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NORMA TÉCNICA NTC

COLOMBIANA 4574

2007-03-21

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS


PARA ANIMALES.
MÉTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIÓN DE
SALMONELLA SPP

E: MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING


STUFFS. GENERAL GUIDANCE ON METHODS FOR THE
DETECTION OF SALMONELLA SPP

CORRESPONDENCIA: esta norma es una adopción


modificada (MOD) de la norma
ISO 6579:2002

DESCRIPTORES: método horizontal, método de


análisis, microbiología, análisis
microbiológico, detección, Salmonella,

alimentación animal.

I.C.S.: 07.100.30

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)


Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435

Prohibida su reproducción Primera actualización


Editada 2007-03-28
PRÓLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo


nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.

ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.

La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica


está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.

La NTC 4574 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo de 2007-03-21.

Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.

A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a


través de su participación en el Comité Técnico 25 Microbiología.

ACEGRASAS S.A. ENZIPAN DE COLOMBIA LTDA


ALGARRA S.A. FABRICA DE ESPECIAS Y
ALIMENTOS POLAR S.A. CONDIMENTOS EL REY S.A.
ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS. S.A. FRIGORÍFICOS COLOMBIANOS S.A.
ARCHIVO DE BOGOTÁ INDEPENDIENTE.
ASEBIOL LABORATORIO INDUSTRIA PRODUCTORA DE ACEITES
LTDA. ASINAL LTDA RENOVABLES
ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE CIENCIA Y IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA.
TECNOLOGÍA JOHNSON DIVERSEY
ASOCIACIÓN DE MICROBIÓLOGOS KOYOMAD S.A.
JAVERIANOS LABCONTROL E.U.
BIANÁLISIS LABFARVE LABORATORIO DE
BIOCONTROL LTDA. FARMACOLOGÍA VEGETAL
BIOMERIEUX COLOMBIA LABORATORIO DE GENÉTICA Y
BIOQUILAB LTDA. BIOLOGÍA MOLECULAR
CALIDAD INDUSTRIAL LTDA. LABORATORIO EMICAL LTDA.
CARULLA VIVERO S.A. LABORATORIO GRAM
CERCAL LTDA. LABORATORIO MICROLAB LTDA.
COLFRIGOS S.A. LARKIN
COLOMBINA S.A. LESNIAK E.U
COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A. MERCADEO DE ALIMENTOS DE
CORPORACIÓN PARA EL AVANCE DE LA COLOMBIA S.A.
MICROBIOLOGÍA Y LA MICROSCOPÍA – MERCK S.A.
MICROS– MICROBIÓLOGOS ASOCIADOS LTDA.
COSMÉTICA CCYTEC. NULAB LTDA.
CREPES & WAFLES S.A. QUIK LTDA.
DU PONT QUALICON QUÍMICOS Y REACTIVOS LTDA. QUIMIREL
SUIZO S.A.
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
UNIVERSIDAD MANUELA BELTRÁN

Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las


siguientes empresas:

ACEITES Y GRASAS VEGETALES S.A. V LABORATORIO MICROBIOLÓGICO SIS


AQUALAB LABORATOTORIO MICROBIOLÓGICO DE
ASOCIACIÓN COLOMBIANA BARRANQUILLA
DE MICROBIOLOGÍA LEVAPÁN S.A.
AVESCO S.A. LLOREDA GRASAS S.A.
BAVARIA S.A. MEDIIMPLANTES LTDA.
BIOTRENDS LABORATORIOS MINISTERIO DE PROTECCIÓN SOCIAL
CENICAÑA NESTLÉ DE COLOMBIA S.A.
CENTROAGUAS S.A. E.S.P. PASIFLORA COLOMBIANA S.A.
CERVECERÍA LEONA S.A. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
CONGELAGRO PRODUCTORA DE CONCENTRADOS Y
CONSULTORÍAS MICROBIOLÓGICAS JUGOS DE FRUTA
COOPERATIVA DE GANADEROS PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS
DE CARTAGENA LTDA. LTDA.
EMPRESA DE ACUEDUCTO QUIOS LTDA.
Y ALCANTARILLADO DE REPRESENTACIONES
BOGOTÁ FRIGORÍFICO GUADALUPE BIOTECNOLÓGICAS LTDA.
S.A. HOSPITAL DEPARTAMENTAL –RICA RONDO–, INDUSTRIA NACIONAL
DE VILLAVICENCIO DE ALIMENTOS S.A.
INGENIO PICHICHI S.A. SCHERING COLOMBIANA S.A.
INGENIO RIOPAILA TECNIMICRO LABORATORIO DE ANÁLISIS
INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD
–ICA– PÚBLICA
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD UNIVERSIDAD CATÓLICA INGECAL
–INVIMA– INSTITUTO NACIONAL VIKINGOS S.A.
DE VIGILANCIA MÉDICA

ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.

DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4574 (Primera actualización)

CONTENIDO

Página

1. OBJETO...................................................................................................................... 1

2. REFERENCIAS NORMATIVAS..................................................................................1

3. DEFINICIÓN................................................................................................................ 2

4. PRINCIPIO.................................................................................................................. 2

4.1 GENERALIDADES......................................................................................................2

4.2 PREENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO NO SELECTIVO..............................2

4.3 ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO SELECTIVO ..............................................

4.4 SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO............................................................................2

4.5 CONFIRMACIÓN........................................................................................................ 3

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y ANTISUEROS..............................................3

5.1 GENERALIDADES......................................................................................................3

5.2 MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS.....................................................................3

5.3 SUEROS..................................................................................................................... 5

6. EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO....................................5

6.1 EQUIPO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN


EN HÚMEDO (AUTOCLAVE).....................................................................................5

6.2 INCUBADORA............................................................................................................ 5

6.3 MEDIDOR DE pH........................................................................................................5

6.4 FRASCOS PARA CULTIVO.......................................................................................5

6.5 TUBOS PARA CULTIVO.............................................................................................5


Página

6.6 PIPETAS GRADUADAS.............................................................................................5

6.7 CAJAS DE PETRI.......................................................................................................6

6.8 BAÑO DE AGUA.........................................................................................................6

7. MUESTREO................................................................................................................ 6

8. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO.................................................6

9. PROCEDIMIENTO.......................................................................................................6

9.1 MUESTRA PARA ENSAYO Y SUSPENSIONES INICIALES.....................................6

9.2 PREENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO................................................................7

9.3 ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO..............................................................................7

9.4 SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO............................................................................7

9.5 CONFIRMACIÓN........................................................................................................ 8

10. EXPRESIÓN DE RESULTADOS..............................................................................13

11. INFORME DE ENSAYO............................................................................................13

12. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD......................................................................13

ANEXOS

ANEXO A (Normativo)
DIAGRAMA DE PROCEDIMIENTO......................................................................................14

ANEXO B (Normativo)
COMPOSICIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS.................15

ANEXO C (Informativo)
COMPARACIÓN ENTRE EL MÉTODO DE LA ISO 6579:2002 Y LA AOAC VERSIÓN 2005.24
Página

ANEXO D (Informativo)
RESULTADOS DE LA PRUEBA INTERLABORATORIOS.................................................25

ANEXO E (informativo)
CUADRO COMPARATIVO RESPECTO DE LAS MODIFICACIONES REALIZADAS
A LA NTC 4574 (primera actualización) Y SU DOCUMENTO DE REFERENCIA
LA ISO 6579......................................................................................................................... 27

TABLAS

Tabla 1. Interpretación de las pruebas bioquímicas.........................................................11

Tabla 2. Interpretación de las pruebas de confirmación..................................................12

Tabla C.1. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras de
cuajada de queso fresco.....................................................................................................25

Tabla C.2. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras
de huevo deshidratado en polvo........................................................................................26

Tabla C.3. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras
de carne cruda de pollo......................................................................................................26

Tabla C.4. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con materiales
de referencia........................................................................................................................ 26
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES.
MÉTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIÓN DE SALMONELLA SPP.

ADVERTENCIA Para proteger la salud del personal de laboratorio, es esencial que los ensayos de laboratorio para
detectar Salmonella spp. sean únicamente ejecutados en laboratorios apropiadamente equipados, bajo la
supervisión de un microbiólogo, un microbiólogo experimentado, o ambos, y que se tenga un gran cuidado en la
disposición de todos los materiales incubados.

1. OBJETO

Esta norma describe los métodos horizontales para la detección de Salmonella spp.

Sujeta a las limitaciones indicadas al comienzo de esta norma, se aplica a productos para
consumo humano y para alimentación animal, las muestras ambientales en el área de la
producción y manipulación de alimentos.

La temperatura de incubación (35 ºC  2 °C) se acordará entre las partes involucradas y se


debe especificar en el reporte del ensayo.

2. REFERENCIAS NORMATIVAS

Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicación de


este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica únicamente la edición citada.
Para referencias no fechadas, se aplica la última edición del documento normativo
referenciado. (incluida cualquier corrección).

NTC 4092, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generales para los
análisis microbiológicos. (ISO 7218).

NTC 4491-1, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Preparación de


muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los análisis
microbiológicos. Parte 1. Reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y de
diluciones decimales. (ISO 6887).

NTC 5395, Agua para uso en análisis de laboratorio. Especificación y métodos de análisis.

GTC 78, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. guía para la preparación y
producción de medios de cultivo. Guía general para el aseguramiento de la calidad para la
preparación de los medios de cultivo en el laboratorio.

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3. DEFINICIÓN

Para los propósitos de esta norma se aplican las siguientes definiciones.

3.1 Salmonella spp. Bacteria gram negativa que forma colonias típicas sobre un medio
selectivo, el cual exhibe características bioquímicas y serológicas descritas en la presente
norma.

3.2 Detección de Salmonella spp. Determinación de la presencia o ausencia de Salmonella


spp., en una muestra particular de producto, cuando los ensayos son realizados de acuerdo
con la presente norma.

4. PRINCIPIO

4.1 GENERALIDADES

Para la detección de Salmonella spp. se necesitan cuatro etapas sucesivas (véase también el
Anexo A).

NOTA Salmonella spp. puede estar presente en bajas concentraciones y está frecuentemente acompañada por
otros microorganismos. Por tanto, es necesario un preenriquecimiento no selectivo y posteriormente realizar un
enriquecimiento selectivo.

NOTA La determinación de Salmonella puede realizarse también por los siguientes métodos: siembra en membranas
hidrofóbicas, PCR, inmunofluorescencia (VIDAS) o cualquier otro método búsqueda.

4.2 PREENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO NO SELECTIVO

Se inocula en solución buferada, agua peptonada tamponada o caldo lactosado con la muestra
para ensayo, y se incuba a 37 °C  1 °C por 18 h +/2 h.

Para ciertos productos alimenticios es necesario emplear otros procedimientos de


preenriquecimiento. Véase el numeral 9.1.2.

4.3 ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO SELECTIVO

Se inocula 0,1 ml del medio de preenriquecimiento (véase numeral 4.2) en 10 ml del medio
Rappaport Vassiliadis/medio verde malaquita (medio RVS) (o medio selenito según AOAC
967.25 p. 109) y 1,0 ml del medio de preenriquecimiento (véase el numeral 4.2) en el medio
Tetrationate Mueller Kauffmann (medio MKTTn).

El caldo RVS se incuba a 41,5 °C  1,0 °C durante 24 h  3 h y el caldo MKTTn se incuba a


37 °C 1 °C durante 24 h  3 h.

4.4 SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO

A partir de los caldos de enriquecimiento líquido obtenidos en el numeral 4.3, se inoculan como
mínimo dos medios selectivos sólidos:

- Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD),

y cualquier otro medio selectivo complementario al XLD y que sea especialmente adecuado
para el aislamiento de cepas de Salmonella lactosa positivas y Salmonella typhi y paratyphi; el
medio se deja a la elección del laboratorio:
2
EJEMPLO

- agar Rambach

- gar Hektoen

- agar McConkey

- agar bismuto sulfito

- agar Salmonella -Shigella(SS)

- agar verde brillante

- agares cromogénicos selectivos o diferenciales para Salmonella

El agar XLD se incuba a 37 °C ± 1 °C y se examina después de 24 h ± 3 h. El segundo agar


selectivo se incuba a 37 °C  1 °C, y se examina después de 24 h ± 3 h o según las
indicaciones del fabricante del medio de cultivo, si es necesario, después de 48 h para verificar
la presencia de colonias las cuales, a partir de sus características, se consideran presuntivas
de ser Salmonella spp.

4.5 CONFIRMACIÓN

Se subcultivan las colonias de Salmonella spp. presuntivas aisladas como se describe en el


numeral 4.4, y se confirman mediante ensayos bioquímicos y serológicos apropiados.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y ANTISUEROS

5.1 GENERALIDADES

Para la práctica actual de laboratorio véase la NTC 4092 (ISO 7218).

NOTA Se pueden emplear reactivos listos para usar, preparados comercialmente.

5.2 MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS

NOTA Debido al gran número de medios de cultivo y de reactivos, se considera preferible, para la claridad del
texto, dar su composición y preparación en el Anexo B.

5.2.1 Medio de preenriquecimiento no selectivo: Solución buffer, agua peptonada


tamponada o caldo lactosado

Véase el numeral B.1.

5.2.2 Primer medio de enriquecimiento selectivo: Rappaport. Vassiliadis/medio verde


malaquita (medio RVS)

Véase el numeral B.2.

5.2.3 Segundo medio de enriquecimiento selectivo Tetrationate Mueller Kauffmann


(medio MKTTn).

Véase el numeral B.3.


5.2.4 Medios sólidos selectivos en placa para aislamiento

5.2.4.1 Primer medio

Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (agar XLD). Véase el Anexo B.4.

5.2.4.2 Segundo medio

La elección del segundo medio se deja a criterio del laboratorio de análisis. Es conveniente
seguir de manera precisa las instrucciones del fabricante en lo referente a su preparación.

- agar Rambach

- agar Hektoen

- agar McConkey

- agar bismuto sulfito

- agar Salmonella –Shigella (SS)

- agar verde brillante

- agares cromogénicos selectivos o diferenciales para Salmonella.

Véase el literal B.5.

5.2.5 Agar Nutritivo

Véase el literal B.6

5.2.6 Tres azúcares / Agar hierro (Agar TSI)

Véase el literal B.7.

5.2.7 Caldo Urea (Christensen)

Véase el literal B.8.

5.2.8 Medio de la descarboxilación de L-Lisina (LIA)

Véase el literal B.9.

5.2.9 Reactivo para la reacción Voges- Proskauer (VP)

Véase el literal B.10.

5.2.10 Reactivos para la reacción de Indol

Véase el literal B.11.

5.2.11 Agar nutritivo semisólido (movilidad).

Véase el literal B.12.


5.2.12 Disolución salina fisiológica

Véase el literal B.13.

5.2.13 Caldo selenito cistina

Véase el literal B.14.

5.3 SUEROS

Se encuentran disponibles comercialmente varios tipos de sueros que contienen anticuerpos


frente a uno o varios antígenos O; es decir, antisueros que contienen uno o más grupos “O”
(denominados sueros anti O monovalentes o polivalentes), suero anti Vi, y antisueros que
contienen anticuerpos frente a uno o varios factores H (denominados sueros anti H
monovalentes o polivalentes).

Conviene hacer todos los esfuerzos para asegurarse que los antisueros empleados son
adecuados para la detección de todos los serotipos de Salmonella. Con este objetivo se
pueden emplear sólo antisueros preparados por un suministrador competente reconocido (por
ejemplo, por un organismo de vigilancia gubernamental).

6. EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO

NOTA Si el material desechable tiene especificaciones adecuadas, es una alternativa aceptable frente al material
de vidrio reutilizable.

Equipo usual de laboratorio microbiológico (véase la NTC 4092) y, en particular, lo siguiente.

6.1 EQUIPO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN EN


HÚMEDO (AUTOCLAVE)

Véase la NTC 4092 (ISO 7218).

6.2 INCUBADORA

Con capacidad de funcionar a 41,5 oC  1 oC y capaz de operar entre 37 °C  1 °C.

6.3 MEDIDOR DE pH

Con precisión de calibración de  0,1 unidades de pH a 25 ºC.

6.4 FRASCOS PARA CULTIVO

NOTA Pueden usarse frascos para cultivo con tapa rosca metálica o plástica no tóxica.

6.5 TUBOS PARA CULTIVO

De 15 mm de diámetro y de 160 mm de longitud.

6.6 PIPETAS GRADUADAS O PIPETAS AUTOMÁTICAS

De capacidades nominales de 10 ml y de 1 ml, graduadas respectivamente en divisiones de 0,5 ml


y 0,1 ml respectivamente.
6.7 CAJAS DE PETRI

De tamaño pequeño (de 90 mm a 100 mm de diámetro) o de tamaño grande (de 140 mm de


diámetro).
NOTA se pueden utilizar cajas de vidrio o de material desechable.

6.8 BAÑO DE AGUA

En caso de incubar en baño de agua, mantenerlo a una temperatura entre 41,5 °C ± 1,0 °C ó a
37 °C ± 1 °C.

NOTA Se recomienda emplear un baño que contenga un agente antibacteriano debido a la baja dosis infectiva de
Salmonella.

7. MUESTREO

Es importante que el laboratorio reciba una muestra representativa y adecuada para su


correspondiente análisis y que no haya sufrido daños o cambios durante el transporte o el
almacenamiento.

El muestreo no hace parte del método especificado en esta norma. Debe verse la norma
específica para el producto que interese. Si no hay norma específica, se recomienda que las
partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.

8. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO

La muestra para ensayo se prepara de acuerdo con la norma específica del producto que
interese. Si no hay norma específica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un
acuerdo sobre este aspecto.

9. PROCEDIMIENTO

(Véase el diagrama del Anexo A (Normativo)).

9.1 MUESTRA PARA ENSAYO Y SUSPENSIONES INICIALES

9.1.1 Véase la NTC 4491-1 (ISO 6887-1) y la norma específica que trate del producto en
particular. Véase la norma ISO 8261 para leches y productos lácteos.

Para la preparación de la suspensión inicial, se usa como diluyente el medio de


preenriquecimiento especificado en el numeral 5.2.1 y el numeral 4.2 (agua peptonada
tamponada).

En general se prepara la suspensión inicial adicionando una muestra para ensayo de 25 g a 225
ml de medio de preenriquecimiento (véase el numeral 5.2.1), el cual está en proporción de la
muestra para ensayo al medio de preenriquecimiento especificado en este método.

Si la muestra para ensayo prescrita es diferente de 25 g, se usa la cantidad necesaria al medio


de preenriquecimiento para producir aproximadamente una dilución 1/10 (masa a volumen).
NOTA Para reducir la carga de trabajo cuando más de 25 g de la muestra para ensayo de un lote específico de alimentos
ha sido analizado y cuando hay evidencia disponible de que su mezcla (juntando las porciones de muestras para ensayo) no
afecta el resultado del producto en particular, las muestras para ensayo pueden ser compuestas. Por ejemplo, si 10
porciones de ensayo de 25 g se van a analizar, se combinan las 10 unidades para formar una muestra para ensayo
compuesta de 250 g y se adicionan 2,25 L de caldo de preenriquecimiento. Alternativamente, se pueden combinar porciones
de caldos de preenriquecimiento de 0.1 ml ( en 10 ml de medio RVS) y 1 ml ( en 10 ml de medio tetrationate Mueller
Kauffmann) de los caldos de preenriquecimiento provenientes de 10 porciones de muestras para ensayo separadas (véase
el numeral 9.3.1) para enriquecerlas en 100 ml de los medios de enriquecimiento selectivos.

9.1.2 Preparaciones específicas de la suspensión inicial para ciertos productos


alimenticios

NOTA Para preparaciones específicas de la suspensión inicial para ciertos productos alimenticios aplicables a la
determinación de Salmonella o cualquier microorganismo se describen en las NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3 y
NTC 4491-4 e ISO 8261. Si algún producto no está referenciado en estas normas o no existe una norma específica
de producto, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.

9.1.2.1 Cacao y productos que contienen cacao (por ejemplo más del 20 %)

Se añaden, al agua peptonada tamponada (véase el numeral 5.2.1), preferiblemente 50 g/l de


caseína (evitar el empleo de caseína ácida), o 100 g/l de leche desnatada en polvo estéril y se
añaden después de unas 2 h de incubación, 0,018 g/l de verde brillante si es probable que el
producto alimenticio esté muy contaminado con flora Gram positiva.

9.1.2.2 Productos alimenticios ácidos y acidificantes

Se ha de asegurar que el pH no baja de 4,5 durante el preenriquecimiento.

NOTA El pH de los productos alimenticios ácidos y acidificantes es más estable si se emplea agua peptonada
tamponada a doble concentración.

9.2 PREENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO

Se incuba la suspensión inicial a 37 °C  1 oC durante 18 h  2 h.

9.3 ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO

9.3.1 Se transfieren 0,1 ml del medio de cultivo obtenido en el numeral 9.2, a un tubo que
contenga 10 ml del medio RVS (véase el numeral 5.2.2); se transfieren 1 ml del medio de
cultivo obtenido en el numeral 9.2 a un recipiente que contenga 10 ml del medio tetrationate
Mueller Kauffmann (véase el numeral 5.2.3).

NOTA En el caso de utilizar el medio de cultivo selenito como medio de enriquecimiento, se transfieren 1.0 ml del
cultivo obtenido en el numeral 9.2, a un tubo que contenga 10 ml de caldo selenito (véase numeral 5.2.2). Se incuba
a 35 ± 1 °C durante 24 h ± 2 h.

9.3.2 Se incuban los dos medios inoculados (véase el numeral 9.3.1) durante 24 h  3 h como
sigue:

Se incuba el caldo RVS sembrado (véase el numeral 9.3.1) a 41,5 °C  1 °C y el caldo


tetrationate Mueller Kauffmann sembrado a 37 °C  1 °C. Hay que tener cuidado de que no se
supere la máxima temperatura de incubación permitida (42,5 °C).

9.4 SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO

9.4.1 Tras incubar durante 24 h  3 h, utilizando el cultivo obtenido en el caldo RVS (9.3.2), se
siembra mediante un asa la superficie de una placa de Petri que contenga el primer medio en
placa selectivo (agar XLD), de tal forma que se obtengan colonias aisladas.
Se procede de la misma manera con el segundo medio selectivo (véase el numeral 5.2.4.2)
empleando un asa estéril y cajas de Petri.

9.4.2 Tras incubar durante 24 h  3 h, utilizando el cultivo obtenido en caldo tetrationate


Mueller Kauffmann (véase el numeral 9.3.2), se repite el procedimiento descrito en el numeral
9.4.1 con los dos medios selectivos en placa.

9.4.3 Se invierten las placas (véanse los numerales 9.4.1 y 9.4.2) dándoles la vuelta y se
colocan en la incubadora a 35 °C  2 oC para el primer medio. Para el segundo medio en placa
(véase el numeral 5.2.4.2), deben seguirse las instrucciones del fabricante.

9.4.4 Después del período de incubación durante 24 h  3 h, se examinan las cajas (véase el
numeral 9.4.3) para la presencia de colonias típicas de Salmonella y de colonias atípicas que
pueden ser Salmonella (véase la Nota 7). Se marca su posición en la parte inferior de la placa.

Las colonias típicas de Salmonella que crecen en el agar XLD tienen un centro negro y una
zona ligeramente transparente de color rojizo debido al cambio del indicador.

NOTA Las variantes de Salmonella H2S negativas (por ejemplo S. paratyphi A) que crece en agar XLD son rosas
con un centro rosa más oscuro. Las Salmonella lactosa positivas que crecen en agar XLD son amarillas con o sin
ennegrecimiento. Cualquier colonia sospechosa debe estar sujeta a confirmación (véase el numeral 9.5); el
reconocimiento de las colonias de Salmonella es en gran parte obra de la experiencia, y su apariencia puede variar
algo. No sólo de especie a especie, sino también de lote a lote de medio. Con relación a esto, la aglutinación, en
esta etapa, de colonias con antisuero de Salmonella polivalente puede facilitar el reconocimiento de las colonias
sospechosas.

El segundo medio sólido selectivo se incuba a la temperatura adecuada y se realiza la lectura


después del tiempo recomendado por el fabricante para comprobar la presencia de colonias
que, por sus características, se consideran Salmonella presuntivas.

9.5 CONFIRMACIÓN

9.5.1 Generalidades

Para las pruebas de confirmación pueden utilizarse los sistemas de identificación que están
disponibles en el comercio para el análisis bioquímico de Salmonella si demuestran ser fiables.
El empleo de los kits de identificación se refiere a la confirmación bioquímica de las colonias.
Es conveniente que estos kits se empleen siguiendo las instrucciones del fabricante.

NOTA El reconocimiento de las colonias de Salmonella es en gran parte una cuestión de experiencia y, su aspecto
puede variar algo, no solo de serovariedad a serovariedad, sino también de lote a lote del medio de cultivo selectivo
utilizado.

9.5.2 Selección de colonias para su confirmación

Para confirmación se toma al menos una colonia considerada como típica o sospechosa de
cada placa de cada medio selectivo (véase el numeral 9.4), y luego otras cuatro colonias si la
primera es negativa.

Se recomienda que se identifiquen al menos 5 (cinco) colonias en el caso de estudios


epidemiológicos. Si en una placa hubiera menos de 5 (cinco) colonias típicas o sospechosas,
se toman para confirmación todas las colonias típicas o sospechosas.

Se reaíslan las colonias seleccionadas en la superficie de placas de agar nutritivo previamente


secado de manera que permita el desarrollo de las colonias bien aisladas. Se incuban las
placas sembradas a 37 °C  1 °C durante 24 h  3 h.
Una vez realizado el subcultivo en medio nutritivo, se emplean cultivos puros para la
confirmación bioquímica y serológica, se somete a pruebas bioquímicas como son los medios
TSI, LIA, Urea, VP, indol, motilidad.

9.5.3 Confirmación bioquímica

9.5.3.1 Generalidades

Se siembran mediante una asa bacteriológica los medios especificados en los numerales 9.5.3.2 a
9.5.3.7 con cada uno de los cultivos obtenidos de las colonias seleccionadas en el numeral 9.5.2.

9.5.3.2 Agar TSI (numeral 5.2.6)

Se siembra en estría la superficie inclinada del agar y la parte profunda por punción. Se incuba
a 37 °C  1 °C durante 24 h  3 h.

Se interpretan los cambios del medio de la siguiente manera:

a) Profundidad

- Amarillo glucosa positivo (utilización de la glucosa)

- Rojo o sin cambio glucosa negativo (no utilización de la glucosa)

- Negro formación de sulfuro de hidrógeno

- Burbujas o fisuras formación de gas a partir de la glucosa

b) Parte inclinada

- Amarillo lactosa y/o sacarosa positivo (utilización de la lactosa y/o


sacarosa)

- Rojo o sin cambio lactosa y/o sacarosa negativo(no utilización de la lactosa


y/o sacarosa)

Los cultivos típicos de Salmonella muestran la parte inclinada alcalina (roja) y la parte profunda
ácida(amarilla) con formación de gas (burbujas) y (en aproximadamente el 90 % de los casos)
formación de sulfuro de hidrógeno (ennegrecimiento del agar) (véase el numeral 9.5.3.7).

Cuando se aísla una Salmonella lactosa positivo (véase numeral 4.4), la parte inclinada del TSI
es amarilla. Por esto la confirmación preliminar de los cultivos de Salmonella no debe estar
basada sólo en los resultados de las pruebas del TSI (véase el numeral 9.5.3)

9.5.3.3 Caldo urea (véase el numeral 5.2.7).

Se siembra con un asa bacteriológica el inóculo. Se incuba a 37 °C  1 °C durante 24 h  3 h y


se examina de vez en cuando.

Si la reacción es positiva, la descomposición de la urea libera amonio, que cambia el color del rojo
de fenol a rosa y luego a cereza oscuro. La reacción es a menudo visible al cabo de 2 h a 4 h.
9.5.3.4 Medio para la descarboxilación de la L-lisina (véase el numeral 5.2.8)

Se siembra justo por debajo de las superficie del medio líquido. Se incuba a 37 °C  1 °C
durante 24 h  3 h.

La turbidez y un color morado después de la incubación indican una reacción positiva. Un color
amarillo indica una reacción negativa.

9.5.3.5 Medio para reacción de Voges-Proskauer (VP) (véase el numeral 5.2.9)

Se suspende el contenido de un asa de la colonia sospechosa en un tubo estéril que contenga


3 ml de medio VP. Se incuba a 37 °C  1 °C durante 24 h  3 h.

Después de la incubación, se añaden dos gotas de la disolución de creatina, tres gotas de la


disolución etanólica del n-naftol y luego dos gotas de la disolución de hidróxido potásico; se
agita después de la adición de cada reactivo.

La formación de un color rosa a rojo brillante en 15 min indica una reacción positiva.

9.5.3.6 Medio para la reacción del indol (véase el numeral 5.2.10)

Se siembra con la colonia sospechosa un tubo que contenga 5 ml de medio SIM (movilidad).
Se incuba a 37 °C  1 °C durante 24 h  3 h.

Después de la incubación se añade 1 ml del reactivo de Kovacs.

La formación de un anillo rojo indica una reacción positiva. Un anillo amarillo-marrón indica una
reacción negativa.

9.5.3.7 Interpretación de las pruebas bioquímicas

Salmonella muestra generalmente las reacciones indicadas en la Tabla 1.


Tabla 1. Interpretación de las pruebas bioquímicas

Cepa de
Prueba Salmonella
(9.5.3.2 a S.typhi S. paratyphi A S. paratyphi S. paratyphi Otras
9.5.3.7) B C cepas
Re Re Re Re Re
ac % ac %b ac %b ac %b ac %
b b
- - - - -
ci ci ci ci ci
ón ón ón ón ón
Ácido de glucosa en
TSI + 1 + 1 + + 1
0 0 0
0 0 0
Gas de glucosa
- 0 + 1 + + 9
en TSI
0 2
d 0
Ácido de lactosa
- 2 - 1 - - 1
en TSI
0
0
Ácido de sacarosa
- 0 - 0 - - 1
en TSI
Producción de
+ 9 - 1 + + 9
sulfuro de
7 0 2
hidrógeno en TSI
Hidrólisis de urea - 0 - 0 - - 1
Descarboxilación
+ 9 - 0 + + 9
8 5
de la lisina
Reacción de VP - 0 - 0 - - 0
Producción de Indol - 0 - 0 - - 1
4
a
De la referencia [5]

b
Estos porcentajes indican que no todos los aislamientos de serotipos de Salmonella dan las reacciones
marcadas como + +o -. Estos porcentajes pueden variar dentro de un mismo serotipó y entre un serotipo
y otro de los causantes de toxi-infecciones alimentarias de diferentes procedencias.

c
Los porcentajes no son conocidos según la literatura disponible.

d
Salmonella Typhi no produce gas.

e
Las Salmonella enterica subespecie arizonae dan una reacción de lactosa positiva o negativa pero son
siempre β-galactosidasa positivo. Para el estudio de estas cepas puede ser útil realizar pruebas
complementarias.

9.5.4 Confirmación serológica y serotipo

9.5.4.1 Generalidades

La detección de la presencia de los antígenos de Salmonella O, Vi, y H se realiza a partir de las


colonias puras (véase el numeral 9.5.2) mediante aglutinación en portaobjetos con los sueros
adecuados y, después de que las cepas autoaglutinantes hayan sido eliminadas. Se utilizan los
antisueros según las instrucciones del fabricante si difieren de las descritas a continuación.

9.5.4.2 Eliminación de las cepas autoaglutinables

Se sitúa una gota de la disolución salina (véase el numeral 5.2.12) en un portaobjetos de vidrio
perfectamente limpio. Se dispersa parte de la colonia a probar en la gota, con un asa de
manera que se obtenga una suspensión homogénea y turbia.

NOTA También es posible dispersar parte de la colonia a analizar en una gota de agua, y luego mezclar esta
disolución con una gota de la disolución salina (véase el numeral 5.2.12).

Se hace oscilar el portaobjetos de 30 s a 60 s. Se observa el resultado sobre un fondo oscuro,


preferiblemente con la ayuda de una lupa.

Si las bacterias se agrupan en unidades más o menos distintas, se considera la cepa como
autoaglutinable y no debe someterse a las siguientes pruebas, porque la detección de
antígenos no es posible.
9.5.4.3 Comprobación de los antígenos O

Empleando una colonia pura no aglutinable, se procede según el numeral 9.5.4.2, empleando
una gota de suero anti O, en lugar de la disolución salina.

Si se produce aglutinación, la reacción se considera positiva.

Se usa el suero poli y monovalente uno después del otro.

9.5.4.4 Comprobación de los antígenos Vi

Empleando una colonia pura no aglutinable, se procede según el numeral 9.5.4.2, empleando
una gota de suero anti Vi, en lugar de la disolución salina.

Si se produce aglutinación, la reacción se considera positiva.

9.5.4.5 Comprobación de los antígenos H

Se inocula el agar nutritivo semisólido con una colonia pura no autoaglutinable. Se incuba el
medio a 37 °C  1 °C durante 24 h  3 h.

Se usa ese cultivo para el examen de los antígenos H, procediendo según el numeral 9.5.4.2,
empleando una gota de suero anti H, en lugar de la disolución salina.

Si se produce aglutinación, la reacción se considera positiva.

9.5.5 Interpretación de las reacciones bioquímicas y serológicas

La Tabla 2 da las interpretaciones de las pruebas de confirmación (véanse los numerales 9.5.3
y 9.5.4) realizadas en las colonias seleccionadas (véase el numeral 9.5.2).

Tabla 2. Interpretación de las pruebas de confirmación

Reacciones Auto Reacciones serológicas Interpretación


bioquímicas aglutinación
Antígeno O, Vi y H positivo Cepa considerada
Típicas No
como
Salmonella
Típicas No Todas las reacciones negativas
No analizado (véase el numeral
Típicas Si Puede ser Salmonella
9.5.4.2)
Reacciones no típicas No / si Antígeno O, Vi y H positivo
No se considera que
Reacciones no típicas No / si Todas las reacciones negativas
sea
Salmonella

9.5.6 Confirmación definitiva

Las cepas que se consideran que son Salmonella o pueden ser Salmonella (véase la Tabla 2),
deben enviarse a un centro de referencia de Salmonella reconocido para el tipificado definitivo.

Este envío debe acompañarse de toda a información posible referente a la cepa(s) y si se trata
de un brote o de un alimento aislado.
10. EXPRESIÓN DE RESULTADOS

De acuerdo con los resultados de la interpretación, se indica la presencia o ausencia de


Salmonella en una porción de x g de producto (véase la NTC 4092).

Véase el Anexo C para los datos de precisión obtenidos del análisis interlaboratorios.

11. INFORME DE ENSAYO

El informe de ensayo debe especificar:

- toda la información necesaria para la completa identificación de la muestra;

- el método de muestreo utilizado, si se conoce;

- el método de ensayo utilizado, con referencia a esta parte de la norma;

- todos los detalles operativos no especificados en esta parte de la norma, o considerado


como opcional, cualquier incidente detallado que pueda haber influenciado los
resultados del ensayo;

- el resultado obtenido.

El informe del análisis debe también hacer constar si se obtuvo un resultado positivo
exclusivamente con un medio en placa (véase el numeral 5.2.4) no especificado en la presente
norma.

12. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

Se debe verificar la capacidad del laboratorio de detectar la Salmonella con los métodos y los
medios descritos en esta norma e introducir una muestra de referencia en los recipientes de
control del medio de preenriquecimiento (véase el numeral 5.2.1). Se prosigue con los
recipientes de control como para los ensayos de cultivo.
ANEXO A
(Normativo)

DIAGRAMA DE PROCEDIMIENTO

Muestra 25 g

PRE-ENRIQUECIMIENTOCaldoNOdeSELECTIVO
Muller-o caldo lactosado
225 ml de agua peptonada
Incubación a 35°C ±Kauffman
2°C - 18 h ± 2 h
tetratronato
novobiocina
(MKTTn) 37°C
Rapport Vassiliadis Incubar ± 1°C
ENRIQUECIMIENTO 24 h ± 3 h
41,5°C ± 0,5°C 24 h ± 3 h
SELECTIVO

Rambach Hektoen McConkey XLD Verde


Brillante
Incubación a 35°C
SIEMBRA± 2°C
EN MEDIOS SELECTIVOS
24 h ± 3 h

Bism Salmonell
Colonias características
uto a-
PRUEBAS BIOQUÍMICAS sulfi Shiguell
to a
Lisina

SEROLOGIA

Antisuero Polivalente
Antisuero monovalente

Reacción Producció
de Voges- T Urea n de
Proskauer S Indol
I
ANEXO B
(Normativo)

COMPOSICIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

B.1 MEDIO DE PREENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO

B.1.1 Solución buferizada

B.1.1.1 Composición

Fosfato dibásico de sodio anhidro 9.23 g


Ácido cítrico saturado --
Agua 1 000 ml

B.1.1.2 Preparación

Disolver 9,23 g de fosfato dibásico de sodio anhidro en 800 ml de agua, ajustar la solución con
ácido cítrico saturado a un pH de 4 + 0,1 aforar con agua a 1000 ml y mezclar. Esterilizar a 121 ºC
durante 20 min.

B.1.2 Agua peptonada

B.1.2.1 Composición
Peptona 10,0
g
Cloruro de sodio 5,0 g
Hidrofosfato disodico .dodecahidratado(Na2HPO412H2O) 9,0 g
Fosfato dihidrógeno potasico (KH2 PO4) 1,5 g
Agua 1 000 ml

B.1.2.2 Preparación

Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal
modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 7,0. Esterilizar a 121 ºC durante 20 min.

B.1.2 Caldo lactosado

B.1.2.1 Composición

Peptona de gelatina 5,0 g


Extracto de carne 3,0 g
Lactosa 5,0 g

B.1.2.2 Preparación

Disolver 13 gr por litro mezclar bien y distribuir en frascos de 250 ml. Ajustar el pH de tal modo
que después del tratamiento en autoclave, sea de 6,9 . Esterilizar a 121 ºC durante 15 min.

B.2 RAPPAPORT-VASSILIADIS VERDE MALAQUITA

B.2.1 Solución A
B.2.1.1 Composición
Triptona 5,0 g
Cloruro de sodio 8,0 g
Fosfato dipotásico (KH2 PO4) 1,6 g
Agua 1 000
ml

B.2.1.2 Preparación

Debe ser preparada diariamente. Disolver los componentes en agua a 70 °C.

B.2.2 Solución B

B.2.2.1 Composición
Oxalato verde malaquita 0,4 g
Agua 100
ml

B.2.2.2 Preparación

Disolver el oxalato verde malaquita en agua y mantenerlo en frasco oscuro y a una temperatura
fresca.

B.2.3 Medio completo

B.2.3.1 Composición
Solución A 1000
ml
Solución B 10 ml

B.2.3.2 Preparación

Mezclar 1 000 ml de solución A con 10 ml de solución B ajustar el pH de tal modo que después
del tratamiento en autoclave, sea de 5,2. Distribuir en tubos en cantidades de 10 ml y esterilizar
en autoclave a 115 ºC por 15 min. Mantener el medio en refrigeración.

B.3 CALDO MULLER-KAUFFMANN TETRATIONATE NOVOBIOCINA (MKTTn)

B.3.1 Medio base

B.3.1.1 Composición medio base

Extracto de carne 4,3 g


Digerido enzimático de caseína 8,6 g
Cloruro de sodio (NaCl) 2,6 g
Carbonato de calcio (CaCO3) 38,7
g
Tiosulfato de sodio pentahidratado 47,8
g
Bilis de buey para uso bacteriológico 4,78
g
Verde brillante 9,6 g
Agua 1000
ml

B.3.1.2 Preparación
Se disuelven los componentes básicos deshidratados o el medio completo deshidratado en el
agua mediante ebullición durante 5 min..
Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que sea de 8,2  0,2 a 25 °C.

Se mezcla el medio completamente. El medio base puede ser almacenado durante 4 semanas
a 3 °C  0,2 °C.

B.3.2 Disolución de yodo-yoduro

B.3.2.1 Composición

Yodo 20,0
g
Yoduro potásico (KI) 25,0
g
Agua 100
ml

B.3.2.2 Preparación

Se disuelve completamente el yoduro potásico en 10 ml de agua, luego se añade el yodo y se


diluye hasta 100 ml con agua estéril. No calentar.

Se almacena la disolución preparada en la oscuridad a temperatura ambiente en un recipiente


herméticamente cerrado.

B.3.3 Disolución de novobiocina

B.3.3.1 Composición

Sal sódica de novobiocina 0,04


g
Agua 5 ml

B.3.3.2 Preparación

Se disuelve la sal sódica de novobiocina en el agua y se esteriliza por filtración.

Se puede almacenar hasta 4 semanas a 3 °C  0,2 °C.

B.4 AGAR XLD (XILOSA, LISINA DESOXICOLATO)

B.4.1 Composición

Extracto de levadura en polvo 3


g
Cloruro sódico 5
g
Xilosa 3,75 g
Lactosa 7,5 g
Sacarosa 7,5 g
Hidrocloruro de L-lisina 5g
Tiosulfato sódico 6,8 g
Citrato amónico de hierro 0,8 g
Rojo de fenol 0,08g
Desoxicolato sódico 1,0 g
Agar de 9 g a 18
g
Agua 1000 ml
B.4.2 Preparación

Disolver los componentes básicos deshidratados o el medio base en el agua mediante


calentamiento, con agitación frecuente, hasta que el medio comience a hervir. Evitar el
sobrecalentamiento. Se ajusta pH de manera que después de la esterilización sea de 7,4 ± 0,2
a 25 °C.

B.5 FENOL ROJO/ AGAR VERDE BRILLANTE(EDEL Y KAMPELMACHER)

B.5.1 Base

B.5.1.1 Composición
Extracto de carne 5,0 g
Peptona 10,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Disodio hidrogeno fosfato Na2HPO4 1,0 g
Sodio dihidrogeno fosfato NaH2PO4 0,6 g
Agar 12 g a 18 g
1)

Agua 900 ml
1)
Depende de la fuerza del gel

B.5.1.2 Preparación

Disolver los componentes y calentar si es necesario, ajustar el pH a 7,0, transferir a tubos y


esterilizar en autoclave a 121 ºC por 15 min.

B.5.2 Caldo carbohidrato rojo de fenol

B.5.2.1 Composición

Lactosa 10,0 g
Sucrosa 10,0 g
Rojo de fenol 0,09 g
Agua hasta completar volumen 100 ml

B.5.2.2 Preparación

Disolver los componentes en 50 ml de agua, luego llevar a 100 ml, calentar en un baño de
agua a 70 °C por 20 min. Enfriar a 55 °C ± 1 °C y usar inmediatamente.

B.5.3 Solución de verde brillante

B.5.3.1 Composición

Verde brillante 0,5


Agua 100
ml

B.5.3.2 Preparación

Añadir el verde brillante al agua, almacenar la solución en un sitio oscuro.


B.5.4 Medio completo

B.5.4.1 Composición

Base 900 ml
Caldo carbohidrato rojo de fenol 100 ml
Solución de verde brillante 1 ml

B.5.4.2 Preparación

Añadir en condiciones asépticas la solución de verde brillante a el caldo carbohidrato rojo de


fenol, enfriar a 55 °C ± 1 °C y añadir esto a la base.

B.6 AGAR NUTRITIVO

B.6.1 Composición
Extracto de carne 3,
0
g
Peptona 5,
0
g
Agar 12 g a 18 g 1)
Agua 1000 ml
1)
Depende de la fuerza del gel

B.6.2 Preparación

Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal
modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 7,0. Esterilizar a 121 ºC durante 20 min.

B.7 TRES AZÚCARES / AGAR HIERRO (AGAR TSI)

B.7.1 Composición
Extracto de carne 3,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Peptona 20,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Lactosa 10,0 g
Sacarosa 10,0 g
Glucosa 1,0 g
Citrato férrico(III) 0,3 g
Triosulfato de sodio 0,3 g
Rojo fenol 0,024 g
Agar 12 g a 18 g 1)
Agua 1 000 ml
1)
Depende de la fuerza del gel

B.7.2 Preparación

Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal
modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 7,4. Distribuir en tubos en cantidades
de 10 ml y esterilizar a 121 ºC durante 10 min.
B.8 CALDO UREA (CHRISTENSEN)

B.8.1 Base

B.8.1.1 Composición
Peptona 1,0 g
Glucosa 1,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Fosfato dihidrógeno potasico (KH2 PO4) 2,0 g
Rojo fenol 0,012 g
Agua 1 000 ml

B.8.1.2 Preparación

Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal modo
que después del tratamiento en autoclave, sea de 6,8. Esterilizar a 121 ºC durante 20 min.

B.8.2 Solución de urea

B.8.2.1 Composición
Urea 400 g
Agua 1 000
ml

B.8.2.2 Preparación

Disolver la urea en agua, esterilizar por filtración y chequear.

B.8.3 Medio completo

B.8.3.1 Composición
Base 950 ml
Solución de urea 50 ml

B.8.3.2 Preparación

Añadir en condiciones asépticas la solución de urea sobre la base, enfriar a 45 °C ± 1 °C.


Distribuir en tubos en cantidades de 10 ml.

B.9 L-LISINA DESCARBOXILADA

B.9.1 Composición
L-lisina monohidroxiclorada 5,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Glucosa 1,0 g
Púrpura de bromocresol 0,015 g
Agua 1 000 ml

B.9.2 Preparación

Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal
modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 6,8. Distribuir en tubos en cantidades
de 5 ml. Esterilizar a 121 °C durante 10 min.
B.10 REACTIVOS PARA LA REACCIÓN DE VOGES PROSKAUER (VP)

B.10.1 Medio VP

B.10.1.1 Composición

Peptona 7g
Glucosa 5g
Hidrógeno fosfato dipotásico 5g
Agua 1 000 ml

B.10.1.2 Preparación

Se disuelven los componentes en el agua, calentando si fuera necesario. Se ajusta el pH, de


manera que después de la esterilización sea de 6,9  0,2 a 25 °C si es necesario. Se reparte el
medio en tubos en cantidades de 3 ml. Esterilizar a 121 ºC durante 20 min.

B.10.2 Disolución de creatina (N-amidinosarcosina)

B.10.2.1 Composición

Monohidrato de creatina 0,5 g


Agua 100 ml

B.10.2.2 Preparación

Se disuelve el monohidrato de creatina en agua.

B.10.3 1-Naftol, disolución etanólica

B.10.3.1 Composición

1-naftol 6g
Etanol, 96 % (fracción volumen) 100 ml

B.10.3.2 Preparación

Se disuelve el 1-naftol en el etanol.

B.10.4 Disolución de hidróxido de potasio

B.10.4.1 Composición

Hidróxido de potasio 40 g
Agua 100 ml

B.10.4.2 Preparación

Se disuelve el hidróxido de potasio en el agua.


B.11 REACTIVOS PARA LA REACCIÓN DEL INDOL

B.11.1 Medio triptona/triptófano

B.11.1.1 Composición

Triptona 10 g
Cloruro de sodio (NaCl) 5g
DL-Triptófano 1g
Agua 1 000 ml

B.11.1.2 Preparación

Se disuelven los componentes en agua hirviendo. Se ajusta el pH, si fuera necesario, de


manera que después de la esterilización sea de 7,5  0,2 a 25 °C. Se reparte el medio, en
cantidades de 5 ml, en los tubos. Esterilizar a 121 ºC durante 20 min.

B.11.2 Reactivo de kovacs

B.11.2.1Composición

4 dimetil amino benzaldehido 5g


Acido clorhídrico p = 1,18 g/ml a 1,19 g/ml 25
ml
2 metil - 2 butanol 75
ml

B.11.2.2 Preparación

Se mezclan los componentes.

B.12 AGAR NUTRITIVO SEMISÓLIDO

B.12.1 Composición

Extracto de carne 3,0 g


Peptona 5,0 g
Agar De 4 g a 9
g1
Agua 1 000 ml
1)
Depende de la fuerza del gel

B.12.2 Preparación

Se disuelven los componentes en el agua, calentando si fuera necesario. Se ajusta el pH, si


fuera necesario de manera que después de la esterilización sea de 7,0  0,2 a 25 °C. Se
reparte el medio en matraces de capacidad adecuada. Esterilizar a 121 ºC durante 20 min.

B.12.3 Preparación de las placas de agar

Se vierten unos 5 ml del medio recién preparado en tubos. No hay que dejar que el medio se seque.

B.13 DISOLUCIÓN SALINA FISIOLÓGICA

B.13.1 Composición

Cloruro de sodio (NaCl) 8,5 g


Agua 1 000 ml
B.13.2 Preparación

Se disuelve el cloruro de sodio en agua. Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que
después de la esterilización sea de 7,0  0,2 a 25 °C. Se reparten cantidades de la disolución
en matraces o tubos de manera que contengan de 90 ml a 100 ml después de la esterilización.
Esterilizar a 121 ºC durante 20 min.

B.14 SELENITO CISTINA

B.4.1 Base

B.14.1.1 Composición
Triptona 5,0 g
Lactosa 4,0 g
Hidrofosfato disodico 10,0 g
dodecahidratado(Na2HPO412H2
O)
Sodio selenito hidrogenado 4,0 g
Agua 1 000 ml

B.14.1.2 Preparación

Disolver primero los tres componentes tribásicos en agua, llevar a ebullición por 5 min.
Después de enfriar añadir sodio selenito hidrogenado y ajustar el pH a 7,0

B.14.2 Solución de L-Cistina

B.14.2.1 Composición

L-Cistina 0,1 g
Solución de hidróxido de sodio 1 mol/l 15 ml
Agua estéril hasta completar volumen 100 ml

B.14.2.2 Preparación

Colocar los componentes en un erlenmeyer estéril, llevar a 100 ml con agua estéril y no
autoclavar.

B.14.3 Medio completo

B.4.3.1 Composición

Base 1000 ml
Solución de L-Cistina 10 ml

B.14.3.2 Preparación

Enfriar la base y añadir la solución de L-Cistina, asépticamente, ajustar el pH a 7,0. Distribuir


en tubos asépticamente. Preparar la solución diariamente.
ANEXO C
(Normativo)

COMPARACIÓN ENTRE EL MÉTODO DE LA ISO 6579:2002 Y LA AOAC VERSIÓN 2005

AOAC 995.20 AOAC 967.26


ISO 6579:2002 ALIMENTOS ALIMENTOS
ALTAMENTE PROCESADOS
CONTAMINADOS
10 ml de caldo RVS 10 ml de caldo RVS 10 ml de caldo selenito cistina como
como como
preenriquecimiento. preenriquecimiento. preenriquecimiento.
0.1 ml de muestra 0.1 ml de muestra 1 ml de muestra
Se incuba a 41,5 °C ± 1 durante 24 Se incuba a 42 °C ± 0,2 durante 24 h ± 2 Se incuba a 35 ± 1 °C durante 24 h ±
h± h. 2 h.
3 h.
10 ml de caldo Tetrationato como 10 ml de caldo Tetrationato como 10 ml de caldo Tetrationato como
preenriquecimiento. preenriquecimiento. preenriquecimiento.
1.0 ml de la muestra 1.0 ml de muestra 1.0 ml de muestra
Se incuba a 37 ± 1 °C durante 24 h Se incuba a 43 ± 0,2 durante 24 h ± 2 Se incuba a 35 ± 1 °C durante 24 h ±2
±3 h. h.
h.
ANEXO D
(Informativo)

RESULTADOS DE LA PRUEBA INTERLABORATORIOS

En el año 2000 AFSSA Ploufragan en Europa, y Biocontrol Systems en Estados Unidos,


organizaron un análisis colaborativo internacional en el marco del proyecto europeo
SMT CT 96 2098 [6]. Once laboratorios de nueve países europeos y 10 laboratorios de
Estados Unidos participaron en este estudio que tuvo lugar sobre cuajada de queso fresco,
huevo deshidratado en polvo, carne cruda de pollo y un material de referencia. Cada una de las
muestras de alimentos se analizó a dos niveles diferentes de contaminación, junto con un
control negativo.

Las Tablas C.1 a C.4 dan las los valores del rendimiento por tipo de muestra según este
análisis colaborativo. Los resultados obtenidos por algunos laboratorios han sido excluidos de
los cálculos exclusivamente por razones técnicas identificadas claramente (desviaciones del
protocolo).

Tabla C.1. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras de cuajada de queso fresco

Cuajada
Cuajada de Cuajada de
de
queso queso fresco
queso
fresco (nivel de
fresco
(blanco) contami- nación
(nivel de
bajo)
contami-
nación alto)
Número laboratori q enviar l
23 23 23
de os u on o
resultados e s
Número de muestras por laboratorio 5 5 5
Número de laboratorios excluidos 2 2 2
Número de laboratorios retenidos después de 21 21 21
exclusión
Número de muestras aceptadas 105 105 105
Fiabilidad (especificidad), % 100 - -
Fiabilidad (sensibilidad), % - 74,3 83,8
Conformidad, % 100 83,8 95,2
Concordancia, % 100 60,5 71,7
Tabla C.2. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con
muestras de huevo deshidratado en polvo

Huevo Huevo Huevo


deshidratado deshidratado en deshidratado en
en polvo polvo polvo
(blanco) (nivel de (nivel de
contaminación contaminación alto)
bajo)
Número de laboratorios que
26 26 26
enviaron los resultados
Número de muestras por laboratorio 5 5 5
Número de laboratorios excluidos 5 5 5
Número de laboratorios retenidos
21 21 21
después de exclusión
Número de muestras aceptadas 105 105 104
Fiabilidad (especificidad), % 100 - -
Fiabilidad (sensibilidad), % - 98,1 99
Conformidad, % 100 96,2 98,1
Concordancia, % 100 96,2 98,1

Tabla C.3. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras de carne cruda de pollo

Carne cruda de Carne cruda de Carne cruda de


pollo pollo pollo
(blanco) (nivel de (nivel de
contaminación contaminación
bajo) alto)
Número de laboratorios que enviaron
25 25 2
los resultados
5
Número de muestras por laboratorio 5 5 5
Número de laboratorios excluidos 5 5 5
Número de laboratorios retenidos
20 20 2
después de exclusión
0
Número de muestras aceptadas 100 99 1
0
0
Fiabilidad (especificidad), % 100 - -
Fiabilidad (sensibilidad), % - 98 1
0
0
Conformidad, % 100 96,9 1
0
0
Concordancia, % 100 96 1
0
0

Tabla C.4. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con materiales de referencia

Material de referencia
(cápsulas conteniendo unas 5 ufc de S.
Typhimurium)
Número de laboratorios que enviaron los resultados 26
Número de muestras por laboratorio 5
Número de laboratorios excluidos 1
Número de laboratorios retenidos después de exclusión 25
Número de muestras aceptadas 125
Fiabilidad (especificidad), % -
Fiabilidad (sensibilidad), % 94,4
Conformidad, % 88,8
Concordancia, % 89,1
ANEXO E
(Informativo)

CUADRO COMPARATIVO RESPECTO DE LAS MODIFICACIONES REALIZADAS A LA


NTC 4574 (Primera actualización) Y SU DOCUMENTO DE REFERENCIA LA ISO 6579

Documento de
NTC 4574 (primera Sustentación
referencia ISO
actualización)
6579:2002
1. OBJETO 1. OBJETO Se modifica el objeto debido a que
Esta norma describe los Esta norma internacional describe se considera que al nombrar
métodos horizontales para la un método horizontal para la Salmonella spp, no es necesario
detección de Salmonella spp. detección de Salmonella, mencionar que aplica para
Sujeta a las limitaciones indicadas incluyendo Salmonella typhi y Salmonella typhi y Salmonella
al comienzo de esta norma, se Salmonella paratyphi. paratyphi, también.
aplica a productos para consumo Sujeta a las limitaciones discutidas
humano y para alimentación en la introducción esta norma Adicionalmente es importante
animal. internacional es aplicable a: aclarar que la temperatura de
La temperatura de incubación (35 - los productos para incubación se acordará entre las
ºC  2 °C) se acordará entre las consumo humano partes dependiendo del tipo de
partes involucradas y se debe animal; muestras que se estén procesando.
especificar en el reporte del ensayo. - las muestras ambientales
en el área de la producción
y manipulación de
alimentos.
2. 2. Se incluyó la referencia normativa
respecto a los requisitos que debe
REFERENCIAS REFERENCI cumplir el agua para uso en análisis
NORMATIVAS AS de laboratorio.
NTC 5395, Agua para uso en NORMATIV
análisis de laboratorio. AS
Especificación y métodos de
análisis.
4 PRINCIPIO 4. PRINCIPIO Se modifica la redacción de la nota,
4.1 GENERALIDADES 4.1 GENERALIDADES porque se tiende a interpretaciones
Para la detección de Salmonella spp. La detección de Salmonella respecto a “microorganismos
se necesitan cuatro etapas sucesivas necesita cuatro etapas sucesivas lesionados”. Adicionalmente se
(véase también el Anexo A). (véase también el anexo A). incluye una nota respecto al uso de
métodos alternos que son utilizados
NOTA Salmonella spp. puede NOTA Las Salmonella pueden para la detección de éste
estar presente en bajas estar presentes en números microorganismo que están
concentraciones y pequeños y, a menudo están referenciados en otros estándares
está acompañadas de números internacionales tales como la
frecuentemente acompañada por considerablemente mayores de AOAC.
otros microorganismos. Por tanto, otras Enterobacteriaceae o de
es necesario un preenriquecimiento otras familias. Además, el
no selectivo y posteriormente preenriquecimiento es necesario
realizar un enriquecimiento para permitir la detección de
selectivo. números bajos de Salmonella o de
NOTA La determinación de Salmonella lesionadas.
Salmonella puede realizarse
también por los siguientes métodos:
siembra en membranas
hidrofóbicas, PCR,
inmunofluorescencia (VIDAS) o
cualquier otro método búsqueda.
4.2 PREENRIQUECIMIENTO EN 4.2 PRE- Se divide el numeral en dos partes,
MEDIO LÍQUIDO NO SELECTIVO ENRIQUECIMIENTO EN generalidades y preenriquecimiento en
Se inocula en solución buferada, MEDIO LÍQUIDO NO medio líquido no selectivo. En
agua peptonada tamponada o caldo SELECTIVO generalidades se aclara que etapas son
lactosado con la muestra para contempladas para la detección de
ensayo, y se incuba a 37 °C  1 °C Se agua peptonada tamponada con Salmonella y dos notas respecto a
por 18 h la muestra para ensayo, y se incuba muestras con concentraciones bajas y
+/2 h. a 37 recomendaciones para uso de técnicas
Para ciertos productos alimenticios °C  1 °C por 18 h +/2 h. alternativas a la técnica propuesta en el
es necesario emplear Para ciertos productos alimenticios documento.
otros es necesario emplear otros
procedimientos de procedimientos de pre- Se adiciona como medio de
pre- enriquecimiento. Véase el numeral preenriquecimiento la solución buferada y
enriquecimiento. Véase el numeral 9.1.2. el caldo lactosado, como medios
9.1.2. Para grandes cantidades, es alternativos que tienen la misma función
conveniente calentar el agua que el agua peptonada tamponada.
peptonada tamponada a 37 °C  1 El párrafo respecto al calentamiento
°C antes de ser sembrada con la antes de sembrar la porción para análisis
porción para análisis. se retira porque este procedimiento se
da en la preparación de la muestra
dependiendo del producto.
Documento de
NTC 4574 (primera Sustentación
actualización) referencia ISO
6579:2002
4.3 ENRIQUECIMIENTO EN 4.3 ENRIQUECIMIENTO EN Se adiciona el medio de cultivo
MEDIO LÍQUIDO SELECTIVO MEDIO LÍQUIDO selenito recomendado por el
Se inocula 0,1 ml del medio de SELECTIVO método de la AOAC y que es
preenriquecimiento (véase ampliamente utilizado en los
numeral 4.2) en 10 ml del medio Se siembra el medio Rappaport- laboratorios colombianos.
Rappaport Vassiliadis/medio Vassiliadis (caldo RVS) y el caldo Adicionalmente se aclara a que
verde malaquita (medio RVS) (o Muller-Kauffmann tetrationato temperaturas y durante cuanto
medio selenito según AOAC (caldo MKTTn) con el cultivo tiempo debe realizarse la
967.25 p. 109) y 1,0 obtenido en el numeral 4.2. incubación.
ml del medio de
preenriquecimiento (véase el
numeral 4.2) en el medio
Tetrationate Mueller Kauffmann
(medio MKTTn).
El caldo RVS se incuba a 41,5
°C
 1,0 °C durante 24 h  3 h y el
caldo MKTTn se incuba a 37 °C
1
°C durante 24 h  3 h.
4.4 SIEMBRA EN 4.4 SIEMBRA EN PLACA E Se modifica el numeral para incluir
MEDIO SELECTIVO IDENTIFICACIÓN como medio principal el XLD y una
A partir de los caldos de Se siembran dos medios sólidos lista de los posibles medios de
enriquecimiento líquido obtenidos selectivos a partir de los cultivos cultivo que pueden ser utilizados
en el numeral 4.3, se inoculan obtenidos en el numeral 4.3. como alternativa no como una nota
como mínimo dos medios - agar xilosa lisina como está en el documento de
selectivos sólidos: desoxicolato (agar XLD); referencia.
-Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) - cualquier otro medio
Y cualquier otro medio selectivo selectivo complementario al
complementario al XLD y que sea XLD y que sea
especialmente adecuado para el especialmente adecuado
aislamiento de cepas de para el aislamiento de cepas
Salmonella lactosa positivas y de Salmonella lactosa
Salmonella typhi y paratyphi; el positivas y, Salmonella typhi
medio se deja a la elección del y Salmonella paratyphi; el
laboratorio: medio se deja a la elección
EJEMPLO del laboratorio.
- agar Rambach
- Agar Hektoen El agar XLD se incuba a 37 °C ±
- agar McConkey 1
- agar bismuto sulfito °C y se examina después de 24 h
- agar Salmonella ±
- Shigella(SS) 3 h. El segundo agar selectivo se
- agar verde brillante incuba según las
recomendaciones del fabricante.
El agar XLD se incuba a 37 °C ±
1 NOTA – Para información, el agar
°C y se examina después de 24 h verde brillante, agar sulfito de
± 3 h. El segundo agar selectivo bismuto, etc., podrían ser
se incuba a 37 °C  1 °C, y se utilizados como el segundo medio
examina después de 24 h ± 3 h o en placa.
según las indicaciones del
fabricante del medio de cultivo, si
es necesario, después de 48 h
para verificar la presencia de
colonias las cuales, a partir de
sus características, se consideran
presuntivas de ser
Salmonella spp.
4.5 CONFIRMACIÓN 4.5 CONFIRMACIÓN DE En Colombia se entiende que
IDENTIDAD confirmación se refiere a la
identificación del microorganismo
e identidad se refiere cuando se
esta hablando de una persona;
por lo
tanto se elimina.
Documento de
NTC 4574 (primera Sustentación
actualización) referencia ISO
6579:2002
5.1 GENERALIDADES 5.1 GENERALIDADES Se adiciona la nota respecto al uso
de métodos rápidos y reactivos
Para la práctica actual de Para la práctica actual listos para uso, debido a que en el
laboratorio véase la NTC 4092 de laboratorio véase la mercado están disponibles con
(ISO 7218). ISO 7218. técnicas validadas.

NOTA 1 Se pueden
emplear reactivos listos
para usar, preparados
comercialmente.
5.2.1 Medio de pre- 5.2.1 Medio de Se adiciona como medio de pre-
enriquecimiento no selectivo: pre- enriquecimiento la solución
Solución buffer, agua enriquecimiento no selectivo: buferada y el caldo lactosado,
peptonada tamponada o caldo agua peptonada tamponada. como medios alternativos que
lactosado Véase el numeral tienen la misma
B.1. Véase el numeral B.1. función que el agua peptonada
tamponada.
5.2.4.2 Segundo medio 5.2.4.2 Segundo medio Se adiciona el listado para
La elección del segundo medio se seleccionar el segundo
deja a criterio del laboratorio de La elección del segundo medio se medio.
análisis. Es conveniente seguir de deja a criterio del laboratorio de
manera precisa las instrucciones análisis. Es conveniente seguir de
del fabricante en lo referente a su manera precisa las instrucciones
preparación. del fabricante en lo referente a su
- agar Rambach preparación.
- agar Hektoen
- agar McConkey
- agar bismuto sulfito
- agar Salmonella –Shigella
(SS)
- agar verde
brillante. Véase
numeral B.5.
5.2.9 Reactivo para la detección Este numeral se elimina de la
de la β-galactosidasa (o discos norma, debido a que actualmente
de papel listos para su uso y en los laboratorios no se cuenta
empleados según las con los reactivos para realizar
instrucciones del fabricante). esta prueba. Se considera que las
Véase el numeral B. 9. otras bioquímicas mencionadas
en el documento, sirven para
identificar una Salmonella, sin
necesidad de realizar la detección
por medio de
la β- galactosidasa.
5.2.11 Agar nutritivo semisólido 5.2.11 Agar nutritivo semisólido Se adiciona “movilidad” para
(movilidad) Véase el numeral B.12. aclarar el uso del mismo.
Véase el numeral B.12.
6.7 CAJAS DE PETRI 6.7 CAJAS DE PETRI Se incluye la nota para aclarar que
De tamaño pequeño (de 90 mm a De tamaño pequeño (de 90 mm a pueden utilizarse tanto cajas de
100 mm de diámetro) o de 100 mm de diámetro) o de vidrio, como desechables.
tamaño grande (de 140 mm de tamaño grande (de 140 mm de
diámetro). diámetro).

NOTA se pueden utilizar cajas de NOTA se pueden utilizar cajas de


vidrio o de material desechable. vidrio o de material desechable.
6.8 BAÑO DE AGUA 6.4 BAÑO DE AGUA En la norma se decide dejar como
En caso de incubar en baño de En caso de incubar en baño de alternativa para incubar las
agua, mantenerlo a una agua, mantenerlo a una muestras tanto la incubadora,
temperatura entre 41,5 °C ± 1,0 temperatura entre 41,5 °C ± 1,0 como un baño de agua,
°C ó a 37 °C ± 1 °C ó a 37 °C ± 1 introduciendo las dos
°C. °C. temperaturas de incubación en
este caso, pero el laboratorio
NOTA Se recomienda emplear tiene la libertad de decidir,
un baño que contenga un agente mientras que cuente con una
antibacteriano debido a la baja técnica validada y unificar el
dosis equipo en un solo
infectiva de Salmonella. numeral.
Documento de
NTC 4574 (primera Sustentación
actualización) referencia ISO
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9.1 MUESTRA PARA 9.1 Muestra para ensayo y Se decide dejar el párrafo como
nota
ENSAYO Y SUSPENSIONES suspensiones iniciales y no como requisito en dado caso
INICIALES Con el fin de reducir la carga de que esta situación se presente.
... NOTA 5Para reducir la carga de trabajo cuando haya de analizarse
trabajo cuando más de 25 g de la más de una porción para análisis
de
muestra para ensayo de un lote 25 g de un determinado lote de
específico de alimentos ha sido alimento y, cuando exista
evidencia
analizado y cuando hay evidencia de que su mezcla (juntando las
disponible de que su mezcla porciones para análisis) no afecta
(juntando al
las porciones de muestras para resultado de ese alimento
en
ensayo) no afecta el resultado del particular, las porciones de
análisis
producto en particular, las pueden ser mezcladas. Por
muestras ejemplo,
para ensayo pueden ser si deben analizarse 10 porciones
compuestas. de
Por ejemplo, si 10 porciones de análisis de 25 g, se combinan las
ensayo 10
de 25 g se van a analizar, se unidades para constituir una
porción
combinan las 10 unidades para para análisis compuesta de 250 g
formar y
una muestra para ensayo se añaden 2,25 l de caldo de pre-
compuesta
de 250 g y se adicionan 2,25 l de enriquecimiento. Una
caldo alternativa
de pre-enriquecimiento. sería reunir las porciones de 0,1
ml
Alternativamente, se pueden (en 10 ml de caldo RVS) y 1 ml
combinar (en
porciones de caldos de pre- 10 ml de caldo MKTTn) de los
enriquecimiento de 0.1 ml ( en 10 ml caldos de pre-
de enriquecimiento
medio RVS) y 1 ml ( en 10 ml de provenientes de 10 porciones para
medio
tetrationate Mueller Kauffmann) de análisis separadas (véase el
los
caldos de pre-enriquecimiento numeral 9.3.1) para enriquecerlas
provenientes de 10 porciones de en 100 ml de los medios de
muestras para ensayo separadas enriquecimiento selectivos.
(véase el numeral 9.3.1) para
enriquecerlas en 100 ml de los
medios
de enriquecimiento selectivos.
9.1.2 Preparaciones 9.1.2 Preparaciones Se cambian las referencias
específicas de la específicas de la normativas por las NTC
suspensión inicial para suspensión inicial para colombianas que han sido
ciertos productos alimenticios ciertos productos alimenticios adoptadas en el comité técnico.
Adicionalmente se aclara que si
NOTA 6 Para NOTA Las algún producto que se vaya a
preparaciones analizar no está contemplado
específicas de la suspensión siguientes preparaciones dentro de estas normas, se debe
inicial para ciertos productos específicas se refieren sólo al consultar la norma de producto y si
alimenticios aplicables a la caso de Salmonella. Las no la hay, se debe establecer un
determinación de Salmonella preparaciones específicas acuerdo entre las partes
o aplicables a la determinación de interesadas para su análisis.
cualquier cualquier microorganismo se
microorganismo se describen en describen en las normas
las NTC 4491-1, NTC 4491-2, internacionales ISO 6887-2, ISO
NTC 6887-3, ISO 6887-4 e ISO 8261.
4491-3 y NTC 4491-4 e ISO
8261.
Si algún producto no está
referenciado en estas normas o
no existe una norma específica de
producto, se recomienda que
las
partes interesadas lleguen a un
acuerdo sobre este aspecto.
Documento de
NTC 4574 (primera Sustentación
actualización) referencia ISO
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9.3.1 Se transfieren 0,1 ml del 9.3.1 Se transfieren 0,1 ml del Se incluye una nota para aclarar
medio de cultivo obtenido en el medio de cultivo obtenido en el que se debe hacer con la muestra
numeral 9.2, a un tubo que numeral 9.2, a un tubo que en caso de usar el caldo de cultivo
contenga 10 ml del medio RVS contenga 10 ml del medio RVS selenito.
(véase el numeral 5.2.2); se (véase el numeral 5.2.2); se
transfieren 1 ml del medio de transfieren 1 ml del medio de
cultivo obtenido en el numeral 9.2 cultivo obtenido en el numeral 9.2
a un recipiente que contenga 10 a un recipiente que contenga 10
ml del medio tetrationate Mueller ml del medio tetrationate Mueller
Kauffmann (véase el numeral Kauffmann (véase el numeral
5.2.3). 5.2.3).
NOTA En el caso de utilizar el
medio de cultivo selenito como
medio de enriquecimiento, se
transfieren 1.0 ml del cultivo
obtenido en el numeral 9.2, a un
tubo que contenga 10 ml de caldo
selenito (véase numeral 5.2.2).
Se incuba a 35 ± 1 °C durante 24
h ± 2 h.
9.5.3.5 Detección de la - Véase explicación de su
galactosidasa (5.2..9). Se eliminación en el numeral 5.2.9.
suspende
el contenido de un asa de la
colonia
sospechosa en un tubo
que
contenga 0,25 ml de la disolución
salina (5.3.13). Se añade una gota
de tolueno y se agita el tubo. Se
coloca el tubo en un baño de agua
(6.6) regulado a 37°C y se deja
durante algunos minutos (5 min
aproximadamente). Se añaden 5
ml
del reactivo para la detección de la
-
galactosidasa y se mezcla. Se
vuelve
a colocar el tubo en el baño de
agua
regulado a 37 °C y se deja
durante
24 h ± 3 h, examinando el tubo de
vez en cuando.
ANEXO C Se introduce un anexo informativo
(normativo) realizando una comparación entre
la técnica analítica propuesta en el
COMPARACIÓN ENTRE EL documento de referencia y el
MÉTODO DE LA ISO 6579:2002 Y método propuesto en la AOAC
LA AOAC VERSIÓN 2005 para la detección de Salmonella.
BIBLIOGRAFIA

[1] Manual Técnico División de Insumos pecuarios. Laboratorio Nacional de Insumos


pecuarios 1996

[2] Instituto Nacional de Salud, Análisis Microbiológico de Alimentos. Manual de


procedimientos. Red Nacional de Laboratorios, Septiembre de 1990

[3] Manual operativo de análisis microbiológicos para alimentos. Gilma Janeth Luna, Fondo
Editorial. Fundación Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano.

[4] AOAC INTERNATIONAL Official Methods of Analysis 18th Ed 2005, AOAC


INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, USA, Method 967.25 Salmonella in Foods. p 109-
111. Chapter 17.

[5] AOAC INTERNATIONAL Official Methods of Analysis 18th Ed 2005, AOAC


INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, USA, Method 967.26 Salmonella in Foods. p 111-
112. Chapter 17.
DOCUMENTO DE REFERENCIA

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology. General


Guidance on Methods for the Detection of Salmonella. Geneve, 2002 (ISO6579:2002).