Universidad de Guanajuato

División de Ciencias Naturales y Exactas

Equipo 7

Serna Gutiérrez Isaac: 137570

Rosas Arroyo José Ángel: 785508
Rojas Romero Naomi Berenice: 344528

Laboratorio de Inmunología.

Práctica 5: ELISA (Ensayo por inmunoadsorción ligado a

enzimas).

25/05/2022
Objetivo:
Utilizar métodos más sensibles para la identificación de antígenos. Usar el método de
ELISA y la inmunodetección que son métodos muy utilizados actualmente para el
reconocimiento de antígenos.

Fundamento:
Los anticuerpos son proteínas producidas en las células plasmáticas de los vertebrados
como parte del sistema inmunitario adaptativo frente a estructuras (antígenos) que el
cuerpo reconoce como elementos extraños. Los anticuerpos se enlazan a los antígenos
correspondientes utilizando un patrón diferenciado de interacciones iónicas e
hidrofóbicas, enlaces de puente de hidrógeno y fuerzas de Van der-Waals. La interacción
entre el anticuerpo y el antígeno correspondiente es selectiva y muy específica, similar a
la de una cerradura y una llave.
El ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas se basa en este reconocimiento
anticuerpo-antígeno selectivo y específico Se han establecido muchos formatos de
ensayos ELISA cualitativos y cuantitativos. La realización de un ensayo ELISA requiere
como mínimo un anticuerpo específico para un antígeno concreto. De acuerdo con el
método básico, uno de los componentes inmunológicos se inmoviliza en una fase sólida,
en las cavidades de la placa de microtitulación. El analito de la muestra interactúa con el
sistema anticuerpo-antígeno. Esta interacción se puede visualizar mediante enzimas,
enlazadas a antígenos o anticuerpos secundarios, e indica si se ha producido un enlace
antígeno-anticuerpo. La enzima enlazada convierte un sustrato agregado, lo que da lugar
a un cambio de color, que se puede medir mediante un espectrofotómetro.
Toda prueba de ELISA tiene en común los siguientes componentes:
1. Un antígeno o un anticuerpo específico marcado con una enzima (conjugado). Las
enzimas más utilizadas son la peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y
β-galactosidasa.
2. Un soporte para dicho antígeno o anticuerpo. Generalmente se utiliza una placa
de poliestireno con 96 pocillos.
3. Un sustrato que será transformado por la enzima en un producto detectable. Los
productos pueden detectarse por métodos colorimétricos, fluorescentes y
luminiscentes.
4. Un sistema para detectar dicho producto
5. Existen diversos tipos de ELISA, pero los más importantes son el directo, el
indirecto y el de captura o sándwich.
A continuación, se detallan los principios generales de estos tipos primordiales:
✓ ELISA directo:
Permite la detección de antígenos específicos en una muestra. Es poco utilizado
en el laboratorio clínico porque ha sido superado por ELISA de sándwich. En esta
prueba se agrega la muestra del paciente directamente al soporte y permite que
el antígeno buscado, si está presente en la muestra, se adsorba a dicho soporte
(pocillo). Luego se hace un lavado para eliminar todo lo que no se haya unido al
soporte. Posteriormente, se agrega el anticuerpo específico conjugado con la
enzima, el cual se unirá al antígeno si éste se adsorbió al soporte en el paso
anterior.
Luego de una segunda fase de lavado, en la que se elimina todo el conjugado que
no se unió, se agrega el sustrato incoloro y éste es transformado en un producto
detectable, si el conjugado todavía estaba presente.
✓ ELISA indirecto:
Favorece la detección de anticuerpos. En esta prueba, el soporte tiene unido el
antígeno específico contra el que va dirigido el anticuerpo que se está buscando
en la muestra. En el primer paso, se agrega la muestra del paciente, y si el
anticuerpo está presente, se unirá al antígeno que ya estaba adherido al soporte.
Luego se hace un lavado para eliminar todo lo que no se haya unido al antígeno
y, posteriormente, se agrega un anticuerpo antiinmunoglobulina humana
conjugado con una enzima, el cual se unirá al anticuerpo, solo si está presente en
la muestra del paciente. Luego de una segunda fase de lavado, en la que se
elimina todo el conjugado que no se unió, se agrega el sustrato incoloro y éste es
transformado en un producto detectable, si el conjugado todavía estaba presente.
✓ ELISA sándwich:
Ésta es la forma más utilizada para la detección de antígenos. En esta prueba, el
soporte tiene unido un anticuerpo específico contra el antígeno que se está
buscando en la muestra. En el primer paso, se agrega la muestra del paciente y,
si el antígeno está presente, se unirá al anticuerpo que estaba adherido al soporte.
Luego se hace un lavado para eliminar todo lo que no se haya unido al anticuerpo.
Posteriormente se agrega un segundo anticuerpo conjugado con una enzima, que
se une específicamente al antígeno de interés, pero en un epítopo distinto al que
se unió el anticuerpo que estuvo unido al soporte (primer anticuerpo). Luego de
una segunda fase de lavado, en la que se elimina todo el conjugado que no se
unió, se agrega el sustrato incoloro y éste se transforma en un producto detectable
si el conjugado todavía estaba presente. A esta forma descrita también se le
conoce como ELISA de sándwich directo. Existe otra variante de la técnica,
conocida como ELISA de sándwich indirecto. En la variante indirecta se utilizan
tres anticuerpos, debido a que el segundo anticuerpo específico contra el antígeno
no está directamente conjugado a la enzima, sino que se utiliza un tercer
anticuerpo antiinmunoglobulina humana, que sí está conjugado con la enzima
para que se una al segundo anticuerpo. Es decir, lo que en el ELISA de sándwich
directo es logrado mediante el segundo anticuerpo, en el ELISA de sándwich
indirecto se logra por medio del segundo y del tercer anticuerpo. El ELISA de
sándwich indirecto tiene la ventaja de usar un mismo conjugado (anticuerpo
antiinmunoglobulina humana conjugado con una enzima) para todas las pruebas
de detección en las que se aplique la metodología, debido a que el anticuerpo con
especificidad por el antígeno buscado en la prueba no es el que está unido a la
enzima. De esta manera, se evita el costoso proceso de tener que conjugar a la
enzima con cada anticuerpo específico, según el antígeno que se esté buscando
en la prueba.
Procedimiento:

Resultados:
De acuerdo a la experimentación virtual los resultados de los 3 pacientes a los cuales se
les aplico la prueba son los siguientes:
1. Pacinte A: Prueba posiblemente positiva para SLE
2. Paciente B: Prueba posiblemente negativa para SLE
3. Paciente C: Prueba provablemete positiva para SLE

Nota: Se requieren realizar más pruebas para afirmar y comprobar las pruebas
anteriores.

Discusión de resultados:
De acuerdo a los resultados anteriores, al desarrollar la
experimentación virtual el analisis observado de todos
los pasos son correctos excepto el paso 9, marca como
error, el cual menciona que no se llevó a cabo el lavado
de la placa de ELISA por lo que afectaria al arrojar los
resultados, generando un falso positivo. La
experimentación virtual se realizó 3 veces y continuava
mencionando los mismo.
Cuestionario:
1. ¿Por qué es necesario centrifugar?
Las muestras deben centrifugarse para precipitar las células sanguíneas y obtener el
líquido claro conocido como suero. Cualquier célula que quede interferirá con el ensayo
y puede causar que aparezca un resultado positivo independientemente de si el
anticuerpo SLE está presente.
Un ensayo que carece de especificidad y produce un resultado falso positivo no es útil
para hacer un diagnóstico.

2. ¿Por qué se realizan diluciones? ¿Qué es el PBS y para qué se emplea?

Se realizan diluciones en serie para determinar el nivel del anticuerpo en la muestra. Las
muestras altamente diluidas no parecerán positivas si hay un título bajo de anticuerpos
en los sueros. PBS es una solución de laboratorio común que contiene sal de mesa. La
cantidad de sal en el tampón es aproximadamente la misma que la que normalmente se
encuentra en la sangre. El tampón de fosfato evita que la solución se vuelva demasiado
ácida o básica.

3. ¿Por qué la placa ELISA se prepara conforme a diluciones del suero? ¿Por qué
la placa es pretratada con antígeno?
Proteínas como antígenos y otros materiales biológicos pueden, en condiciones
adecuadas, unirse físicamente al material plástico que compone los pocillos de la placa
ELISA. El procedimiento de recubrimiento debe hacerse con cuidado. Si se usa muy poco
antígeno, los puntos desnudos permitirán que se adhieran anticuerpos u otras proteínas,
lo que dará lugar a una reacción de falso positivo. Si se usa demasiado antígeno, el
exceso podrá unirse al anticuerpo SLE del suero del paciente, pero luego se lavará,
creando una reacción de falso negativo. La adición de antígeno es el primer paso crucial
en la cadena de eventos de reconocimiento entre antígeno y anticuerpo que terminará
con la formación de color de la enzima unida al segundo anticuerpo.

4. ¿Por qué es importante la adición del control positivo (anticuerpo anti-DNA) y

negativo (buffer)?
Proteínas como antígenos y otros materiales biológicos pueden, en condiciones
adecuadas, unirse físicamente al material plástico que compone los pocillos de la placa
ELISA. El ensayo ELISA puede estar sujeto a muchos errores. Una es que los reactivos
biológicos y químicos usados en ELISA pueden cambiar con el tiempo. Otra es que el
ELISA no siempre se realiza en condiciones adecuadas. Para descartar tales problemas,
se utilizan dos controles. Un control siempre debe producir una respuesta positiva si los
reactivos y las condiciones son correctos. El segundo control nunca debe producir una
respuesta positiva. Si cualquiera de las muestras de control no reacciona como se
esperaba, entonces no se puede confiar en los resultados de las muestras de los
pacientes y se debe repetir el ensayo. Cualquier suero de un paciente que contenga el
anticuerpo para SLE reconocerá el antígeno en el pocillo y se unirá a él. Cada muestra
de suero contiene muchos tipos diferentes de anticuerpos, pero debido a que son tan
específicos en la forma en que reaccionan, por lo general, ningún anticuerpo reconocerá
el antígeno SLE excepto el anticuerpo SLE.

5. ¿Por qué resulta necesaria la incubación de la placa?

La incubación de muestras de suero en pocillos recubiertos con antígeno ayuda a
garantizar que el anticuerpo presente en la muestra interactúe correctamente con el
antígeno. Debido a que el lupus eritematoso sistémico es una enfermedad de los
humanos, la reacción generalmente ocurre a la temperatura del cuerpo humano, que es
de 37 grados C. El tiempo es importante: la reacción debe durar lo suficiente para que
ocurra una unión adecuada o la medición será artificialmente baja.

6. ¿Por qué se realizan los numerables enjuagues de la placa?

El lavado ayuda a eliminar cualquier anticuerpo que no haya reaccionado con el antígeno
SLE en el pocillo. Cuando se retira el líquido del pozo, el anticuerpo que ha reaccionado
con el antígeno permanece adherido a la superficie del pozo. El anticuerpo sin reaccionar
(no unido) también puede permanecer en el pozo en la pequeña cantidad de líquido que
queda. Este anticuerpo no unido debe eliminarse porque el anticuerpo antihumano
agregado en el siguiente paso reconocerá y reaccionará con cualquier anticuerpo que
quede en el pozo, independientemente de si ese anticuerpo es específico para el
antígeno SLE. Una reacción con un anticuerpo que no sea LES producirá un resultado
falso positivo.

8. ¿Cuál es el fundamento de la adición de anticuerpo secundario acoplado a HRP?

El segundo anticuerpo, a diferencia del primero, no reconoce el antígeno SLE. En
cambio, el anticuerpo antihumano de conejo reacciona con el anticuerpo humano. El
anticuerpo SLE es un anticuerpo humano que puede estar presente en un pozo porque
está retenido por el antígeno. Por lo tanto, el segundo anticuerpo (de conejo) reconocerá
este anticuerpo y se unirá a él. Si el pocillo no se ha lavado a fondo, es posible que
todavía queden otros anticuerpos humanos que también reaccionarán con el segundo
anticuerpo. La reacción de un anticuerpo humano no SLE con el segundo anticuerpo
producirá un resultado falso positivo.
9. ¿Por qué es importante la adición de la solución tampón con sustrato HRP?
Una de las enzimas más utilizadas que se pueden unir a los anticuerpos se llama
peroxidasa de rábano picante. La enzima, junto con el peróxido de hidrógeno, actúa
sobre una sustancia química llamada ABTS (ácido 2,2'-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-
sulfónico) para producir una solución amarilla que puede estimarse a simple vista o
medirse cuantitativamente en un espectrómetro a 414 nanómetros.

10. ¿Por qué debe esperarse al menos 15 minutos para visualizar el resultado del
ensayo?
Si el temporizador se establece en menos de 15 minutos, no se producirá la reacción
adecuada y no se observará ningún color al final del ensayo. El observador registrará los
resultados incorrectamente como falsos negativos.

Conclusión:
El ELISA es de los métodos más utilizados en los laboratorios de análisis inmunológicos
clínicos y de investigación, por lo que es importante para los QFB conocer el
procedimiento de este método y sus diferentes variantes. Es un método cuantitativo de
suma importancia al momento de diagnosticar una variedad de padecimientos, desde
alergias y la presencia de virus, hasta cánceres y enfermedades autoinmunes.
Dado que la práctica se llevó a cabo de manera virtual podemos concluir que el
procedimiento mencionado en el manual así como el del entorno virtual que se utilizó
quedaron comprendidos al igual que la importancia de esta técnica en diferentes
situaciones clínicas y de investigación.

Referencias:
▪ Ensayos ELISA: Inmunoensayos eficientes para análisis alimentario | R-Biopharm.
(2019, 6 febrero). Food & Feed Analysis. https://food.r-
biopharm.com/es/tecnologias/elisa/
▪ Ríos Yuil, J. M., Mercadillo Pérez, P., Yuil De Ríos, E., & Ríos Castro, M. (2012).
ELISA y sus aplicaciones en la dermatología. Dermatología cosmética, médica y
quirúrgica., 10, 212–222. https://www.medigraphic.com/pdfs/cosmetica/dcm-
2012/dcm123j.com