Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
COLOMBIANA 4458
2007-12-12
CORRESPONDENCIA:
I.C.S.: 07.100.30
ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.
La NTC 4458 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo de 2007-12-12.
Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.
DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)
CONTENIDO
Página
1. OBJETO .......................................................................................................................1
4. PRINCIPIO....................................................................................................................2
5.2 DILUYENTE..................................................................................................................3
5.5 MEDIO SELECTIVO SÓLIDO: AGAR CON TRIPTONA BILIS X GLUCORÓNIDO ...5
6.2 INCUBADORA..............................................................................................................6
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)
Página
7. MUESTREO..................................................................................................................6
9. PROCEDIMIENTO........................................................................................................7
Página
ANEXOS
ANEXO A (Normativo)
LÍMITES DE CONFIANZA PARA LA ESTIMACIÓN DE NÚMEROS PEQUEÑOS
DE COLONIAS.......................................................................................................................11
ANEXO B (Informativo)
BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................12
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)
1. OBJETO
NOTA Esta norma no aplica para la detección de E. coli H7 O157 (véase la NTC 4899).
2. REFERENCIAS NORMATIVAS
NTC 4206, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Reglas Generales para
los análisis microbiológicos (ISO 7218).
1 de 12
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)
3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES
NOTA Se define como coliformes fecales, aquellos microorganismos que fermentan la lactosa a 44,5 °C - 45,5 °C,
análisis que permite descartar a Enterobacter, puesto que ésta no crece a esa temperatura. Si se aplica este criterio
crecerán en el medio de cultivo principalmente E. coli (90 %) y algunas bacterias de los géneros Klebsiella y
Citrobacter. La prueba de coliformes fecales positiva indica un 90 % de probabilidad de que el coliforme aislado sea
E. coli. Sirven como indicadores de contaminación fecal.
3.2 Escherichia coli. Bacilo corto gram negativo que forma parte de la flora normal de
intestino de animales de sangre caliente. Es aerobio facultativo, de metabolismo fermentativo,
O-Nitrofenli-β-D- galactopiranósido positivo y su crecimiento óptimo es a 37 °C. Algunas cepas
pueden producir enterotoxinas y tiene otros factores de virulencia de colonización e invasión
por lo cual pueden causar enfermedades diarreicas, así como infecciones urinarias y
nosocomiales.
4. PRINCIPIO
Cuando se utiliza la técnica enzimática, el grupo coliforme se define como toda bacteria que
posea la enzima β-D galactosidasa; la cual tiene la propiedad de actuar sobre el substrato
cromogénico, formado en la liberación del cromógeno.
Cuando se utiliza la técnica enzimática, la Escherichia coli es definida, como toda bacteria que
da respuesta positiva al grupo coliforme y posee además la enzima B-Glucoronidasa, la cual
tiene la propiedad de abrir el substrato fluorogénico, resultando en la liberación del fluorógeno.
El medio de cultivo utilizado se basa en la tecnología del substrato definido, el cual emplea
nutrientes - indicadores que producen color, fluorescencia, o ambos, al ser metabolizados por
los microorganismos coliformes y E. coli; los cuales son detectados simultáneamente.
2
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)
4.4 GENERALIDADES
4.4.1 Se realizan siembras utilizando un medio de cultivo selectivo y empleando una cantidad
especificada de la muestra de ensayo si el producto inicial es líquido, o una cantidad
especificada de una suspensión inicial en el caso de otros productos.
NOTA Para productos lácteos la incubación de los coliformes debe hacerse a 32 ± 1 °C durante 24 ± 2 h.
4.4.3 Se calcula el número de coliformes y E. coli por mililitro o por gramo de muestra a partir
del número de colonias obtenido en las cajas seleccionadas (véase el numeral 10).
5.1 GENERALIDADES
Para los procedimientos de laboratorio corrientes, véase la NTC 4206 (ISO 7218).
5.2 DILUYENTE
Véanse las normas NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3, NTC 4491-4 y la norma específica
relacionada con el producto sometido a análisis.
NOTA Se utiliza el medio VRBL o cualquier otro similar preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Peptona 7,0 g
Lactosa 10,0 g
3
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)
Agar 12 g a 18 g 1
5.3.2 Preparación
Verificar si hay evidencia que después de las tres horas se ven afectados los recuentos.
Peptona 7,0 g
Lactosa 10,0 g
1
De acuerdo con la resistencia del gel del agar.
4
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)
Agar 12 g a 18 g 2
5.4.2 Preparación
Se mezclan muy bien en agua, los componentes o el medio completo deshidratado, y se dejan
reposar durante varios minutos. Se verifica el pH después del calentamiento, este debe ser de
7,4 ± 0.2 a 25 °C.
5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-glucuronido
Peptona 20,0 g
Agar 15,0 g
5.5.2 Preparación
NOTA La determinación de coliformes, E. coli o ambos puede realizarse también por los siguientes métodos:
siembra en membranas hidrofóbicas con MUG, PCR ó inmunoprecipitación (VIP), enzimoinmunoensayos (EIA).
2
De acuerdo con la resistencia del gel del agar.
5
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)
NOTA El equipo y material desechable es una alternativa aceptable frente al material de vidrio reutilizable si
cumple con las especificaciones adecuadas.
6.2 INCUBADORA
O equipo similar, con capacidad de operar a 45 °C ± 2 °C (para mantener los medios de cultivo
antes de la siembra).
6.7 MEDIDOR DE pH
7. MUESTREO
El muestreo se debe haber efectuado de acuerdo con la norma específica apropiada para el
producto que se estudia ó de acuerdo con la AOAC (Oficial Methods of Análisis of AOAC
International). Si no existe una norma específica, se recomienda que las partes interesadas
lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.
La muestra de ensayo se debe preparar de acuerdo con las normas de la colección NTC 4491
para muestras microbiológicas o normas que traten acerca del producto que interese. Si no
existe norma específica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre
este punto.
6
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)
9. PROCEDIMIENTO
Véanse las normas NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3, NTC 4491-4 y la norma específica
apropiada para el producto que interese.
9.2.1 Se toman dos cajas de Petri estériles (véase el numeral 6.3). Usando una pipeta estéril
(véase el numeral 6.4), se transfiere a cada caja 1 ml de la muestra de ensayo, si el producto
es líquido o 1 ml de la suspensión inicial en el caso de otros productos (véase el numeral 9.1).
Se toman otras dos cajas de Petri estériles. Usando otra pipeta estéril, se transfiere a cada
caja 1 ml de la primera dilución decimal (10-1) de la muestra de ensayo, si el producto es
líquido o 1 ml de la primera dilución decimal (10-2) de la suspensión inicial en el caso de otros
productos.
Se repite el procedimiento descrito con las diluciones adicionales, usando una pipeta estéril
para cada dilución decimal.
Cuidadosamente se mezcla el inóculo con el medio y se deja solidificar la mezcla, estando las
cajas de Petri sobre una superficie horizontal fría.
9.2.5 Si el objeto del análisis es solo la determinación de E. coli, para una mejor
recuperación de bacterias injuriadas, incubar a 35 °C ± 1 °C (si son productos lácteos incubar
a 30 °C ± 1 °C) las primeras 4 horas y después incubar a 44 °C ± 1 °C por 18 h a 20 h.
Después del período especificado de incubación (véase el numeral 9.2.4), se cuentan las
colonias coliformes características en cada caja que contenga no más de 150 colonias3, ya
sean características o no, usando el equipo para el recuento de colonias.
NOTA Después de la incubación durante 24 h, las colonias características son de color rojo púrpura con un
diámetro de 0,5 mm o mayor, y algunas veces están rodeadas de una zona rojiza de bilis precipitada.
3
Por encima de este número existe el riesgo de que las colonias coliformes tengan una apariencia atípica.
7
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)
Después del periodo especificado de incubación (véanse los numerales 9.2.4 para coliformes y
9.2.5 para E.coli), realizar el conteo de coliformes, incluyendo la E. coli y expresar
independiente el conteo de bacterias coliformes del conteo de bacterias E. coli glucoronidasa
positivas, utilizando el equipo para el recuento de colonias (véase el numeral 6.6).
Examinar las cajas de petri usando una lámpara de luz ultravioleta (preferiblemente de 6 watios,
de onda larga (366 nm)).
Examinar las cajas de petri que presentan colonias de color azul verdosas (T,B,X, D
glucorónido). Se presume que la prueba es positiva para la presencia de E. coli.
10.3 Escherichia coli – medio agar con triptona bilis x glucorónido 5-bromo-4-cloro-3-
indolil-D-glucuronido
Examinar las cajas de petri que presentan colonias de color verde azuladas (D-glucorónido). Se
presume que la prueba es positiva para la presencia de E. coli.
Se seleccionan las cajas que contengan no más de 150 colonias características en dos
diluciones consecutivas. Es necesario que una de estas cajas contenga al menos 15 colonias
características.
Se calcula el número N de colonias por mililitro o por gramo de producto, dependiendo del
caso, usando la siguiente ecuación:
∑C
N=
(n1 + 0,1 n2 )d
en donde
8
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)
∑C 83 + 97 +13 + 8 201
N= = = = 9136
(n1 + 0,1 n2) d (2 + 0,1 x 2 ) x 10 − 2 0,022
Al redondear el resultado como se indicó antes, se obtiene 9 100 ó 9,1 x 103 UFC/ml o UFC/g
de producto.
EJEMPLO
- En una dilución de 10-4 : 140 y 145 colonias, de las cuales 5 y 3 respectivamente fueron
características.
-5
- En una dilución de 10 : 11 y 8 colonias, de las cuales 0 y 1 respectivamente fueron
características.
5 + 3 + 0+1 9
NE = = = 40 000
(2 + 0,1 x 2) x 10 −4 2,2 x 10 −4
9
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)
12. PRECISIÓN
Consúltese la Tabla A.1. Para obtener los límites de confianza, se multiplican los límites
superior e inferior dados por 1/d, en donde d es el factor de dilución.
- el resultado obtenido.
10
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)
ANEXO A
(Normativo)
En la Tabla A.1 se dan los límites de confianza al nivel del 95 % para la estimación de números
pequeños, cuando el número de colonias en las cajas seleccionadas es menor de 15.
Tabla A.1
1 <1 2
2 <1 4
3 <1 5
4 1 6
5 2 9
6 2 10
7 2 12
8 3 13
9 4 14
10 4 16
11 5 18
12 6 19
13 7 20
14 7 21
15 8 23
11
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualización)
ANEXO B
(Informativo)
BIBLIOGRAFÍA
[1] The Scientific Association Dedicated to Analytical Excellence, Official Methods of Analysis
of AOAC International. Method 996.02. Colifrms and E. coli in food, plate count technique.
Chapter 17. 18th Edition, 2005.
[3] GTC 125, Guía de referencias de métodos horizontales de análisis microbiológicos para
bebidas, alimentos y alimentos para animales. Tabla No. 8. 2006.
[4] Fluorocult® LMX Broth modified acc_ to MANAFI and OSSMER.htm. 2006-11-12.
[7] William B. Whitman. Bergey's Manual Trust. Department of Microbiology. 527 Biological
Sciences Building. University of Georgia. Athens, GA 30602-2605. USA.
12