble y retener su reactividad inmunológica. 2)las enzimas tienen actividad específica alta y convierten una cantidad relativamente grande de sustrato en producto detectable. Algunos de los protocolos se basan en reacciones de enlace competitivo y otras en reacciones de enlace no competitivo. Una sola proteína enzimática puede transformar en algunos minutos gran número de moléculas de sustrato en una cantidad igualmente abundante de producto final. Por sus características catalíticas las enzimas son marcadores muy sensibles y versátiles. un anticuerpos específico para el antígeno de interés o un anticuerpo para el anticuerpo primario. Casi todas las pruebas ELISA son ensayos en fase sólida en los cuales se adsorbe un antígeno o un anticuerpo sobre un soporte sólido. Los antígenos se purifican o se producen con tecnología recombinante. el marcador enzimático que se emplea en estos análisis se conjuga con un ligando. son empleados como conjugados no marcados o enzimáticos y por ultimo reaccionan con determinante antigénico específico de un antígeno o de un anticuerpo ligando-específico (anticuerpo primario) según el protocolo de análisis.Prueba de ELISA INTRODUCCIÓN El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utiliza como sus siglas lo indican una enzima como marcador para mediar la formación de complejos antígenoanticuerpo. porque la actividad enzimática se inhibe cuando el anticuerpo se enlaza al conjugado enzimático. lo que permite detectar concentraciones muy bajas del ligando. pero en todas las pruebas ELISA se requiere de un paso de separación para eliminar el conjugado enzimático libre antes de proceder a determinar la cantidad de conjugado enzimático enlazado. y 4) las enzimas no están presentes en el líquido biológico que se va a analizar. Los anticuerpos utilizados en el método ELISA son de origen monoclonal o policlonal que se suministran como antisuero no fraccionado o fracciones de inmunoglobulina purificada. pueden ser solubles o estar inmóviles en un soporte sólido. y al igual que los anticuerpos se utilizan como conjugados marcados o enzimáticos y son inmóviles o .

Se utiliza ácido sulfúrico para inhibir la actividad enzimática y estabilizar el producto final de reacción que tiene color. marcar de forma no covalente anticuerpos o enzimas con biotina y agregar avidina.Prueba de ELISA solubles. también. y se sigue el protocolo de trabajo retirando también como en los casos anteriores el exceso de antígeno presente no unido. Como se puede deducir los conjugados enzimáticos son antígenos o anticuerpos unidos en forma covalente a la enzima de elección . y siguiendo el protocolo se retira el ligando no reactante. para así poder relacionar inversamente la cantidad de producto que se forma con la concentración del ligando no marcado en la muestra problema. Se conoce que es posible. 2)galactosidasa beta y su sustrato o-nitrofenil-beta-Dgalactopiranósido que se transforma en un producto nitrofenolado amarillento medible. no competitivos se utilizan para determinar antígenos. haptenos o anticuerpos. o 3)fosfatas alcalina y su sustrato p-nitrofenilfosfato que también se transforma en nitrofenolato. Este procedimiento se acorta utilizando anticuerpo marcado con biotina y avidina marcada con enzima. dependiendo del protocolo de análisis. Las combinaciones de enzima y sustrato que se emplean en los diversos métodos ELISA incluyen: 1) peroxidasa de rábano y su sustrato. Técnicas de ensayo inmunológico por multiplicación enzimática . Los sitios de enlace libres funcionan como aceptores para la enzima marcada con biotina. Aquí el ligando no marcado compite con un ligando conjugado con enzima por un número limitado de sitios de enlace con el anticuerpo inmovilizado. peróxido de hidrógeno que en presencia de cromógeno o-fenilendiamina produce un producto color amarillo-naranja medible. Ensayos de enlace no competitivo Son denominados también. Así pues. Ensayos de enlace competitivo Los ELISA en fase sólida. La avidina posee cuatro sitios de enlace para la biotina y no todos ellos participan en la interacción con el anticuerpo marcado con biotina. como fase sólida pueden ser utilizadas perlas de poliestireno en donde se absorbe un exceso de anticuerpos generalmente monoclonales. el reactivo que se forma de la unión covalente entre enzima y antígeno o anticuerpo es el conjugado. técnicas del emparedado y son los métodos más utilizados para determinar antígenos que por lo menos tienen dos determinantes antigénicos.

y finalmente se permitió conocer el fundamento y las fases en larealización de la técnica de ELISA.Prueba de ELISA La técnicas de ensayo inmunológico por multiplicación enzimática (EMIT) es un análisis sin separación en el cual se emplea una enzima conjugada al hapteno de interés como marcador en una reacción enzima-sustrato como sistema de detección. y cuálesson las variantes de este método. Figura 1.por lo que el cambio de color se observa directamente proporcional a la cantidad de hapteno presente en la muestra. . Asi mismo se determinó la dilución en la cual se presentó el complejo de unión antígeno-anticuerpo en proporciones adecuadas. Este tipo de análisis lo describieron Rubenstein y colaboradores en 1972. ELISA de competición. determinando a qué especie pertenece. A medida que hay más hapteno hay menos anticuerpos disponibles para inhibir la actividada enzimática. el tipo de Ig G presente en ésta. Esta inhibición se debe a que el anticuerpo interfiere estéricamente con el enlace del sustrato al sitio catalítico de la enzima o el enlace del anticuerpo transforma la configuración de la enzima. De acuerdo a lo anterior. Se basa en una reacción de enlace competitivo entre el hapteno de la muestra y el hapteno conjugado con la enzima en un número limitado de sitios de enlace con el anticuerpo. La cantidad de hapteno en la muestra determina el número de sitios para anticuerpos disponibles para enlazar e inactivar el hapteno conjugado con la enzima. El enlace del anticuerpo al hapteno conjugado con la enzima produce inhibición de la actividad enzimática. (a) ELISA indirecto. Su principio es que se pueden determinar la cantidad de interacción entre el hapteno y el anticuerpo utilizando un marcador enzimático. (b). este trabajo se realizó con el fin de obtener a partir de una muestra problema.

C. Materiales y equipo para la realización de ELISA. E y G de cada columna. E y G. Se desechó el sobrenadante y se lavó 5 veces la placa con PBS-T (buffer fosfato salino 1X. en los pozos de las filas B . se agregó 100 μL de diluyente (Buffer carbonado) en todas las filas. C. 200 μL de la muestra problema.F y H. Posteriormente se adicionó en la columna 2 y 3. Se incubó durante una hora a 37ºC. en el resto de las columnas desde la columna 4 hasta la 12.D . lo que se adicionó fue 100 μL de buffer carbonado. La realización de la Prueba ELISA se inició con la utilización de una microplaca constituida por 96 pocillos.1%). Luego se añadió 100 μL de la solución bloqueadora Albúmina Sérica bovina .Tween 20 al 0. precisamente en los pozos de las filas A. de esas mismas columnas en vez de agregar esa cantidad de muestra problema. la cual se encontraba enumerada de forma horizontal (del 1 al 12) y de forma vertical.Prueba de ELISA MATERIALES Y MÉTODOS Figura 2. desde la A hasta la H. con letras del abecedario (desde la A hasta la H). Luego se procedió a adicionar 100 μL del blanco reactivo a la columna 1 en los pozos de las filas A. Se hicieron diluciones dobles a partir de la fila B.

A los pozos de las filas A. Nuevamente se descartó y se lavó la placa con PBS-T. . un conjugado anti-Mouse Ig G a la misma dilución de la anterior. B. para proceder a continuación con la adición de los sustratos ABTS y PNPP a los pozos. Se incubó 1 hora a temperatura ambiente. para posteriormente incubarlo por 1 hora a temperatura ambiente. se le agregó conjugado anti-Human Ig G y finalmente a la fila G y H.5%) en cada pozo. Finalmente se realizó la lectura de la microplaca en el lector de ELISA a 410 nm. para posteriormente adicionarle los 50 μL de SDS 1% a cada pozo y asi detener la reacción.D.Dog Ig G a una dilución 1/5000. a la fila C y D. de las filas C. Se lavó tres veces la placa con PBS-T de la misma forma que en el paso anterior y se almacenó la placa a 4 ºC hasta su uso. G y H se les agregó fosfatasa alcalina (PNPP) y a los pozos restantes. a la fila E y F.E y F se les adicionó peroxidasa (ATBS).Prueba de ELISA (BSA 0. Se incubó en oscuridad durante 10 minutos la placa. se le adicionó conjugado antiChicken Ig G. Más adelante se le adicionó a los pozos de la fila A y B 100 μL del conjugado anti.

5 1 0.4513 1/51200 0. Conjugado anti IgG Dog 1/200 1. debido a que se dio la unión del complejo antigeno anticuerpo de forma satisfactoria indicando que la muestra del suero problema efectivamente era de un humano.55 1/6400 0.5994 Conjugado de anti IgG de Dog Densidad óptica 1.4198 1/102400 0.414 1/409600 0.69445 1/800 0.12825 1/25600 0. Conjugado de anti IgG de Dog.53265 1/3200 0.5 0 Concentración del suero Figura 4.3336 1/204800 0.3885 1/400 0.8365 1/1600 0.481 1/12800 1.Prueba de ELISA RESULTADOS Y ANALISÍS DE RESULTADOS Figura 3. . Placa de ELISA. En la imagen se observa que los pozos donde se depositó conjugado anti IgG de humano se mostró una coloración azul verdosa.

5853 1/102400 2.1721 Conjugado anti IgG de Mouse 0.1815 1/204800 0. .1803 1/12800 1.3827 1/6400 0. Conjugado anti IgG Human.2775 1/3200 0.9557 1/800 1.3 0.Prueba de ELISA Conjugado anti IgG Mouse 1/200 0.38425 1/1600 0.42815 1/800 0.513 1/409600 2.2 0.8947 Conjugado del anti IgG Human 3.5 Densidad óptica 3 2.5695 1/1600 1.444 1/25600 2.3732 1/400 0.9861 1/6400 2.1789 1/51200 0.5 1 0.6 Densidad óptica 0.20425 1/102400 0.5 2 1.2188 1/25600 0.1431 1/51200 1.2084 1/409600 0.1 0 1/6400 1/12800 1/25600 1/51200 1/102400 1/204800 1/409600 Dilución del suero Figura 5.4 0. Conjugado anti IgG de Mouse.494 1/400 0.7063 1/3200 1.5 0.5 0 Figura 6.5504 1/12800 0.286 1/204800 2. Conjugado anti IgG Human 1/200 1.

Los puntos donde se observó mayor absorbancia fue donde se presentó una mayor reacción antígeno-anticuerpo. la absorbancia fue mayor en filas donde estaban los pozos de E y F (conjugado anti IgG-humano) y el mayor pico de absorbancia se observó en la dilución 1/409600 con una absorbancia 2.2184 1/6400 0.1984 1/102400 0.8947 y la menor absorbancia se observó en la dilución 1/400 con una absorbancia de 0.1712 1/25600 0.1747 1/400 0. y menores en los pozos donde se adicionó conjugado anti IgG Dog.1483 1/12800 0.Prueba de ELISA Conjugado anti IgG Chicken 1/200 0. esto debido a que los anticuerpos adicionados a la muestra en esa dilución encontraron antígenos suficientes a los cuales unirse.25 0.1831 1/204800 0.1482 1/409600 0. perro y ratón.1441 Conjugado anti IgG de Chicken 0.1765 1/1600 0. contrario ocurre con la de pollo.1 0. De acuerdo a las gráficas densidad óptica Vs.05 0 Figura 6. la mayor absorbancia se obtuvo en los pozos a los que se les adicionó conjugado anti IgG Humano. Lo que permite determinar una relación inversamente proporcional. a medida que las diluciones aumentan. dilución.15 0. . En general. conjugado anti IgG Mouse y conjugado anti IgG Chicken. Conjugado anti IgG Human.1664 1/51200 0. Se observó que tras los estudios de fotocolorimetría. cuyas curvas decrecen.9557 (ver figura 6). mientras que en los que se presentó una menor absorbancia fue debido a que los antícuerpos agregados no encontraron antígenos suficientes a los cuales unirse.2018 1/3200 0.2 Densida óptica 0. se observa que en la de humano la curva se dirige en forma ascendente a medida que va disminuyendo la concentración del suero problema en los pozos.1387 1/800 0.

M. Son los factores que afectan la medida de la actividad enzimática (temperatura. fuerza iónica. la temperatura y la exposición a la luz.exposición a la luz). Para la búsqueda de autoanticuerpos se incuba el suero del paciente en un pocillo en cuyas paredes se encuentra adherido el antígeno específico. hoy en día. Elisa es una técnica simple que se basa en la unión antígeno-anticuerpo. el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura. involucra a un gran número de variables.desnaturalización de la enzima y algunos casos. temperatura. . A o polivalentes) que se uniría al primer anticuerpo (el del paciente). reducción del substrato. medición de volumen y tiempo. Esta completa automatización se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran número de muestras y por necesitar una elevada repetibilidad de resultados. Las técnicas de ELISA se realizan mediante la adición secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado. los cuales al realizar de manera manual aumentan el error. Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatización de todas y cada una de las etapas.composición del tampón. pH. Finalmente. Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350μL son especialmente ventajosas para procesar un elevado número de muestras y una vez tapizadas. Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse estériles y con o sin tapa. la prueba de ELISA se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba. son el tiempo de reacción. En síntesis. también el desarrollo de las diluciones que son los que más afectan al ensayo además de la experiencia del analista. tales como seleción de reactivo. mayor concentración sérica del autoanticuerpo). luego se lava quedando en el pocillo sólo los anticuerpos que se han unido al antígeno. mediante un sustrato colorimétrico (se activa mediante enzimas que se encuentran en el segundo anticuerpo) se determina la cantidad de anticuerpo presente (a mayor intensidad del color.Prueba de ELISA La fase sólida debe ser de un tipo que permita un fácil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unión de antígenos o anticuerpos sobre su superficie. Se usa luego un segundo anticuerpo dirigido contra la porción Fc de la Ig (anti IgG. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo.

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