NTC4779 Recuento de Estafilococos Cuagulasa Positiva

NORMA TÉCNICA NTC
COLOMBIANA 4779
2007-08-29
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS

PARA ANIMALES.
MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE
ESTAFILOCOCOS COAGULASA POSITIVA
(Staphylococcus aureus y otras especies)
E: MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING STUFFS.

HORIZONTAL METHOD FOR THE ENUMERATION OF
COAGULASE-POSITIVE STAPHYLOCOCCI (STAPHYLOCOCCUS
AUREUS Y OTHER SPECIES)
CORRESPONDENCIA: esta norma es una adopción

modificada (MOD) a la ISO 6881-1:
2003 e ISO 6881-2: 1999.
DESCRIPTORES: microbiología; análisis microbiológico;

recuento; Staphylococcus aureus;
estafilococos; recuento de colonias;
método horizontal; coagulasa
positiva; alimentación animal;
producto alimenticio.
I.C.S.: 07.100.30
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435
Prohibida su reproducción Primera actualización

Editada 2007-09-10
PRÓLOGO
El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo

nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.
ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.
La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.
La NTC 4779 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo del 2007-08-29.
Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través
de su participación en el Comité Técnico 25 Microbiología.
ACEGRASAS S.A. INDUSTRIA PRODUCTORA DE ACEITES

ALGARRA S.A. RENOVABLES
ALIMENTOS POLAR S.A. IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA.
ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS. JOHNSON DIVERSEY
S.A. KOYOMAD S.A.
ASEBIOL LABORATORIO LTDA. LABCONTROL E.U.
ASINAL LTDA LABFARVE LABORATORIO DE
ASOCIACIÓN DE MICROBIÓLOGOS FARMACOLOGÍA VEGETAL
JAVERIANOS LABORATORIO DE GENÉTICA Y
BIANÁLISIS BIOLOGÍA MOLECULAR
BIOCONTROL LTDA. LABORATORIO EMICAL LTDA.
BIOMERIEUX COLOMBIA LABORATORIO GRAM
BIOQUILAB LTDA. LABORATORIO MICROLAB LTDA.
CALIDAD INDUSTRIAL LTDA. LARKIN
CARULLA VIVERO S.A. LESNIAK E.U.
CERCAL LTDA. MERCADEO DE ALIMENTOS DE
COLFRIGOS S.A. COLOMBIA S.A.
COLOMBINA S.A. MERCK S.A.
COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES MICROBIÓLOGOS ASOCIADOS LTDA.
S.A. NULAB LTDA.
CREPES & WAFLES S.A. QUIK LTDA.
DU PONT QUALICON QUÍMICOS Y REACTIVOS LTDA.
ENZIPAN DE COLOMBIA LTDA QUIMIREL
FÁBRICA DE ESPECIAS Y SECRETARÍA DISTRITAL DE SALUD
CONDIMENTOS EL REY S.A. SUIZO S.A.
FRIGORÍFICOS COLOMBIANOS S.A. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
INDEPENDIENTE. UNIVERSIDAD MANUELA BELTRÁN
Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las
siguientes empresas:
3M COLOMBIA S.A. LABORATORIOS GRAM LTDA.

AQUALAB LABORATOTORIO MICROBIOLÓGICO DE
ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE CIENCIA BARRANQUILLA
Y TECNOLOGÍA COSMÉTICA ACCYTEC LEVAPÁN S.A.
AVESCO S.A. LLOREDA GRASAS S.A.
BAVARIA S.A. MEDIIMPLANTES LTDA.
BIOTRENDS LABORATORIOS LTDA. MICROLABY LTDA.
INDEPENDIENTE-BLANCA USECHE MINISTERIO DE LA PROTECCIÓN
CASA LUKER S.A. SOCIAL
CENICAÑA NESTLÉ DE COLOMBIA S.A.
CENTROAGUAS S.A. E.S.P. PASIFLORA COLOMBIANA S.A.
CERVECERÍA LEONA S.A. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
CONGELAGRO PRODUCTORA DE CONCENTRADOS Y
COOPERATIVA DE GANADEROS DE JUGOS DE FRUTA
CARTAGENA LTDA. PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS
EMPRESA DE ACUEDUCTO Y LTDA.
ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ QUALA S.A.
FRIGORÍFICO GUADALUPE S.A. QUIOS LTDA.
FRIGORÍFICO SUIZO S.A. REPRESENTACIONES
FRUGAL S.A. BIOTECNOLÓGICAS LTDA.
HOSPITAL DEPARTAMENTAL DE RICA RONDO, INDUSTRIA NACIONAL DE
VILLAVICENCIO ALIMENTOS S.A.
INGENIO PICHICHI S.A. SCHERING COLOMBIANA S.A.
INGENIO RIOPAILA TECNIMICRO LABORATORIO DE
ICA ANÁLISIS
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD
INVIMA - INSTITUTO NACIONAL DE PÚBLICA
VIGILANCIA MÉDICA UNIVERSIDAD CATÓLICA INGECAL
LA CONSTANCIA COLOMBIA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
LABORATORIO MICROBIOLÓGICO SIS VIKINGOS
ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.
DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4779 (Primera actualización)
CONTENIDO
Página
0. INTRODUCCIÓN ..........................................................................................................1
1. OBJETO .......................................................................................................................1
2. REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................2
3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES .....................................................................................2
4. PRINCIPIO....................................................................................................................2
5. DILUYENTE Y MEDIO DE CULTIVO...........................................................................3
5.1 GENERAL ....................................................................................................................3
5.2 DILUYENTE..................................................................................................................3
5.3 MEDIO BAIRD-PARKER .............................................................................................3
5.4 CALDO INFUSIÓN CEREBRO-CORAZÓN.................................................................6
6. EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO ........................................................6
7. MUESTREO..................................................................................................................7
8. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO.......................................................7
9. PROCEDIMIENTO........................................................................................................7
9.1 PORCIÓN DE ENSAYO ...............................................................................................7
9.2 INOCULACIÓN E INCUBACIÓN CUANDO SE EMPLEA BAIRD PARKER ..............7
9.3 SELECCIÓN DE LAS CAJAS E INTERPRETACIÓN .................................................8

Página
9.4 CONFIRMACIÓN (PRUEBA DE LA COAGULASA) ...................................................9
10. EXPRESIÓN DE RESULTADOS .................................................................................9
10.1 CASO GENERAL .........................................................................................................9
10.2 ESTIMACIÓN DE NÚMEROS BAJOS.......................................................................11
11. PRECISIÓN ................................................................................................................12
11.1 GENERALIDADES.....................................................................................................12
11.2 REPETIBILIDAD ........................................................................................................12
11.3 REPRODUCIBILIDAD................................................................................................13
12. INFORME DE ENSAYO .............................................................................................14
BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................24
DOCUMENTO DE REFERENCIA..........................................................................................25
ANEXO A (Informativo)
RESULTADOS DE UN ESTUDIO INTERLABORATORIOS.................................................15
ANEXO B (Informativo)
MEDIO DE CULTIVO ALTERNO...........................................................................................18
ANEXO C (Informativo)
CUADRO COMPARATIVO RESPECTO DE LAS MODIFICACIONES REALIZADAS
A LA NTC 4779 (Primera actualización) Y LA NTC 4491: 2000.........................................21
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES.

MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE ESTAFILOCOCOS
COAGULASA-POSITIVA (Staphylococcus aureus Y OTRAS ESPECIES)
0. INTRODUCCIÓN
0.1 Debido a la gran variedad de productos alimenticios, este método horizontal puede no ser
apropiado en detalle para ciertos productos. En este caso, diferentes métodos, los cuales son
específicos para esos productos, pueden ser usados si es absolutamente necesario por razones
técnicas justificadas. No obstante, debe intentarse la aplicación de este método horizontal como
sea posible.
La armonización de métodos de ensayo no puede ser inmediata y para ciertos productos,

pueden existir normas internacionales, normas nacionales, o ambas, que no cumplan con este
método horizontal. Se espera que cuando tales normas sean revisadas habrá cambios para
cumplir con ésta de tal forma que eventualmente los apartes que queden de este método
horizontal serán aquellos con razones técnicas bien establecidas.
0.2 La norma describe dos métodos horizontales para el recuento de estafilococos coagulasa-
positiva entre las que se encuentran cepas enterotoxigénicas. Esto tiene que ver más con
Staphylococcus aureus, pero también con S. intermedius y ciertas cepas de S. hyicus.
En general, se usa la técnica con agar Baird Parker. En casos de encontrar colonias atípicas
de estafilococo o flora acompañante en el agar Baird Parker, procedentes de ciertas muestras
(como quesos hechos de la leche cruda o ciertos productos a base de carne cruda, se
recomienda utilizar alternativamente la técnica de agar fibrinógeno de plasma de conejo [véase
el Anexo B Informativo]).
0.3 Para los propósitos de esta norma, la confirmación de estafilococos está basada en una
reacción positiva de la coagulasa, pero está reconocido que algunas cepas de Staphylococcus
aureus dan reacciones coagulasa-positivas débiles. Estas últimas cepas se pueden confundir
con otras bacterias pero se pueden diferenciar usando ensayos adicionales no incluidos en
esta norma, tales como la sensibilidad a la lisostafina, la producción de hemolisina, de
nucleasa termoestable y de ácido a partir de manitol (véase referencia [1]).
1. OBJETO
Esta norma especifica los métodos horizontales para el recuento de estafilococos coagulasa-
positiva en productos destinado al consumo humano o para la alimentación de animales,
mediante el recuento de colonias obtenidas en medio sólido (medio Baird-Parker o medio
1 de 25
plasma de conejo fibrinógeno como medio alternativo[véase el Anexo B (Informativo)] después

de incubación aeróbica a 35 °C ± 2 °C.
2. REFERENCIAS NORMATIVAS
Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicación de este
documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica únicamente la edición citada. Para
referencias no fechadas, se aplica la última edición del documento normativo referenciado (incluida
cualquier corrección).
NTC 4092, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Requisitos generales para
el examen microbiológico (ISO 7218).
NTC 4491-1, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Preparación de muestras para
ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los análisis microbiológicos. Parte 1: Reglas
generales para la preparación de la suspensión inicial y de diluciones decimales (ISO 6887-1).
NTC 4491-2, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Preparación de muestras

para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los análisis microbiológicos. Parte 2:
Reglas específicas para la preparación de carne y productos cárnicos (ISO 6887-2).
NTC 4491-3, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Preparación de

muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los análisis
microbiológicos. Parte 3. Reglas específicas para preparación de muestras de pescado y
productos de la pesca (ISO 6887-3).
NTC 4491-4, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Preparación de muestras

para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los análisis microbiológicos. Parte 4.
Reglas específicas para la preparación de productos deferentes de leche, productos lácteos, carne,
productos cárnicos, pescado y productos de la pesca (ISO 6887-4).
3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES
Para los propósitos de esta norma se aplican los siguientes términos y definiciones:
3.1 Estafilococos coagulasa-positiva. Bacteria esférica aeróbica, gram (+), que aparece
aislada, formando parejas, tétradas o agrupadas en racimos, inmóviles, capaces de coagular el
plasma, convirtiendo el fibrinógeno en fibrina siguiendo el método especificado en esta norma.
3.2 Recuento de estafilococos coagulasa-positiva. Determinación del número de

estafilococos coagulasa-POSITIVA encontrados por mililitro o por gramo de muestra cuando el
ensayo se lleva a cabo de acuerdo con el método especificado en esta norma.
4. PRINCIPIO
NOTA Para la preparación de la dilución inicial de la muestra se debe consultar la NTC 4491-1 o la norma respectiva,
según el producto.
4.1 Se inocula en la superficie de un medio de cultivo selectivo sólido, usando cajas de

petri por duplicado, una cantidad específica de muestra de ensayo.
2
4.2 Se incuba las cajas en condiciones aeróbicas a 35 °C ± 1°C y se realiza la lectura a las
24 h y 48 h.
4.3 Se calcula del número de estafilococos coagulasa-positiva por mililitro, o por gramo, de
muestra a partir del número de colonias típicas, colonias atípicas, o ambas, obtenidas en cajas
de los niveles de dilución escogidos de tal forma que de un resultado significativo, y
confirmado con el resultado positivo de la prueba de la coagulasa.
NOTA La determinación de S. aureus puede realizarse también por los siguientes métodos: siembra en membranas
hidrofóbicas, PCR u otros método búsqueda.
5. DILUYENTE Y MEDIO DE CULTIVO
5.1 GENERAL
Para la práctica actual de laboratorio, Véase la NTC 4092.
5.2 DILUYENTE
Véanse las NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3, NTC 4491-4 y la norma específica
relacionada con el producto a examinar.
5.3 MEDIO BAIRD-PARKER1)
Se puede usar medios de cultivo comercialmente disponibles. En tal caso, deben seguirse
cuidadosamente las instrucciones del fabricante.
5.3.1 Medio base
5.3.1.1 Composición
Caseína por digestión pancreática 10,0 g

Extracto de levadura 1,0 g
Extracto de carne 5,0 g
Piruvato de sodio 10,0 g
L-Glicina 12,0 g
Cloruro de litio 5,0 g
Agar 12 g a 22 g1)
Agua 1 000 ml
1)
Dependiendo de la fuerza de gel del agar
5.3.1.2 Preparación
- Se disuelven los componentes de la base completa deshidratada en agua hasta

ebullición.
- Se ajusta el pH de tal forma que después de la esterilización sea de 7,2 ± 0,2 a

25 °C.
Se transfiere el medio en cantidades de 100 ml a erlenmeyers ó frascos (Véase el numeral 6.5)

de capacidad apropiada.
El medio es agar Baird- Parker (véase la referencia [2]) con la adición de sulfametazina (véase la referencia
1)
[3] si se sospecha de la presencia de Proteus.

3
Se esteriliza el medio por 15 min. a 121 °C.
5.3.2 Soluciones
5.3.2.1 Solución de telurito de potasio
5.3.2.1.1 Composición
Telurito de potasio1) (K2TeO3) 1,0 g

Agua destilada o desionizada 100 ml
1)
Se recomienda asegurarse previamente de que el telurito de
potasio disponible es apropiado para este ensayo (Véase
numeral 5.3.2.1.2)
5.3.2.1.2 Preparación
- Se disuelve el telurito de potasio en el agua calentando lentamente hasta disolución

completa.
- El sólido debe ser soluble. Si se presenta material blanco insoluble, se descarta el

reactivo.
- Se esteriliza por filtración usando membranas con un tamaño de poro de 0,22 μm.
- La solución puede ser almacenada como máximo por un mes a 3 °C ± 2 °C.
- Se descarta la solución si se forma un precipitado blanco.
5.3.2.2 Emulsión de yema de huevo (concentración aproximada del 20 % o de acuerdo con las
instrucciones del fabricante)
NOTA Si se dispone de una preparación comercial, debería usarse.
Se usan huevos de gallina con las cáscaras intactas que tengan menos de siete días. Se lavan
los huevos con un cepillo en detergente líquido. Se enjuagan con agua corriente, luego se
desinfectan sumergiéndolos en etanol al 95 % (V/V) durante 30 s o etanol al 70 % durante 1 h y
se secan. Empleando procedimientos asépticos, se rompe cada huevo y se separa la yema de
la clara. Se colocan las yemas en una probeta estéril para su medición y se añaden 4 partes
por volumen de agua estéril y/o solución salina al 0,85 %. Se transfiere asépticamente a un
matraz estéril y se mezcla vigorosamente.
Se calienta la mezcla por 2 h en un baño de maría a 45 °C. Luego se deja por 18 h a 24 h a

una temperatura a 3 °C ± 2 °C para permitir que se forme un precipitado.
Se retira asépticamente el sobrenadante. La solución debe ser en lo posible utilizada en su

totalidad.
Se adiciona, bajo condiciones asépticas, la yema de huevo. Se mezcla bien después de cada
adición mediante rotación para minimizar la formación de espuma.
Servir inmediatamente en las cajas de petri.
5.3.2.3 Solución de Sulfamezatina (sulfametazina, sulfadimidina)
NOTA Esta debe usarse solo si se sospecha que especies de Proteus están en la muestra de ensayo.
4
5.3.2.3.1 Composición
Sulfamezatina 0,2 g
Solución de hidróxido de sodio c(NaOH) = 0,1 mol/l 10 ml
5.3.2.3.2 Preparación
- Se disuelve la sulfametazina en la solución de hidróxido de sodio.
- Se completa hasta 100 ml con agua.
- Se esteriliza por filtración usando membranas con un tamaño de poro de 0,22 μm.
- La solución puede ser almacenada como máximo por un mes a 3 °C ± 2 °C.
5.3.3 Medio completo
5.3.3.1 Composición
Medio base (véase el numeral 5.3.1) 100 ml

Solución de telurito de potasio (véase el numeral 5.3.2.1) 1,0 ml
Emulsión de yema de huevo (véase el numeral 5.3.2.2) 5,0 ml
Solución de sulfametazina (véase el numeral 5.3.2.3) (si es necesario) 2,5 ml
5.3.3.2 Preparación
- Se funde el medio, luego, se enfría a 45 °C ± 1 °C mediante el baño de maría (Véase el

numeral 6.4).
- Se adiciona, bajo condiciones asépticas, las otras dos soluciones (Véanse los numerales
5.3.2.1 y 5.3.2.2) y si es necesario (si se sospecha que especies de Proteus están en la
muestra de ensayo) la solución de sulfametazina (Véase numeral 5.3.2.3), siendo
previamente calentadas en el baño de maría a 45 °C ± 1 °C, se mezcla bien después de
cada adición.
5.3.4 Preparación de las cajas
Se coloca la cantidad apropiada de medio completo (véase el numeral 5.3.3) en cajas de Petri estériles
para obtener un agar de 4 mm de espesor aproximadamente, y se permite la solidificación.
Las cajas pueden ser almacenadas, de 24 h hasta 72 h a 3 °C ± 2 °C.
NOTA Las instrucciones del fabricante sobre el período de almacenamiento deben seguirse para cajas
preparadas industrialmente.
Antes del uso para eliminar la condensación, se deben dejar las cajas, con las tapas sueltas en
un área aséptica.
5
5.4 CALDO INFUSIÓN CEREBRO-CORAZÓN
5.4.1 Composición
Tejidos animales por digestión enzimática 10,0 g

Infusión deshidratada de cerebro de ternero 12,5 g
Infusión deshidratada de corazón de vaca 5,0 g
Glucosa 2,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Fosfato de sodio dibásico, anhidro (Na2HPO4) 2,5 g
Agua destilada o desionizada 1 000 ml
5.4.2 Preparación
- Se disuelven los componentes de la base completa deshidratada en agua por

ebullición.
- Si es necesario, se ajusta el pH de tal forma que después de la esterilización sea de 7,4

± 0,2 a 25 °C
- Se transfiere el medio en cantidades de 5 ml a tubos de ensayo o frascos (Véase el

numeral 6.5) de capacidad apropiada.
- Se esteriliza el medio por 15 min a 121 °C.
6. EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO
NOTA Los equipos desechables son una alternativa aceptable al material reutilizable si tienen especificaciones
apropiadas.
Equipo microbiológico usual de laboratorio y en particular lo siguiente:
6.1 Equipos para esterilización en seco (horno) y para esterilización húmeda (autoclave)
Véase la NTC 4092.
6.2 Incubadora, para mantener el medio inoculado, cajas y tubos de ensayo a un rango de
temperatura de 35 °C ± 2 °C.
6.3 Baño de maría, o equipo similar, capaz de mantener la temperatura de 46 °C ± 1 °C y

48 °C ± 1 °C.
6.4 Tubos de ensayo, erlenmeyers o frascos con tapa rosca, de capacidad apropiada, para
la esterilización y almacenamiento de medios de cultivo e incubación de medios líquidos; en
particular tubos estériles de hemólisis, o tubos de fondo redondo de aproximadamente 10 mm
x 75 mm.
6.5 Cajas de Petri, estériles, de vidrio o plástico.
6.6 Asa bacteriológica (Véase la NTC 4092) y pipeta Pasteur.
6.7 Pipetas graduadas de vaciado total, de capacidades nominales de 1 ml, 2 ml y 10 ml,

graduadas en divisiones de 0,01 ml, 0,1ml y 0,5 ml, respectivamente o micropipetas.
6
6.8 Varillas de vidrio o plástico (Diglastic)1 rastrillos o varillas de Jockey, estériles.
6.9 pH-metro, con capacidad de lectura de 0,01 unidades de pH, permitiendo mediciones
con una precisión de ± 0,1 unidades de pH.
7. MUESTREO
Es importante que el laboratorio reciba una muestra representativa y adecuada para su

correspondiente análisis y que no haya sufrido daños o cambios durante el transporte o el
almacenamiento.
El muestreo no hace parte del método especificado en esta norma. Debe verse la norma
específica para el producto en cuestión. Si no hay norma específica, se recomienda que las
partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.
8. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO
Se prepara la muestra de acuerdo con la norma especifica apropiada para el producto en

cuestión.
Si no existe una norma especifica, se recomienda que las partes involucradas lleguen a un
acuerdo.
9. PROCEDIMIENTO
9.1 PORCIÓN DE ENSAYO, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES
Véase la NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3, NTC 4491-4 y la norma especifica para el
producto en cuestión.
9.2 INOCULACIÓN E INCUBACIÓN CUANDO SE EMPLEA MEDIO BAIRD PARKER (VÉASE

EL NUMERAL 5.3.3)
9.2.1 Se transfiere por medio de una pipeta estéril (véase el numeral 6.8), 0,1 ml de la
muestra de ensayo si es liquida, o 0,1 ml de la suspensión (dilución 10-1) en el caso de otros
productos a cada una de las dos cajas (véase el numeral 6.6). Se repite el procedimiento para
la dilución 10-2 y para las demás diluciones decimales si es necesario.
9.2.2 Si, para ciertos productos, se espera contar bajo número de estafilococos coagulasa-
positiva, el límite de detección se puede incrementar por un factor de 10 inoculando 1,0 ml de
la muestra de ensayo si es liquida, o 1,0 ml de la suspensión para otros productos, tanto en la
superficie de cajas de agar grandes (140 mm) o en la superficie de tres cajas de agar
pequeñas (90 mm). En ambos casos, se preparan duplicados usando 2 cajas grandes o seis
pequeñas.
9.2.3 Cuidadosamente se esparce el inóculo tan rápido como sea posible sobre la superficie del
agar, tratando de no tocar los lados de la caja, usando la varilla (véase el numeral 6.9). Se permite
que las cajas se sequen con sus tapas por 1 min aproximadamente a la temperatura del laboratorio.
1
Diglastic es un ejemplo de un producto disponible comercialmente. Esta información se da para
conveniencia de los usuarios de esta norma, y no constituye un respaldo de ICONTEC a este producto.
7
9.2.4 Se invierten las cajas preparadas de acuerdo con el numeral 9.2.3 y se incuban por 24 h a
48 h ± 2 h (véase el numeral 6.2) a 35 °C ± 2 °C.
9.3 SELECCIÓN DE LAS CAJAS E INTERPRETACIÓN
9.3.1 Cuando se emplea Medio Baird Parker Véase el numeral 5.3.3
9.3.1.1 Después de la incubación por 24 h ± 2 h, se marca en la caja las posiciones de

cualquier colonia típica presente (véase la Nota 2).
Se reincuban todas las cajas a 35 °C ± 2 °C por 24 h ± 2 h adicionales, y se marca cualquier

nueva colonia típica. También se marca cualquier colonia atípica presente (véase la Nota 2 del
numeral 9.4.1.1).
Si se inoculó 1,0 ml sobre tres cajas (véase el numeral 9.2.2), considerarlas como una sola en
todos los recuentos subsecuentes y procedimientos de confirmación.
Para el recuento se toman solo aquellas cajas (véase la Nota 2 del numeral 9.4.1.1) que contengan
entre 20 y 200 colonias típicas, atípicas, o ambas, en dos diluciones sucesivas. Para confirmación
(véase el numeral 9.5), se selecciona un número dado A (véase el numeral 10.1.1) (en general de 3
colonias a 5 colonias típicas, sí solo hay colonias típicas, o de 3 a 5 colonias atípicas, si solo hay
colonias atípicas, o de 3 y 5 colonias típicas y de 3 a 5 colonias atípicas sí están presentes ambas,
de cada caja).
Si hay menos de 20 colonias típicas, atípicas, o ambas, presentes en las cajas inoculadas con
el producto líquido no diluido o con la dilución menor de otros productos, es posible hacer un
recuento estimado como el descrito en los numerales 9.4.1.3 y 10.2.
NOTA 1 Las colonias típicas son negras o grises, brillantes y convexas (de 1 mm a 1,5 mm de diámetro después
de 24 h de incubación y 1,5 mm a 2,5 mm de diámetro después de 48 h de incubación) y rodeadas por una zona
clara (halo) que puede ser parcialmente opaca. Después de por lo menos 24 h de incubación puede aparecer en
esta zona clara, un halo opalescente, inmediatamente en contacto con las colonias.
NOTA 2 Si para el análisis es el recuento de Staphylococcus coagulasa positiva es necesario tener en cuenta las
colonias típicas.
Las colonias atípicas pueden presentar una de las siguientes morfologías:
a) colonias negras brillantes con o sin un estrecho borde blanco; la zona clara está ausente o ligeramente
visible y el halo opalescente está ausente o es apenas visible;
b) colonias grises sin zonas claras.
Las colonias atípicas están formadas principalmente por cepas de estafilococos coagulasa-
positiva contaminantes, por ejemplo productos lácteos, camarones y vísceras de ave. Están
formadas menos frecuentemente por cepas de estafilococos coagulasa-positiva contaminantes
de otros productos.
NOTA 3 Otras colonias son el resto de colonias que pueden estar presentes en la placa y que no muestran la
apariencia típica, consideradas como la flora de fondo. Las bacterias pertenecientes a otros géneros diferentes al
estafilococo pueden dar colonias con una apariencia similar a los estafilococos. El examen microscópico con tinción
de Gram, antes de la confirmación, facilitará la diferenciación de otros géneros.
9.3.1.3 Para hacer un recuento estimado de número bajos de estafilococos coagulasa-positiva,

se retienen todas las cajas que contengan colonias típicas y atípicas. Se seleccionan todas
aquellas colonias para confirmación con los requisitos siguientes.
8
9.4 CONFIRMACIÓN (PRUEBA DE LA COAGULASA)
De la superficie de cada colonia seleccionada (Véase el numeral 9.4.1), se remueve un inóculo

con un asa estéril (Véase el numeral 6.6) y se transfiere a un tubo o frasco con caldo infusión
cerebro-corazón (Véase el numeral 5.4).
Se incuba a 35 °C ± 2 °C por 24 h ± 2 h.
Se adiciona asépticamente 0,1 ml de cada cultivo a 0,3 ml del plasma de conejo (véase el
numeral 5.5) (a menos que se especifiquen otras cantidades por el fabricante) en tubos de
hemólisis o frascos estériles (especificados en el numeral 6.5), y se incuba a 35 °C± 2 °C, se
inclina el tubo, se examina el coágulo del plasma después de 4 h a 6 h de incubación y, la
prueba es negativa, se re-examinan a las 24 h de incubación, o se examina a los tiempos de
incubación especificados por el fabricante.
Se considerará la prueba de coagulasa positiva si el volumen de coágulo ocupa desde un

cuarto del volumen original del líquido.
Como control negativo, para cada lote de plasma, se adicionan 0,1 ml de caldo infusión
cerebro-corazón (véase el numeral 5.4) a la cantidad recomendada de plasma de conejo
(véase el numeral 5.5) y se incuba sin inoculación. Para validar la prueba, el plasma de control
no debe mostrar ningún signo de coagulación.
10. EXPRESIÓN DE RESULTADOS
10.1 CASO GENERAL
10.1.1 Cálculo del número a de estafilococos coagulasa-positiva identificados para cada caja
seleccionada
Se calcula para cada una de las cajas, el número a de estafilococos coagulasa-positiva, de

acuerdo con la ecuación:
bc b
a= x c c + nc x c nc
Ac Anc
en donde
Ac = es el número de colonias típicas sometidas a la prueba de la coagulasa (Véase el

numeral 9.5);
Anc = es el número de colonias atípicas sometidas a la prueba de la coagulasa (véase el

numeral 9.5);
bc = es el número de colonias típicas positivas para la prueba de la coagulasa;
bnc = es el número de colonias atípicas positivas para la prueba de la coagulasa;
cc = es el número total de colonias típicas vistas en la caja (Véase el numeral 9.4.1);
cnc = es el número total de colonias atípicas vistas en la caja (Véase el numeral 9.4.1).
Se redondea el resultado con dos cifras significativas (véase la NTC 4092).
10.1.2 Cálculo del número N de estafilococos coagulasa-positiva presentes en la porción de

muestra.
9
Para aquellas cajas que contienen como máximo 200 colonias, con 100 colonias típicas y/o
atípicas en dos diluciones sucesivas, se calcula el número de estafilococos coagulasa-positiva
para cada caja como se especifica en el numeral 10.1.1 se calcula, como un promedio
ponderado de dos diluciones sucesivas, el número N de estafilococos coagulasa-positiva
presentes en la porción de muestra, usando la siguiente ecuación:
Σa
N =
V ( n1 + 0,1n 2 ) d
en donde
∑a = es la suma de colonias de estafilococos coagulasa-positiva en todas las cajas

seleccionadas;
V = es el volumen del inóculo de cada caja, en mililitros;
n1 = es el número de cajas seleccionadas de la primera dilución;
n2 = es el número de cajas seleccionadas de la segundo dilución;
d = es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución seleccionada (la suspensión

inicial es una dilución).
Se redondea el resultado con dos cifras significativas (véase la NTC 4092).
Se reporta el resultado como el número de estafilococos coagulasa-positiva por mililitro (productos

líquidos) o por gramo (otros productos), expresado como un número entre 1,0 y 9,9 inclusive
multiplicado por 10x donde x es la apropiada potencia de 10.
10.1.3 Ejemplo
El recuento para un producto después de incubación con 0,1 ml de producto dio los siguientes
resultados:
- para la primera dilución (10-2): 65 colonias típicas y 85 colonias atípicas;
- para la segunda dilución (10-3): 3 colonias típicas y 7 colonias atípicas;
Se obtuvieron los siguientes números:
- de 65 colonias, 5 colonias fueron seleccionadas y todas las 5 fueron coagulasa-

positiva, dando a = 65;
- de 85 colonias, 5 colonias fueron seleccionadas, 3 de las cuales fueron coagulasa-

positiva, dando a = 51;
- de 3 colonias, todas las 3 fueron coagulasa-positiva, dando a = 3;
- de 7 colonias, 5 colonias fueron seleccionadas, y todas las 5 fueron coagulasa-positiva,

dando a = 7.
65 + 51 + 3 + 7
N= = 57 272
0,22 x 10 − 2
El resultado, después de redondearlo, es 5,7 x 104.
10
10.2 ESTIMACIÓN DE NÚMEROS BAJOS
10.2.1 Si dos de las cajas, correspondientes a la muestra de ensayo (productos líquidos) o la

suspensión inicial (otros productos) contienen menos de 20 colonias identificadas, se reportan
los resultados como sigue.
a) Para productos líquidos, se estima el número Ne de estafilococos coagulasa-positiva por

mililitro:
Σa
Ne =
Vx 2
en donde
∑a = es la suma de colonias identificadas de estafilococos coagulasa-positiva (Véase el

numeral 10.1.1) en las dos cajas seleccionadas;
V = es el volumen esparcido en cada caja.
b) Para otros productos, se estima el número Ne de estafilococos coagulasa-positiva por

gramo:
Σa
Ne =
Vx 2 xd
en donde
∑a = es la suma de colonias identificadas de estafilococos coagulasa-positiva (Véase el

numeral 10.1.1) en las dos cajas seleccionadas;
d = es el factor de dilución de la suspensión inicial;
V = es el volumen esparcido en cada caja.
10.2.2 Si dos de las cajas, correspondientes a la muestra de ensayo (productos líquidos) o la

suspensión inicial (otros productos) no contienen ninguna colonia de estafilococos coagulasa-
positiva y si el inóculo ha sido hecho con 0,1 ml de muestra, reportar los resultados como sigue
(caso general de un inóculo de 0,1 ml):
- menor de 10 estafilococos coagulasa-positiva por mililitro (productos líquidos);
- menor de 10/d estafilococos coagulasa-positiva por gramo (otros productos), donde d

es el factor de dilución de la suspensión inicial.
Si el inóculo ha sido hecho con 1 ml de muestra, se reportan los resultados como sigue:
- menor de 1 estafilococos coagulasa-positiva por mililitro (productos líquidos);
- menor de 1/d estafilococos coagulasa-positiva por gramo (otros productos).
11
11. PRECISIÓN
11.1 GENERALIDADES
La precisión de los métodos cuantitativos puede expresarse en términos de repetibilidad y

reproducibilidad, según se define en la norma ISO 5725-2. Sin embargo, el método de cálculo
utilizado en la norma ISO 5725-2, basado en la media, no siempre resulta apropiado para los
análisis microbiológicos, que no siempre muestran una distribución normal (Gaussiana). Por
consiguiente, se ha seguido la norma ISO 16140, que se ha desarrollado especialmente para los
métodos microbiológicos y que utiliza estimadores robustos para calcular la repetibilidad y la
reproducibilidad. Estas estadísticas presentan la ventaja de ser menos sensibles a los valores
extremos, permitiendo por lo tanto conservar los datos discrepantes de los análisis estadísticos.
Por tanto estos estimadores se utilizan en esta parte de la NTC 4779 (ISO 6888).
Los detalles de un análisis interlaboratorio respecto a la precisión del método se resumen en el

Anexo A. Los valores obtenidos a partir de este análisis interlaboratorio pueden no resultar
aplicables a rangos de concentraciones y matrices diferentes de las indicadas. Los datos de
precisión se determinaron utilizando tres tipos de alimentos, contaminados a distintos niveles y
para materiales de referencia. Factores tales como la cepa considerada, la flora competitiva y el
estado fisiológico de los microorganismos blanco (Target) y de los competidores influyen sobre
los valores de precisión.
11.2 REPETIBILIDAD
11.2.1 Límite de repetibilidad
La diferencia absoluta entre los resultados (transformados a log10) de dos análisis individuales
(número de estafilococos coagulasa-positiva por gramo o por mililitro), o la proporción entre el
mayor y el menor de los dos resultados del análisis en escala normal, obtenidos utilizando el
mismo método sobre idéntico material de análisis por el mismo analista, utilizando los mismos
aparatos dentro del intervalo de tiempo lo más corto posible, no sobrepasará el límite de
repetibilidad (r) en más del 5 % de los casos.
11.2.2 Valores globales
Como indicación general del límite de repetibilidad (r), pueden utilizarse los siguientes valores
cuando se analicen muestras alimenticias en general. Estos valores de r son medias generales
para todas las matrices consideradas:
r = 0,28 (expresado como diferencia absoluta entre resultados de análisis

transformados a log10), o
r = 1,9 (expresado como relación entre el mayor y el menor de los dos resultados del
análisis, en escala normal).
Para materiales de referencia (cápsulas que contienen aproximadamente 5 000 UFC, véase el
Anexo A), pueden utilizarse los siguientes valores:
r = 0,19 (expresado como diferencia absoluta entre resultados de análisis

transformados a log10), o
r = 1,55 (expresado como relación entre el mayor y el menor de los dos resultados
del análisis, en escala normal).
12
EJEMPLO Se obtuvo un primer resultado de un análisis de 10 000 o 1,0 x 104 estafilococos coagulasa-positiva
por gramo de alimento. Bajo condiciones de repetibilidad, la relación entre el resultado del análisis más alto y el
más bajo no debería ser mayor de 1,9. Por consiguiente, el resultado del segundo análisis debería estar entre
5 263 (= 10 000/1,9) y 19 000 (10 000 x 1,9) estafilococos coagulasa-positiva por gramo.
11.3 REPRODUCIBILIDAD
11.3.1 LÍMITE DE REPRODUCIBILIDAD
La diferencia absoluta entre los resultados (transformados a log10) de dos análisis individuales
(número de estafilococos coagulasa-positiva por gramo o por mililitro), o la proporción entre el
mayor y el menor de los dos resultados del análisis en escala normal, obtenidos utilizando el
mismo método sobre idéntico material de análisis en laboratorios diferentes o por analistas
diferentes del mismo laboratorio (Véase en Bibliografía la referencia [4]), por analistas distintos
que utilizan aparatos distintos, no sobrepasará el límite de reproducibilidad (R) en más del 5 %
de los casos.
11.3.2 Valores globales
Como indicación general del límite de reproducibilidad (R), pueden utilizarse los siguientes
valores cuando se analicen muestras alimenticias en general. Estos valores de R son medias
generales para todas las matrices consideradas:
R = 0,43 (expresado como diferencia entre resultados de análisis transformados a

log10), o
R = 2,7 (expresado como relación entre el mayor y el menor de los dos resultados del
Para materiales de referencia (cápsulas que contienen aproximadamente 5 000 UFC, véase el
Anexo A), pueden utilizarse los siguientes valores:
R = 0,39 (expresado como diferencia entre resultados de análisis transformados a

log10), o
R = 2,4 (expresado como relación entre el mayor y el menor de los dos resultados del
EJEMPLO 1 En un primer laboratorio se obtuvo un resultado del análisis de 1,0 x 104 estafilococos coagulasa-
positiva por gramo de producto alimenticio. Bajo condiciones de reproducibilidad, la relación entre los resultados de
los análisis entre el primer y el segundo laboratorio no debería ser superior a 2,7. Por consiguiente, el resultado del
3 4 4 4
segundo laboratorio debería estar entre 3,7 x 10 =(1,0 x 10 /2,7) y 2,7 x 10 = (1,0 X 10 x 2,7) estafilococos
coagulasa-positiva por gramo.
EJEMPLO 2 Un laboratorio quiere saber cuál es el nivel máximo que puede encontrar que aún esté en conformidad
con un límite preestablecido (por ejemplo un límite de 105 o de 5 unidades log10). Para esto, el valor de R (en escala
logarítmica) tiene que multiplicarse por un factor de 0,59. Este valor es de 0,25 (0,43 x 0,59) cuando se considere la
diferencia entre resultados de análisis transformados a log10 o de 100,25 cuando se considere la relación entre
resultados de análisis. Por consiguiente, resultados de hasta log10 5,25 (Iog10 5 + log10 0,25) o de 1,8 x 105 no indican
falta de conformidad con dicho límite. El factor de 0,59 refleja el hecho de que se utiliza un análisis con un intervalo de
confianza monodireccional del 95 % para verificar si se supera el límite. El factor 0,59 se obtiene a partir de la
siguiente fórmula:
1,65
0,59 =
1,96 x 2
Se añade el siguiente Anexo A tras la finalización del numeral12.
13
12. INFORME DE ENSAYO
El informe de ensayo debe especificar:
- toda la información necesaria para la completa identificación de la muestra;
- el método de muestreo utilizado, si se conoce;
- el método de ensayo utilizado, con referencia a esta parte de la norma;
- todos los detalles operativos no especificados en esta parte de la norma, o considerado

como opcional, cualquier incidente detallado que pueda haber influenciado los
resultados del ensayo;
- el resultado obtenido.
14
ANEXO A
(Informativo)
RESULTADOS DE UN ESTUDIO INTERLABORATORIOS
Se organizó un estudio interIaboratorio internacional en 1999 a cargo del Laboratorio para el

Laboratory for Study and Research on Hygiene and Quality of Food (LERHQA) de la French
Food Salety Agency (AFSSA), en el marco del proyecto Europeo SMT CT 96 2098 (véase la
referencia [8] de la Bibliografía). En este estudio participaron 24 laboratorios de 16 países de
Europa y se realizó sobre queso, carne, huevo en polvo y un material de referencia. Cada una
de las muestras alimenticias se analizó en tres niveles de contaminación con Staphylococcus
coagulasa-POSITIVAs, más un control negativo.
Los datos de precisión obtenidos a partir de este estudio interIaboratorio se muestran para cada
tipo de muestra en las Tablas A.1 a A.4. Se han calculado utilizando estadísticas robustas, según
se describe en la norma ISO 16140. Se han excluido de los cálculos los datos procedentes de
algunos laboratorios cuando se sabía que se apartaban del protocolo de estudio descrito.
Tabla A.1. Resultados del análisis de datos obtenidos con muestras de queso
Queso Queso Queso

Muestra/Nivel de contaminación
nivel bajo nivel medio nivel alto
Número de laboratorios que proporcionaron resultados 22 22 22
Número de muestras por laboratorio 2 2 2
Número de laboratorios participantes tras eliminar a los discrepantes 19 19 19
Número de muestras aceptadas 38 38 38
Valor medio (en log10 UFC/g) 3,33 5,12 6,06
Desviación estándar de la repetibilidad, sr (en log10) UFC/g) 0,18 0,06 0,12
Desviación estándar relativa de la repetibilidad (%) 5,36 1,16 1,96
Límite de repetibilidad (r), en forma de diferencia en escala de log10 0,50 0,17 0,33
(en log10 UFC/g)
Desviación estándar de la reproducibilidad, sR (en log10 UFC/g) 0,19 0,16 0,24
Desviación estándar relativa de la reproducibilidad (%) 5,61 3,24 3,91

Límite de reproducibilidad (R), en forma de diferencia en escala de 0,52 0,47 0,66
log10 (en log10 UFC/g)
15
Tabla A.2. Resultados del análisis de datos obtenidos con muestras de carne
Carne Carne Carne


Valor medio (en log10 UFC/g) 3,27 4,20 6,19
Desviación estándar de la repetibilidad, Sr (en log10 UFC/g) 0,12 0,07 0,10

Limite de repetibilidad (r), en forma de diferencia en escala de log10
0,33 0,19 0,29
(en log10 UFC/g)
Desviación estándar de la reproducibilidad, SR (en log10 UFC/g) 0,17 0,]7 0,]4

Limite de reproducibilidad (R), en forma de diferencia en escala de
0,48 0,47 0,39
Tabla A.3. Resultados del análisis de datos obtenidos con muestras de huevo en polvo
Huevo en Huevo en Huevo en

polvo polvo polvo

Valor medio (en log10 UFC/g) 3,] 7 4,10 5,23
Desviación estándar de la repetibilidad, Sr (en log10 UFC/g) 0,09 0,09 0,07

Limite de repetibilidad (r), en forma de diferencia en escala de log10
0,25 0,25 0,2
(en log10 UFC/g)
Desviación estándar de la reproducibilidad, SR (en log10 UFC/g) 0,11 0,10 0,11

Límite de reproducibilidad (R), en forma de diferencia en escala de
0,32 0,29 0,30
16
Tabla A.4. Resultados del análisis de datos obtenidos con materiales de referencia
Material de referencia a
(cápsulas que contienen unas 5 000 UFC
Número de laboratorios que proporcionaron resultados 23
Número de muestras por laboratorio 2
Número de laboratorios participantes tras eliminar a los discrepantes 20
Número de muestras aceptadas 40
Valor medio (en log10 UFC/g) 3,79
Desviación estándar de la repetibilidad, Sr (en log10 UFC/g) 0,07
Desviación estándar relativa de la repetibilidad (%) 1,76

Límite de repetibilidad (r), en forma de diferencia en escala de log10
0,19
(en log10 UFC/g)
Desviación estándar de la reproducibilidad, SR (en log10 UFC/g) 0,14
Desviación estándar relativa de la reproducibilidad (%) 3,68
Límite de reproducibilidad (R), en forma de diferencia en escala de

0,39
a El material de referencia fue preparado por RIVM, Holanda.
17
ANEXO B
(Informativo)
MEDIO DE CULTIVO ALTERNO
B.1 PLASMA DE CONEJO
Se usa plasma de conejo deshidratado comercialmente disponible y se rehidrata de acuerdo

con las instrucciones del fabricante.
Si no se dispone de plasma de conejo deshidratado, se diluye un volumen de plasma de

conejo estéril fresco con tres volúmenes de agua estéril.
Se adiciona la solución de EDTA (ácido etilén-diamina-tetra-acético) para dar 0,1 % de EDTA

en el plasma rehidratado o diluido, si se ha usado citrato de potasio o citrato de sodio como
anticoagulante3).
A menos que lo indique el fabricante, el plasma rehidratado o diluido debe ser usado
inmediatamente.
Antes de su uso, se ensaya cada lote de plasma con cepas de estafilococos coagulasa-
positiva y cepas de estafilococos coagulasa-negativa.
B.2 MEDIO PLASMA DE CONEJO FIBRINÓGENO (VER REFERENCIAS [6] Y [7])
NOTA Se puede usar medio de cultivo comercialmente disponible. Sin embargo, considerando la conocida
variabilidad de los lotes de suplemento fabricados, se recomienda que cada lote de solución de fibrinógeno
bovino/plasma de conejo se pruebe antes de su uso, frente a controles positiva y negativos.
B.2.1 Medio base
Preparar el medio base como se menciona en el numeral 5.3.1, con la excepción de que la
distribución del medio base se hace en cantidades de 90 ml por erlenmeyer o frasco.
B.2.2 Soluciones
B.2.2.1 Solución de telurito de potasio
Preparar la solución de telurito de potasio como se indica en el numeral 5.3.2.1.
B.2.2.2 Solución de fibrinógeno bovino
B.2.2.2.1 Composición
Fibrinógeno bovino 5 g a 7 g1)

1)
Dependiendo de la pureza del fibrinógeno bovino.
B.2.2.2.2 Preparación
Bajo condiciones asépticas, se disuelve el fibrinógeno bovino en el agua justo antes de su uso.
3)
El plasma oxalatado o heparinizado no requiere EDTA (Véase referencia [4]).
18
B.2.2.3 Solución de plasma de conejo e inhibidor de tripsina
B.2.2.3.1 Composición
Plasma de conejo con EDTA para coagulasa 30 ml

Inhibidor de tripsina 30 mg
B.2.2.3.2 Preparación
Operando bajo condiciones asépticas, disolver los componentes en el agua justo antes de su uso.
B.2.3 Medio completo
B.2.3.1 Composición
Medio base (véase el numeral 5.6.1) 90 ml

Solución de telurito de potasio (véase el numeral 5.6.2.1) 0,25 ml
Solución de fibrinógeno bovino (véase el 5.6.2.2) 7,5 ml
Solución de plasma de conejo e inhibidor de tripsina (véase 2,5 ml
el numeral 5.6.2.3)
B.2.3.2 Preparación
Fundir el medio, luego enfriarlo a 48 °C ± 1 °C en un baño de maría (véase el numeral 6.4).
Se adiciona, bajo condiciones asépticas, las tres soluciones previamente calentadas en un

baño de maría a 48 °C ± 1 °C. Se mezcla bien después de cada adición mediante rotación
para minimizar la formación de espuma.
Se usa el medio completo inmediatamente después de su preparación, con el fin de evitar

cualquier precipitación del plasma.
ADVERTENCIA Si se consigue comercialmente solución de plasma de fibrinógeno bovino / plasma de conejo, se

deben seguir con mucho cuidado las indicaciones del fabricante para la preparación de esta solución y del medio
completo (en particular la temperatura del medio base) de lo contrario, el medio puede perder completamente su
actividad.
B.3 PREPARACIÓN DE LAS CAJAS
Véase el numeral 5.3.4.
B.4 INOCULACIÓN E INCUBACIÓN CUANDO SE EMPLEA MEDIO PLASMA DE

CONEJO FIBRINÓGENO VÉASE NUMERAL B.2
B.4.1 Se transfiere por medio de una pipeta estéril (véase el numeral 6.8), 1 ml de la muestra
de ensayo si es liquida, o 1 ml de la suspensión en el caso de otros productos, a cada una de
las dos cajas (véase el numeral 6.6). Se toman otras dos cajas de Petri estériles y se transfiere
1 ml de la primera dilución decimal a cada una de las cajas.
Se repiten estas operaciones con diluciones decimales sucesivas usando una pipeta estéril
para cada dilución decimal.
NOTA 1 Si el medio ha sido previamente servido en cajas, se siembra 0,1 ml de la muestra de ensayo si es
liquida, o 1 ml de la suspensión en el caso de otros productos, a cada una de las dos cajas.
19
B.4.2 En cada caja de Petri (véase el numeral 9.3.1), se vierte inmediatamente medio
completo recién preparado (véase el numeral 5.6.3) (no guardar en forma líquida) hasta una
profundidad de 3 mm aproximadamente.
Se mezcla cuidadosamente el inóculo con el medio de cultivo y se deja solidificar colocando

las cajas de Petri en una superficie horizontal fría.
B.4.3 Después de una completa solidificación, se invierten las cajas preparadas colocándolas
en la incubadora (véase el numeral 6.2) a 35 °C± 2 °C por 18 h a 24 h. Si es necesario, se
reincuba por 18 h a 24 h.
B.5 SELECCIÓN DE LAS CAJAS E INTERPRETACIÓN CUANDO SE EMPLEA MEDIO

PLASMA DE CONEJO FIBRINÓGENO VÉASE EL NUMERAL 5.6
Después de un periodo de incubación suficiente (véase el numeral 9.3.3), los estafilococos

forman pequeñas colonias negras o grises o aún blancas rodeadas de un halo de
precipitación, indicando la coagulación. Las colonias de Proteus pueden mostrar, al inicio de la
incubación, una apariencia similar a las colonias de estafilococos coagulasa-positiva. Sin
embargo, después de 24 h a 48 h de incubación, pueden tener una apariencia de un cultivo
extendido, más o menos pardo, que las permiten diferenciar de los estafilococos.
Se cuentan las colonias típicas de cada placa.
Debido a que el agar plasma de conejo fibrinógeno está basado en una reacción de coagulasa,
no es necesario confirmar esta actividad.
20
ANEXO C
(Informativo)
CUADRO COMPARATIVO RESPECTO DE LAS MODIFICACIONES REALIZADAS

A LA NTC 4779 (Primera actualización) Y LA NTC 4491:2000
NTC 4491
NTC 4779 Sustentación
(Primera actualización)
0. INTRODUCCIÓN 0. INTRODUCCIÓN Se modifica la introducción para
0.2 0.2 explicar que en la nueva versión se
En general, se usa la técnica con En general, se usa empleando la incluye un anexo B (informativo) con
agar Baird Parker. En casos de técnica con agar Baird Parker. Sin la técnica de agar fibrinógeno de
encontrar colonias atípicas de embargo, es preferible usar el plasma de conejo que es utilizada
estafilococo o flora acompañante procedimiento descrito cuando en para el diagnóstico de S. Aureus en
en el agar Baird Parker, la técnica se usa agar plasma de productos tales como lácteos o
procedentes de ciertas muestras conejo fibrinógeno solo para los carnes crudas.
(como quesos hechos de la leche alimentos (tales como quesos
cruda o ciertos productos a base obtenidos de la leche cruda y
de carne cruda, se recomienda ciertos productos cárnicos crudos)
utilizar alternativamente la técnica que probablemente estén
de agar fibrinógeno de plasma de contaminados por:
conejo [véase el Anexo B - colonias atípicas de
Informativo]). estafilococos en agar Baird-Parker;
- flora acompañante que pueda
ocultar las colonias observadas.
2. REFERENCIAS 2. REFERENCIAS Se incluyeron las referencias

NORMATIVAS NORMATIVAS normativas para la preparación de las
muestras para ensayo, suspensiones
NTC 4491-1, Microbiología de NTC 4491:1998, Microbiología de iniciales y diluciones decimales que
alimentos y de alimentos para alimentos y de alimentos para reemplazaron la NTC 4491, que han
animales. Preparación de muestras animales. Preparación de muestras sido adoptadas por el comité técnico.
para ensayo, suspensiones iniciales para ensayo, suspensiones iniciales y
y diluciones decimales para los diluciones decimales para los análisis
análisis microbiológicos. Parte 1: microbiológicos. Parte 1: Reglas
Reglas generales para la preparación generales para la preparación de la
de la suspensión inicial y de suspensión inicial y de diluciones
diluciones decimales. (ISO 6887-1). decimales. (ISO/DIS 6887).
NTC 4491-2, Microbiología de NTC 4092:1998, Microbiología de

alimentos y de alimentos para alimentos y de alimentos para
animales. Preparación de muestras animales. Requisitos generales para
para ensayo, suspensiones iniciales el examen microbiológico. (ISO 7218)
y diluciones decimales para los
análisis microbiológicos. Parte 2:
Reglas específicas para la
preparación de carne y productos
cárnicos. (ISO 6887-2).
NTC 4491-3, Microbiología de

alimentos y de alimentos para
animales. Preparación de muestras
para ensayo, suspensiones iniciales y
diluciones decimales para los análisis
microbiológicos. Parte 3: Reglas
específicas para preparación de
muestras de pescado y productos de
la pesca. (ISO 6887-3).
Continúa...
21
(Continuación)
NTC 4491
NTC 4491-4, Microbiología de

alimentos y de alimentos para
animales. Preparación de muestras
para ensayo, suspensiones iniciales y
diluciones decimales para los análisis
microbiológicos. Parte 4: Reglas
específicas para la preparación de
productos deferentes de leche,
productos lácteos, carne, productos
cárnicos, pescado y productos de la
pesca. (ISO 6887-4).
NTC 4092, Microbiología de alimentos

y de alimentos para animales.
Requisitos generales para el examen
microbiológico. (ISO 7218).
3.1 Estafilococos coagulasa- 3.1 ESTAFILOCOCOS Se modifica la definición de acuerdo

positiva. Bacteria esférica COAGULASA -POSITIVA con el Manual Bergey´s, para la
aeróbica, gram (+), que aparece Cocos en forma de racimos, gram clasificación y descripción
aislada, formando parejas, (+), catalasa (+) en la superficie de morfológica de microorganismos,
tétradas o agrupadas en un medio de cultivo selectivo, con versión 2005.
racimos, inmóviles, capaces de una reacción positiva de la
coagular el plasma, convirtiendo coagulasa cuando el ensayo es
el fibrinógeno en fibrina realizado siguiendo el método
siguiendo el método especificado especificado en esta norma.
en esta norma.
4.3 Se calcula del número 4.3 Se calcula del número de Se incluye la nota aclaratoria
de estafilococos coagulasa- estafilococos coagulasa-positiva respecto al uso de métodos alternos
positiva por mililitro, o por gramo, por mililitro, o por gramo, de utilizados actualmente para la
de muestra a partir del número muestra a partir del número de determinación de S. aureus.
de colonias típicas y/o atípicas colonias típicas y/o atípicas
obtenidas en cajas de los niveles obtenidas en cajas de los niveles
de dilución escogidos de tal de dilución escogidos de tal forma
forma que de un resultado que de un resultado significativo, y
significativo, y confirmado con el confirmado con el resultado positiva
resultado positiva de la prueba de la prueba de la coagulasa.
de la coagulasa.
NOTA La determinación de S.
aureus puede realizarse también
por los siguientes métodos:
siembra en membranas
hidrofóbicas, PCR u otros método
búsqueda.
5.3.2.2 Emulsión de yema de 5.3.2.2 Emulsión de yema de huevo

huevo (concentración (concentración aproximada del 20
aproximada del 20 % o de % o de acuerdo con las
acuerdo con las instrucciones del instrucciones del fabricante)
fabricante)
... Se retira asépticamente el Se retira asépticamente el

sobrenadante. La solución debe sobrenadante. La solución debe ser
ser en lo posible utilizada en su almacenada + 3 °C ± 2 °C máximo
totalidad. por 72 h.
22
(Final)
NTC 4491
Se modifica la preparación del medio
Se adiciona, bajo condiciones cuando se utiliza la yema de huevo
asépticas, la yema de huevo. Se fresco como ingrediente, haciendo la
mezcla bien después de cada aclaración que éste en lo posible sea
adición mediante rotación para utilizado en su totalidad y la forma
minimizar la formación de adecuada de adicionarlo al medio.
espuma.
Servir inmediatamente en las

cajas de Petri.
5.3.4 Preparación de las cajas 5.3.4 Preparación de las cajas Se modifica el numeral respecto a
...Antes del uso para eliminar la ...Antes del uso, se secan las normas de bioseguridad y buenas
condensación, se deben dejar las cajas, preferiblemente con las prácticas de laboratorio en los
cajas, con las tapas sueltas en un tapas sueltas y con la superficie laboratorios de microbiología
área aséptica. del agar hacia abajo, en un horno dictados en cursos por los entes
a una temperatura entre 25 °C y regulatorios, buscando evitar la
50 °C, hasta que las gotas se contaminación de los medios de
hayan dispersado en la superficie cultivo utilizados para las
del medio. determinaciones.
6.3 Cabina de secado o Se elimina este equipo, debido a
incubadora, capaz de mantener la que el secado de los medios de
temperatura de 25 °C ± 1 °C y 50 cultivo se realizará en un área o
°C ± 1 °C. cabina aséptica y no en una estufa
de secado.
9.1 Porción de ensayo, 9.1 Porción de ensayo, Se incluyen las referencias de las
suspensión inicial y diluciones. suspensión inicial y diluciones normas técnicas que reemplazaron
la ISO 4491.
Véase la NTC 4491-1, NTC 4491-2, Véase la NTC 4491 y la norma
NTC 4491-3, NTC 4491-4 y la norma especifica para el producto en
especifica para el producto en cuestión.
cuestión.
9.4.1 Cuando se emplea 9.4.1 Cuando se emplea Se modifica el numeral de acuerdo
Medio Baird Parker Véase el Medio Baird Parker Véase el con la actualización realizada en el
numeral 5.3.3 numeral 5.3.3 documento de referencia, respecto
con el número colonias típicas o
...VÉASE NUMERAL EN LA NORMA colonias atípicas o ambas que deben
NTC 4779 (Primera actualización) ser tenidas en cuenta para realizar la
confirmación. Adicionalmente en las
notas se aclara que las colonias que
deben ser tenidas en cuenta para
esta determinación se aclara en la
NOTA 1.
11. PRECISIÓN 11. PRECISIÓN Se incluye la información para
determinar la precisión de la prueba,
VÉASE NUMERAL EN LA NORMA que se encuentra en la actualización
NTC 4779 (Primera actualización) del documento de referencia.
Se incluyen los resultados de los
ANEXO A estudios interlaboratorios realizados
(Informativo) por el grupo de trabajo de la ISO
RESULTADOS DE UN ESTUDIO para estandarizar la técnica
INTERLABORATORIOS analítica.
ANEXO B 5.6 MEDIO PLASMA DE Se envía la preparación y la técnica

(Informativo) CONEJO FIBRINÓGENO (VER del medio plasma de conejo como un
MEDIO DE CULTIVO ALTERNO REFERENCIAS [6] Y [7]) método alternativo para la
B.1 PLASMA DE CONEJO determinación de S. aureus en
9.3 INOCULACIÓN E productos como cárnicos crudos y
INCUBACIÓN CUANDO SE lácteos y no como parte de la prueba
EMPLEA MEDIO PLASMA DE de rutina para su determinación.
CONEJO FIBRINÓGENO VÉASE
NUMERAL 5.6
23
BIBLIOGRAFÍA
[1] NTC 5014, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Protocolo para la
validación de métodos alternos.
[2] ISO 5725-2 - Accuracy (Trueness and Precision) 01 Measurement Methods and Results.
Part 2: Basic Method for the Determination Repeatability and Reproducibility of Standard
Measurement Method.
[3] ISO 16140 - Microbiology of Food and Animal Feeding stuffs. Protocol for the Validation
of Alternative Methods.
[4] DE BUYSER, M.L., LOMBARD, B., SHULTEN, S.M., IN'r VELO, P.R., SCOTTER, S.L.,
ROLLIER, R., LAHELLEC, C. Validation of EN ISO Standard Methods 6888 Part 1 and
Part 2:1999, Enumeration of Coagulase-Positive Staphylococci in Foods. Int. J Food
Microbiol., 83(2), 2003, pp. 185-194.
[5] AOAC INTERNATIONAL Official Methods of Analysis 18th Ed 2005, AOAC

INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, USA, Method 975.55.S aureus in dairy foods. p 87-
89. Chapter 17.
[6] BECKERS H.L. et al. Evaluation of a Pour-Plate System with Rabbit Plasma-Bovine
Fibrinogen Agar for the Enumeration of Staphylococcus Aureus in Food. Can. J.
Microbiol., 30, 1984, pp 470-474.
[7] SAWNEY D. The Toxicity of Potassium Tellurite to Staphylococcus Aureus in Rabbit

Plasma Fibrinogen Agar, J. Applied Bacteriology. 61, 1986, pp. 149-155.
24
DOCUMENTOS DE REFERENCIA
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology of Food and

Animal Feeding Stuffs-Horizontal Method for the Enumeration of Coagulase-Positive
Staphylococci (Staphylococcus aureus and other species)- Part 1: Technique Using Baird-
Parker Agar Medium. Geneva: ISO, 1999, pp. 11, (ISO 6888-1:1999/ Amendment 1:2003).
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology of Food and Animal

Feeding Stuffs-Horizontal Method for the Enumeration of Coagulase-Positive Staphylococci
(Staphylococcus Aureus And other Species)- Part 2: Technique Using Rabbit Plasma Fibrinogen
Agar Medium. Geneva: ISO, 1999, pp. 6, (ISO 6888-2:1999).
25

NTC4779 Recuento de Estafilococos Cuagulasa Positiva

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NORMA TÉCNICA NTC

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS

E: MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING STUFFS.

CORRESPONDENCIA: esta norma es una adopción

DESCRIPTORES: microbiología; análisis microbiológico;

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

Prohibida su reproducción Primera actualización

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo

La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

ACEGRASAS S.A. INDUSTRIA PRODUCTORA DE ACEITES

3M COLOMBIA S.A. LABORATORIOS GRAM LTDA.

2. REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................2

3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES .....................................................................................2

5. DILUYENTE Y MEDIO DE CULTIVO...........................................................................3

5.1 GENERAL ....................................................................................................................3

5.3 MEDIO BAIRD-PARKER .............................................................................................3

5.4 CALDO INFUSIÓN CEREBRO-CORAZÓN.................................................................6

6. EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO ........................................................6

8. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO.......................................................7

9.1 PORCIÓN DE ENSAYO ...............................................................................................7

9.2 INOCULACIÓN E INCUBACIÓN CUANDO SE EMPLEA BAIRD PARKER ..............7

9.3 SELECCIÓN DE LAS CAJAS E INTERPRETACIÓN .................................................8

9.4 CONFIRMACIÓN (PRUEBA DE LA COAGULASA) ...................................................9

10. EXPRESIÓN DE RESULTADOS .................................................................................9

10.1 CASO GENERAL .........................................................................................................9

10.2 ESTIMACIÓN DE NÚMEROS BAJOS.......................................................................11

11. PRECISIÓN ................................................................................................................12

11.2 REPETIBILIDAD ........................................................................................................12

12. INFORME DE ENSAYO .............................................................................................14

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES.

La armonización de métodos de ensayo no puede ser inmediata y para ciertos productos,

plasma de conejo fibrinógeno como medio alternativo[véase el Anexo B (Informativo)] después

NTC 4491-2, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Preparación de muestras

NTC 4491-3, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Preparación de

NTC 4491-4, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Preparación de muestras

3.2 Recuento de estafilococos coagulasa-positiva. Determinación del número de

4.1 Se inocula en la superficie de un medio de cultivo selectivo sólido, usando cajas de

5. DILUYENTE Y MEDIO DE CULTIVO

Para la práctica actual de laboratorio, Véase la NTC 4092.

5.3 MEDIO BAIRD-PARKER1)

5.3.1 Medio base

Caseína por digestión pancreática 10,0 g

- Se disuelven los componentes de la base completa deshidratada en agua hasta

- Se ajusta el pH de tal forma que después de la esterilización sea de 7,2 ± 0,2 a

Se transfiere el medio en cantidades de 100 ml a erlenmeyers ó frascos (Véase el numeral 6.5)

[3] si se sospecha de la presencia de Proteus.

Se esteriliza el medio por 15 min. a 121 °C.

5.3.2.1 Solución de telurito de potasio

Telurito de potasio1) (K2TeO3) 1,0 g

- Se disuelve el telurito de potasio en el agua calentando lentamente hasta disolución

- El sólido debe ser soluble. Si se presenta material blanco insoluble, se descarta el

- La solución puede ser almacenada como máximo por un mes a 3 °C ± 2 °C.

- Se descarta la solución si se forma un precipitado blanco.

NOTA Si se dispone de una preparación comercial, debería usarse.

Se calienta la mezcla por 2 h en un baño de maría a 45 °C. Luego se deja por 18 h a 24 h a

Se retira asépticamente el sobrenadante. La solución debe ser en lo posible utilizada en su

5.3.2.3 Solución de Sulfamezatina (sulfametazina, sulfadimidina)

- Se disuelve la sulfametazina en la solución de hidróxido de sodio.

- Se completa hasta 100 ml con agua.

- La solución puede ser almacenada como máximo por un mes a 3 °C ± 2 °C.

5.3.3 Medio completo

Medio base (véase el numeral 5.3.1) 100 ml

- Se funde el medio, luego, se enfría a 45 °C ± 1 °C mediante el baño de maría (Véase el

5.3.4 Preparación de las cajas