TÉCNICAS PARA LA DETERMINACION DE HORMONAS

Para la determinación de hormonas y sus metabolitos pueden utilizarse diversos métodos:

químicos, espectrofotométricos, cromatográficos. Los más utilizados son las técnicas
inmunoquímicas:

1. Radioinmunoanálisis (RIA).
2. Enzimoinmunoanálisis (EIA).
3. Fluoroenzimoinmunoanálisis (FIA).
4. Quimioluminoinmunoanálisis.

1. RADIOINMUNOANÁLISIS

Es una técnica inmunológica propuesta en 1959 por Yallow y Berson, tiene una gran aplicación
en clínica. Permite la cuantificación exacta de compuestos biológicos presentes en el organismo
en concentraciones tan bajas como ng/ml o pg/ml, incluso hacerlo en mezclas con enormes
cantidades y diversidad de materiales extraños, por lo que no es necesario purificar previamente
la muestra.

Fundamento:

Se basa en una reacción antígeno-anticuerpo. Los anticuerpos deben ser específicos contra la
substancia que queremos determinar, y tener una gran afinidad. La cantidad de anticuerpo
añadida al análisis es limitada, e inferior a la cantidad de antígeno total. Por lo que va a quedar
saturado con él. El antígeno es la hormona (de la muestra) que queremos determinar, (antígeno
frío). Además del antígeno (hormona) presente en la muestra problema, se va a añadir una
cantidad constante y conocida de antígeno pero marcado (antígeno caliente). Los antígenos
marcados se forman sustituyendo algunos de los átomos normales del antígeno por los
correspondientes isótopos radiactivos (H3=tritio, P 32), o introduciendo radioisótopos extraños
en la molécula (yodo=I125 unido a un resto de TYR). Los dos tipos de antígenos, frío y caliente,
van a competir, en igualdad de condiciones, por unirse con el anticuerpo disponible. Las
concentraciones del antígeno marcado y del anticuerpo son constantes, la única variable del
sistema es la concentración de antígeno no marcado (muestra problema). Cuanto mayor sea la
cantidad de antígeno frío en la muestra problema, este desplazará al antígeno caliente y por
tanto se fijarán al anticuerpo cantidades menores de antígeno marcado.

Así pues, la formación de complejos radiactivos (Ag*-Ac) varía en función de la concentración

del antígeno no marcado: a mayor concentración de antígeno no marcado, mayor formación de
complejos antígeno-anticuerpo no marcados, y menor formación de complejos radiactivos, y
viceversa.

Separación de las fases ligada y no ligada: tras la reacción antígeno-anticuerpo, en el tubo de

reacción encontraremos:

Las fracciones libres, constituidas por antígeno frío y antígeno marcado.

Las fracciones ligadas formadas por complejos antígeno-anticuerpo y antígeno marcado-

anticuerpo. Sin embargo, la radiactividad total en el tubo permanece constante antes y después
de la reacción, por lo que hay que separar la fase ligada de la no ligada y contar la radiactividad
en una de ellas, sin interferencia de la otra.

Hay diferentes métodos de separación están basados en las distintas propiedades del antígeno
libre y del complejo antígeno-anticuerpo:

· Adsorción, precipitación química, precipitación inmunológica, fase sólida.

Una vez separadas las fases, se lee la radiactividad de la fase ligada utilizando un contador
gamma, si el isótopo utilizado para el marcaje es I125, o un contador beta en el caso de haber
marcado con tritio (3H). Un contador de centelleo no detecta directamente la presencia de un
radioisótopo sino que la muestra radiactiva se halla dispersa en el centelleador. El centelleador
es un líquido con propiedades fluorescentes. Como consecuencia de las desintegraciones
radiactivas se excitan las moléculas del líquido de centelleo y emiten fluorescencia que es
detectada en el contador.

2. ENZIMOINMUNOANÁLISIS (EIA)

Son técnicas inmunoquímicas cuantitativas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo como en

el RIA, y siguiendo un protocolo experimental similar. La diferencia consiste en que, en este caso,
el marcaje se hace con un enzima en vez de con un isótopo radiactivo. Se puede marcar tanto el
antígeno como el anticuerpo. La cuantificación se hace, basándose en la medida de la actividad
del enzima marcador. Tras la formación del complejo antígeno-anticuerpo, en el momento
adecuado, se añade un sustrato que es catalizado por el enzima transformándose en un
compuesto coloreado lo que permite la medida de la actividad enzimática con ayuda de un
espectrofotómetro. Esta medida de la actividad nos servirá para calcular la concentración de la
molécula problema.

Los EIA pueden ser de dos tipos: homogéneos y heterogéneos.

Los ensayos homogéneos no requieren lavado o separación física de las sustancias

reaccionantes antes de medir la actividad enzimática. Los ensayos heterogéneos sí necesitan
la separación física de los reaccionantes en las fracciones libre y ligada antes de la determinación
de la actividad del enzima marcador.

EIA homogéneo: no requiere la separación de las fracciones ligada y libre resultantes de la

reacción inmunológica. Los reactivos necesarios son el anticuerpo y el antígeno marcado con el
enzima.

Fundamento: Se basa en la competencia por el anticuerpo entre la sustancia problema y la

marcada con el enzima. Cuando el antígeno marcado se une al anticuerpo, este impide el acceso
del sustrato al centro activo del enzima, por lo que anula su actividad. A mayor concentración
de la molécula problema, menor cantidad de antígeno marcado se unirá al anticuerpo,
quedando mayor cantidad de antígeno marcado libre con el enzima activo dando una mayor
actividad. En resumen, a mayor concentración mayor actividad, sin necesidad de separar las
fracciones.
EIA heterogéneo: requiere la separación de las fracciones ligada y libre resultantes de la
reacción inmunológica. En esta, los reactivos son el anticuerpo y el antígeno marcado con el
enzima.

Fundamento: El antígeno de la muestra problema y el marcado compiten por el anticuerpo, de

forma que cuanto mayor sea la cantidad de antígeno presente en la muestra problema, mayor
cantidad de antígeno marcado con el enzima quedará sin unirse al anticuerpo. En este caso la
actividad del enzima no se anula por la unión antígeno-anticuerpo. Se separan los complejos
antígeno (marcado y no marcado)-anticuerpo, se añade el sustrato del enzima para que se
produzca la reacción enzimática y se mide su actividad. La actividad será inversamente
proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra.

ELISA

Hay una variedad del EIA en la que se utiliza una fase sólida como método de separación, lo que
es lo más habitual, recibe el nombre de ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).

ELISA tipo sándwich de antígeno es la variedad de ELISA más utilizada y que da mejores
resultados. Reactivos: Anticuerpo monoclonal ligado a la fase sólida, anticuerpo monoclonal
marcado con el enzima. Se usan dos anticuerpos monoclonales diferentes contra determinantes
distintos del mismo antígeno, lo que permite que los dos se puedan unir al antígeno al mismo
tiempo, pero por sitios diferentes. Los anticuerpos específicos se encuentran en exceso unidos
a la fase sólida (V.g. la pared del tubo de análisis), de forma que toda la hormona presente en la
muestra problema reacciona con ellos quedando inmovilizada. A continuación se lava el tubo
para eliminar el resto de moléculas sin interés (no unidas). Se añade un exceso de anticuerpos
marcados con el enzima. Estos anticuerpos también se unen al antígeno del complejo
inmovilizado, pero por otro determinante antigénico diferente. Tras otro lavado que elimina el
exceso de anticuerpo marcado no unido, se añade el sustrato y se cuantifica la reacción. La
formación de producto será directamente proporcional a la concentración de antígeno en la
muestra.

3. FLUOROINMUNOANÁLISIS (FIA)

Esta técnica sigue un protocolo básicamente igual al descrito para EIA, con la diferencia de
utilizar como marcador una molécula fluorescente o un sustrato que por la acción de un enzima
se transforma en una molécula fluorescente. La lectura de fluorescencia es utilizada para el
cálculo de los resultados en la misma forma que en RIA. NOTA: Las moléculas fluorescentes son
aquellas que al ser excitadas por una radiación con una longitud de onda determinada,
inmediatamente emiten una radiación con una longitud de onda mayor que es medida por un
espectrofluorímetro. (fluorescencia es distinto que fosforescencia)

4. QUIMIOLUMINOINMUNOANÁLISIS

Esta técnica sigue un protocolo básicamente igual al descrito para EIA, con la única diferencia de
utilizar como enzima ligada un enzima (ej. peroxidasa) que cataliza la oxidación de un sustrato
adecuado (ej. luminol + peróxido de hidrógeno). Este sustrato, al oxidarse, alcanza un estado de
excitación electrónica, y al volver posteriormente los electrones a sus órbitas primitivas de
menor energía, emiten la diferencia en forma de energía luminosa (=luminiscencia).Esta energía
luminosa es medida en un luminómetro. La lectura de luminiscencia es utilizada para el cálculo
de los resultados en la misma forma que en RIA.