Grupo 7

Jonathan Hurtado
Diego G. Altamirano.
OBJETIVOS:
- Describir el principio bsico de cada tcnica.
- Conocer algunas variantes de las mismas.
- Interpretar brevemente los resultados.
- Determinar la aplicacin clnica.
BASE TEORICA:
Introduccin
El inmunoensayo es una prueba que usa complejos antgeno-anticuerpo, como medio para
generar un resultado perceptible. Este complejo (valga la redundancia) tambin es conocido como
inmunocomplejo, haciendo referencia a una respuesta inmunolgica que hace que el cuerpo
genere anticuerpo como inmuno y ensayo a la prueba que se utiliza. Entonces un
inmunoensayo es una prueba que utiliza inmunocomplejos cuando se unen los anticuerpos y los
antgenos.
Los inmunoensayos se diferencian de otras pruebas de laboratorio, como las colorimtricas, ya
que usan antgeno-anticuerpo para generar una seal que pueda medirse. En oposicin, la
mayora de las pruebas de rutina de qumica clnica utilizan reacciones entre el reactivo y la
muestra del paciente para generar resultados.
Conocimientos previos:
- Antgeno: Sustancia que puede inducir a la formacin de anticuerpos, el sistema inmune
las reconoce como amenazas, pudiendo ser estas amenazas, propias o externas, llamado
tambin inmungeno.
- Anticuerpo: Es una protena producida por el sistema inmune en respuesta a agentes
extraos, casos especiales son las denominadas enfermedades autoinmunes.
- Inmunoensayo: Conjunto de tcnicas inmunoquimicas analticas de laboratorio que tienen
en comn el uso de inmunocomplejos, es decir la conjugacin de Ag-Ac, como referencias
de cuantificacin de un analito determinado que puede ser el Ag o el Ac, las tcnicas se
basan en la gran especificidad y afinidad de los anticuerpos por sus antgenos, en donde
se usan con ms frecuencia los anticuerpos monoclonales.
- Analito: Objeto de anlisis.
- Eptope: Regin nica en un antgeno que se une a un anticuerpo especfico.
- Enzima: Protena compleja que produce cambios a nivel de nuestro organismo, sea para
ayudar acelerando reacciones, disminuyendo, facilitando entre otras propiedades ms.
- Fluorocromo: Molculas qumicas que absorben la luz a una determinada longitud de
onda emitiendo otra diferente.
- Radioactividad: Energa emitida por los cuerpos radioactivos, es una propiedad que
poseen ciertos ncleos atmicos de modificarse espontneamente emitiendo radiacin.

La exactitud y la precisin en los inmunoensayos son fundamentales para la utilidad de los
mismos. Exactitud significa que el ensayo les est dando la respuesta correcta tanto al bioqumico
como al mdico y est describiendo la cantidad de analito realmente presente. A menudo se lo
ilustra con una flecha dando en el blanco.






Precisin en los inmunoensayos significa que la combinacin de reactivos, analizador, y otros
factores de infuencia pueden proporcionar resultados reproductibles. Puede compararse con la
flecha dando en el mismo punto del blanco, una y otra vez, aunque no necesariamente en el
centro.
Exactitud es la capacidad de medir la concentracin correcta de analito en una muestra. Los
inmunoensayos pueden ser exactos pero imprecisos, precisos pero inexactos, o ambas cosas.
Tpicamente se cree que la sensibilidad y la especificidad clnicas son subconjuntos de la exactitud
y la precisin. Si un ensayo tiene la capacidad de generar resultado con exactitud y en forma
reproductible que no produzcan falsos positivos, entonces se lo considera especfico. Un falso
positivo significa que un resultado puede indicar errneamente que existe una cierta condicin de
un paciente (el resultado positivo realmente no identifica a un paciente que es positivo).
En un anlisis de hepatitis, por ejemplo, un falso positivo significa que el ensayo indic que un
paciente es positivo para hepatitis, cuando no lo es. Esto puede ocurrir por varias razones, pero en
la mayora de los casos se debe a que la metodologa del ensayo no puede distinguir entre el
analito deseado que se est midiendo y uno que se comporta igual que ese (tal vez comparten
estructuras moleculares similares, pero fisiolgicamente tienen un efecto diferente sobre el
organismo)
Se considera que un ensayo muestra sensibilidad clnica cuando en forma exacta y reproductible
puede asegurar que no ocurren falsos negativos. Volviendo al ejemplo del anlisis de hepatitis, el
bioqumico no quiere entregarle al mdico un resultado que errneamente indique que un
paciente no tiene hepatitis cuando s la tiene. Si el paciente es realmente positivo para hepatitis,
un ensayo con sensibilidad clnica deficiente que no pueda detectar niveles muy bajos de hepatitis
(no es lo suficientemente sensible) puede indicar falsamente que el paciente es negativo para
hepatitis (no tiene hepatitis).


Principios y Tcnicas:

Luz Radiacin Enzimas
Inmunofluorescencia Radioinmunoanlisis Enzimainmunoanlisis

Variedades: Dentro de las mismas tcnicas encontraremos distintas variables de
las mismas, a las cuales como esquema diremos:
Directa
Indirecta
No competitiva(Sandwich): DAS (Doble anticuerpo sndwich)-
HADAS (Heterlogo)
Competitiva

Todos los inmunoensayos requieren del uso de material marcado, para poder medir la
concentracin de antgeno o de anticuerpo presente. Una marca es una molcula que reacciona
como parte del ensayo, los ejemplos de marcas incluyen un compuesto radioactivo, una enzima
que hace que cambie el color de una solucin, o una sustancia que produzca luz. La marca puede
aplicarse durante la fabricacin del reactivo, tanto al Ag como al Ac.

4 tipos de principios sern los que utilizaremos para las distintas tcnicas.

Directo: Unin de un anticuerpo primario conjugado con 1 de los tres principios antes
mencionados, con la consiguiente formacin del anticuerpo conjugado, que se une al antgeno. Fig
1.

Indirecto: El anticuerpo primario unido al antgeno se revela a travs de un anticuerpo
secundario previamente conjugado con una de los 3 principios antes mencionados. Fig 2

Competitivo: El antgeno de la muestra y el marcado se ponen en contacto con un
anticuerpo en una concentracin limitante, compitiendo ambos por los sitios de unin al Ac.
Cuanto ms Ag haya en la muestra, menos Ag* se unir al Ac, por eso podemos decir que la
concentracin de antgeno en la muestra est inversamente relacionada con la concentracin del
marcado





No competitivo (sndwich): Estos formatos proporcionan el nivel ms alto de sensibilidad
y especificidad en un inmunoensayo y se aplican a la medicin de analitos crticos como pueden
ser los marcadores cardiacos y de hepatitis, se le conoce como sndwich porque el analito se
encuentra unido literalmente como lo dice el nombre a dos anticuerpos muy especficos.

En los ensayos no competitivos, la medicin del analito marcado, generalmente un Ac, es
directamente proporcional a la concentracin de Ag presente en la muestra. Esto puede
representarse por medio de una curva de respuesta de concentracin, en dnde el eje X traza la
concentracin de un Ag y el eje Y traza la respuesta que se trata de la seal.
As, cuanto mayor sea la cantidad de Ag, ms anticuerpos marcados se unirn.
Usos:
- Medicin hormonal, gracias a que varias hormonas como la TSH, se miden tpicamente a
travs de la tecnologa del inmunoensayo.
- Indicadores de lesin vascular, gracias al anlisis de ciertas protenas especficas liberadas
durante y despus del infarto de miocardio, como la Troponina-I.
- Hepatitis, gracias al inmunoensayo se han podido identificar cinco virus distintos que
causan hepatitis como lo son el A,B,C,D,E.
- Marcadores tumorales, las clulas tumorales pueden producir protenas que se detectan
en suero por medio del inmunoensayo, pudiendo ser til en el Dx y monitoreo del cncer.
- Pruebas congpenitas, tambin se encuentras disponibles los inmunoensayos que miden
ciertos agentes infecciosos que son especialmente perjudiciales si un feto est expuesto.
- Pruebas metablicas, como el folato, para valorar funciones metablicas y deficiencias
nutricionales.
Ensayos:

Inmunofluorescencia:

La inmunofluorescencia es una tcnica que emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos
(tintados con fluorescina), los fluorocromos son molculas que al ser excitadas con la energa de
una determinada longitud de onda son capaces de emitir energa de una longitud de onda mayor.
Se aplica en el diagnstico de patologas cutneas y renales e investigacin.

Variantes:

Primaria: O tambin llamada inmunofluorescencia directa, es aquella que se vale de 1 anticuerpo
marcado con un fluorocromo que reacciona con el antgeno dentro de la muestra. El
procedimiento es de un solo paso y comprende un solo anticuerpo marcado, la visualizacin de
estructuras no es ideal a causa de la poca emisin de la seal.

Secundaria: O inmunofluorescencia indirecta, esta prueba tiene una mayor sensibilidad y con
frecuencia recibe el nombre de tcnica de emparedado o de la capa doble, en vez de conjugar un
Ac especfico dirigido contra un Ag de inters, el fluorocromo se conjuga con un anticuerpo
secundario dirigido contra el anticuerpo primario, desventajas de esta tcnica es el coste.

De superficie: En la cual evidenciaremos, en caso de reaccin, la respectiva coloracin pero solo a
nivel de la superficie celular, y la reaccin propia en ese lugar.

Citoplasmtico: La reaccin se centra hacia el citoplasma celular, en donde le evidenciaremos la
coloracin.





Radioinmunoensayo

Se utiliza para detectar y cuantificar sustancias que se encuentran en cantidades muy pequeas y
mezcladas con muchas otras. Es por tanto una tcnica muy sensible y muy especfica. Utilizando
anticuerpos de gran afinidad se pueden detectar hasta picogramos de antgeno. (1 pg = 10-12 g).
El fundamento es muy sencillo:
Se mezcla una cantidad constante de antgeno marcado radioactivamente y una cantidad
constante de un anticuerpo para ese antgeno
Se produce la reaccin entre antgeno (Ag) y anticuerpo (Ac)
se separa la fraccin de antgeno que se ha unido de la que permanece libre (hay varias
formas de hacerlo. En la figura inferior se utiliza un 2 anticuerpo dirigido contra el
primero)
se determina la radioactividad
Si la muestra contiene adems antgeno fro (no marcado), ste competir con el marcado
para unirse al anticuerpo, y se observar un descenso en la medida de la radioactividad
Este descenso es proporcional a la concentracin de antgeno fro en la muestra




Se construye una curva de calibrado (color rojo) que relacione la medida de radioactividad (cpm)
con la concentracin de antgeno fro en la muestra
Si se realiza el ensayo con una muestra que contiene una cantidad desconocida del antgeno no
marcado y se mide la radioactividad asociada a los anticuerpos, por interpolacin sobre la curva de
calibrado se puede estimar la concentracin del antgeno fro en la muestra.
RIA de Sandwich (IRMA)
Se inmoviliza una concentracin fija del Ac1 (no marcado) en un soporte slido. Tras lo
que se satura el soporte.
Se aade la muestra problema (o de calibrado) de Ag.
Se aade Ac*2 (marcado) que se una a otro eptopo del Ag.
Eliminacin del Ac*2 no unido.
Se determina la cantidad de anticuerpo marcado unido.
A partir de una recta patrn se interpola el valor obtenido para saber la concentracin de
Ag presente o bien se realiza la recta de calibrado.
RIA de Inhibicin
Usado cuando no se puede marcar el antgeno.
Se inmoviliza una cantidad constante de antgeno en un soporte slido. Se suele saturar
con BSA, leche en polvo o casena para que no se una nada ms al soporte.
Se aade una cantidad constante de Anticuerpo marcado y el antgeno fro a medir (o de
calibrado). En este paso se establece una competencia en la que el Ac se une al Ag fijo al
soporte o al problema.
Se eliminan el anticuerpo no inmovilizado y el antgeno soluble y se determina la cantidad
de anticuerpo marcado que se ha inmovilizado.
Se construye una curva de calibrado representando la cantidad de anticuerpo marcado
inmovilizado frente a la concentracin de antgeno soluble aadida o bien se interpola la
radiactividad medida en esta curva de calibrado.

Tcnica de Elisa

El ELISA se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los
conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los
componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte
(inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser
fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima
producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotmetro o un colormetro.
Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacin:
Anticuerpos marcados:
ELISA Directo
ELISA Indirecto
ELISA sndwich
Doble (DAS)
Heterlogo (HADAS)
Antgeno marcado
ELISA competitivo

ELISA Directo.
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos especficos. Lavado para eliminar
los antgenos fijados deficientemente o no fijados.
Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los anticuerpos
reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavado para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede
parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
ELISA Indirecto.
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de
estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados.
Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn
especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos
marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los
anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los
antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede
parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
ELISA Sndwich DAS (Double Antibody Sandwich)
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar.
Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal
forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar
especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos
que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo
diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una
enzima, los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que
se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados
que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede
parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
ELISA Sndwich HADAS
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar.
Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal
forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar
especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos
que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo
diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales reaccionan
con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los
anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionado.
Adicin de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso
anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede
parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
ELISA Competitivo.
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar.
Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
Adicin en concentracin conocida de una mezcla de antgenos del anticuerpo utilizado en
el paso anterior, marcados con una enzima y antgenos desconocidos objeto de estudio.
Paralelamente, aadir nicamente antgenos del anticuerpo usado en el paso anterior,
marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede
parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar
los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son anlogas, el antgeno a estudio no
tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte. Si hay
diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el antgeno objeto de estudio, est
relacionado serolgicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la
diferencia de densidad ptica, es proporcional a la concentracin del antgeno problema
en la muestra.


Conclusin

Al concluir este episodio de teora, ud como estudiante de la facultad tendr cierto grado de
conocimiento hacia las tcnicas de inmunoensayos, la posterior aplicacin ser de gran ayuda en
el campo de la medicina con el conocimiento previo que ud adquiri.
Los inmunoensayos son procesos por los cuales el estudiante en formacin y futuro mdico
podrn repercutir en la salud de un individuo, a travs de distintas tcnicas que nos ayudar a
cuantificar en cierto grado ciertas sustancias y objetos en determinado estudio para tratar de
preservar la salud misma del paciente.





Referencias.
http://indexmedico.com/publicaciones/indexmed_journal/edicion9/inmunoensayo/lardoeyt_fe
rrer.htm
http://webs.uvigo.es/endocrinologia/PDFs%202004_05/PDFS/Inmunoensayo_MAndrade.pdf
http://www.slideshare.net/lamparkie/inmunofluorescencia
http://www.nitzipper.com/es/nitzipper-aplicaciones-bioconjugacion/inmunofluorescencia.html
http://www.ser.es/wiki/index.php/Inmunofluorescencia
http://exa.unne.edu.ar/bioquimica/inmunoclinica/documentos/Laboratorio_TPN8.pdf
http://sai.unizar.es/citomica/aplicaciones/aplicaciones1.html
http://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/2930/tesisUPV2832.pdf
http://webs.uvigo.es/endocrinologia/PDFs%202004_05/PDFS/Inmunoensayo_MAndrade.pdf
http://www.slideshare.net/SofiaJaramilloQuiroz/reacciones-agac-por-tcnicas-
complejas?qid=448da129-8e83-4b42-a84e-5b495c71dd55&v=qf1&b=&from_search=1
http://www.ehu.es/biomoleculas/isotopos/ria.htm
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf
http://www.slideshare.net/pabloosxx/inmunologa-radioinmunoensayo-elisa
http://www.medic.ula.ve/idic/docs/clases/2011/modulo10.pdf