COLOMBIANA 4574
2007-03-21
alimentación animal.
I.C.S.: 07.100.30
ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.
La NTC 4574 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo de 2007-03-21.
Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.
DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4574 (Primera actualización)
CONTENIDO
Página
1. OBJETO...................................................................................................................... 1
2. REFERENCIAS NORMATIVAS..................................................................................1
3. DEFINICIÓN................................................................................................................ 2
4. PRINCIPIO.................................................................................................................. 2
4.1 GENERALIDADES......................................................................................................2
4.5 CONFIRMACIÓN........................................................................................................ 3
5.1 GENERALIDADES......................................................................................................3
5.3 SUEROS..................................................................................................................... 5
6.2 INCUBADORA............................................................................................................ 5
7. MUESTREO................................................................................................................ 6
9. PROCEDIMIENTO.......................................................................................................6
9.5 CONFIRMACIÓN........................................................................................................ 8
ANEXOS
ANEXO A (Normativo)
DIAGRAMA DE PROCEDIMIENTO......................................................................................14
ANEXO B (Normativo)
COMPOSICIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS.................15
ANEXO C (Informativo)
COMPARACIÓN ENTRE EL MÉTODO DE LA ISO 6579:2002 Y LA AOAC VERSIÓN 2005.24
Página
ANEXO D (Informativo)
RESULTADOS DE LA PRUEBA INTERLABORATORIOS.................................................25
ANEXO E (informativo)
CUADRO COMPARATIVO RESPECTO DE LAS MODIFICACIONES REALIZADAS
A LA NTC 4574 (primera actualización) Y SU DOCUMENTO DE REFERENCIA
LA ISO 6579......................................................................................................................... 27
TABLAS
Tabla C.1. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras de
cuajada de queso fresco.....................................................................................................25
Tabla C.2. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras
de huevo deshidratado en polvo........................................................................................26
Tabla C.3. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras
de carne cruda de pollo......................................................................................................26
Tabla C.4. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con materiales
de referencia........................................................................................................................ 26
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES.
MÉTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIÓN DE SALMONELLA SPP.
ADVERTENCIA Para proteger la salud del personal de laboratorio, es esencial que los ensayos de laboratorio para
detectar Salmonella spp. sean únicamente ejecutados en laboratorios apropiadamente equipados, bajo la
supervisión de un microbiólogo, un microbiólogo experimentado, o ambos, y que se tenga un gran cuidado en la
disposición de todos los materiales incubados.
1. OBJETO
Esta norma describe los métodos horizontales para la detección de Salmonella spp.
Sujeta a las limitaciones indicadas al comienzo de esta norma, se aplica a productos para
consumo humano y para alimentación animal, las muestras ambientales en el área de la
producción y manipulación de alimentos.
2. REFERENCIAS NORMATIVAS
NTC 4092, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generales para los
análisis microbiológicos. (ISO 7218).
NTC 5395, Agua para uso en análisis de laboratorio. Especificación y métodos de análisis.
GTC 78, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. guía para la preparación y
producción de medios de cultivo. Guía general para el aseguramiento de la calidad para la
preparación de los medios de cultivo en el laboratorio.
1 de 33
3. DEFINICIÓN
3.1 Salmonella spp. Bacteria gram negativa que forma colonias típicas sobre un medio
selectivo, el cual exhibe características bioquímicas y serológicas descritas en la presente
norma.
4. PRINCIPIO
4.1 GENERALIDADES
Para la detección de Salmonella spp. se necesitan cuatro etapas sucesivas (véase también el
Anexo A).
NOTA Salmonella spp. puede estar presente en bajas concentraciones y está frecuentemente acompañada por
otros microorganismos. Por tanto, es necesario un preenriquecimiento no selectivo y posteriormente realizar un
enriquecimiento selectivo.
NOTA La determinación de Salmonella puede realizarse también por los siguientes métodos: siembra en membranas
hidrofóbicas, PCR, inmunofluorescencia (VIDAS) o cualquier otro método búsqueda.
Se inocula en solución buferada, agua peptonada tamponada o caldo lactosado con la muestra
para ensayo, y se incuba a 37 °C 1 °C por 18 h +/2 h.
Se inocula 0,1 ml del medio de preenriquecimiento (véase numeral 4.2) en 10 ml del medio
Rappaport Vassiliadis/medio verde malaquita (medio RVS) (o medio selenito según AOAC
967.25 p. 109) y 1,0 ml del medio de preenriquecimiento (véase el numeral 4.2) en el medio
Tetrationate Mueller Kauffmann (medio MKTTn).
A partir de los caldos de enriquecimiento líquido obtenidos en el numeral 4.3, se inoculan como
mínimo dos medios selectivos sólidos:
y cualquier otro medio selectivo complementario al XLD y que sea especialmente adecuado
para el aislamiento de cepas de Salmonella lactosa positivas y Salmonella typhi y paratyphi; el
medio se deja a la elección del laboratorio:
2
EJEMPLO
- agar Rambach
- gar Hektoen
- agar McConkey
4.5 CONFIRMACIÓN
5.1 GENERALIDADES
NOTA Debido al gran número de medios de cultivo y de reactivos, se considera preferible, para la claridad del
texto, dar su composición y preparación en el Anexo B.
La elección del segundo medio se deja a criterio del laboratorio de análisis. Es conveniente
seguir de manera precisa las instrucciones del fabricante en lo referente a su preparación.
- agar Rambach
- agar Hektoen
- agar McConkey
5.3 SUEROS
Conviene hacer todos los esfuerzos para asegurarse que los antisueros empleados son
adecuados para la detección de todos los serotipos de Salmonella. Con este objetivo se
pueden emplear sólo antisueros preparados por un suministrador competente reconocido (por
ejemplo, por un organismo de vigilancia gubernamental).
NOTA Si el material desechable tiene especificaciones adecuadas, es una alternativa aceptable frente al material
de vidrio reutilizable.
6.2 INCUBADORA
6.3 MEDIDOR DE pH
NOTA Pueden usarse frascos para cultivo con tapa rosca metálica o plástica no tóxica.
En caso de incubar en baño de agua, mantenerlo a una temperatura entre 41,5 °C ± 1,0 °C ó a
37 °C ± 1 °C.
NOTA Se recomienda emplear un baño que contenga un agente antibacteriano debido a la baja dosis infectiva de
Salmonella.
7. MUESTREO
El muestreo no hace parte del método especificado en esta norma. Debe verse la norma
específica para el producto que interese. Si no hay norma específica, se recomienda que las
partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.
La muestra para ensayo se prepara de acuerdo con la norma específica del producto que
interese. Si no hay norma específica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un
acuerdo sobre este aspecto.
9. PROCEDIMIENTO
9.1.1 Véase la NTC 4491-1 (ISO 6887-1) y la norma específica que trate del producto en
particular. Véase la norma ISO 8261 para leches y productos lácteos.
En general se prepara la suspensión inicial adicionando una muestra para ensayo de 25 g a 225
ml de medio de preenriquecimiento (véase el numeral 5.2.1), el cual está en proporción de la
muestra para ensayo al medio de preenriquecimiento especificado en este método.
NOTA Para preparaciones específicas de la suspensión inicial para ciertos productos alimenticios aplicables a la
determinación de Salmonella o cualquier microorganismo se describen en las NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3 y
NTC 4491-4 e ISO 8261. Si algún producto no está referenciado en estas normas o no existe una norma específica
de producto, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.
9.1.2.1 Cacao y productos que contienen cacao (por ejemplo más del 20 %)
NOTA El pH de los productos alimenticios ácidos y acidificantes es más estable si se emplea agua peptonada
tamponada a doble concentración.
9.3.1 Se transfieren 0,1 ml del medio de cultivo obtenido en el numeral 9.2, a un tubo que
contenga 10 ml del medio RVS (véase el numeral 5.2.2); se transfieren 1 ml del medio de
cultivo obtenido en el numeral 9.2 a un recipiente que contenga 10 ml del medio tetrationate
Mueller Kauffmann (véase el numeral 5.2.3).
NOTA En el caso de utilizar el medio de cultivo selenito como medio de enriquecimiento, se transfieren 1.0 ml del
cultivo obtenido en el numeral 9.2, a un tubo que contenga 10 ml de caldo selenito (véase numeral 5.2.2). Se incuba
a 35 ± 1 °C durante 24 h ± 2 h.
9.3.2 Se incuban los dos medios inoculados (véase el numeral 9.3.1) durante 24 h 3 h como
sigue:
9.4.1 Tras incubar durante 24 h 3 h, utilizando el cultivo obtenido en el caldo RVS (9.3.2), se
siembra mediante un asa la superficie de una placa de Petri que contenga el primer medio en
placa selectivo (agar XLD), de tal forma que se obtengan colonias aisladas.
Se procede de la misma manera con el segundo medio selectivo (véase el numeral 5.2.4.2)
empleando un asa estéril y cajas de Petri.
9.4.3 Se invierten las placas (véanse los numerales 9.4.1 y 9.4.2) dándoles la vuelta y se
colocan en la incubadora a 35 °C 2 oC para el primer medio. Para el segundo medio en placa
(véase el numeral 5.2.4.2), deben seguirse las instrucciones del fabricante.
9.4.4 Después del período de incubación durante 24 h 3 h, se examinan las cajas (véase el
numeral 9.4.3) para la presencia de colonias típicas de Salmonella y de colonias atípicas que
pueden ser Salmonella (véase la Nota 7). Se marca su posición en la parte inferior de la placa.
Las colonias típicas de Salmonella que crecen en el agar XLD tienen un centro negro y una
zona ligeramente transparente de color rojizo debido al cambio del indicador.
NOTA Las variantes de Salmonella H2S negativas (por ejemplo S. paratyphi A) que crece en agar XLD son rosas
con un centro rosa más oscuro. Las Salmonella lactosa positivas que crecen en agar XLD son amarillas con o sin
ennegrecimiento. Cualquier colonia sospechosa debe estar sujeta a confirmación (véase el numeral 9.5); el
reconocimiento de las colonias de Salmonella es en gran parte obra de la experiencia, y su apariencia puede variar
algo. No sólo de especie a especie, sino también de lote a lote de medio. Con relación a esto, la aglutinación, en
esta etapa, de colonias con antisuero de Salmonella polivalente puede facilitar el reconocimiento de las colonias
sospechosas.
9.5 CONFIRMACIÓN
9.5.1 Generalidades
Para las pruebas de confirmación pueden utilizarse los sistemas de identificación que están
disponibles en el comercio para el análisis bioquímico de Salmonella si demuestran ser fiables.
El empleo de los kits de identificación se refiere a la confirmación bioquímica de las colonias.
Es conveniente que estos kits se empleen siguiendo las instrucciones del fabricante.
NOTA El reconocimiento de las colonias de Salmonella es en gran parte una cuestión de experiencia y, su aspecto
puede variar algo, no solo de serovariedad a serovariedad, sino también de lote a lote del medio de cultivo selectivo
utilizado.
Para confirmación se toma al menos una colonia considerada como típica o sospechosa de
cada placa de cada medio selectivo (véase el numeral 9.4), y luego otras cuatro colonias si la
primera es negativa.
9.5.3.1 Generalidades
Se siembran mediante una asa bacteriológica los medios especificados en los numerales 9.5.3.2 a
9.5.3.7 con cada uno de los cultivos obtenidos de las colonias seleccionadas en el numeral 9.5.2.
Se siembra en estría la superficie inclinada del agar y la parte profunda por punción. Se incuba
a 37 °C 1 °C durante 24 h 3 h.
a) Profundidad
b) Parte inclinada
Los cultivos típicos de Salmonella muestran la parte inclinada alcalina (roja) y la parte profunda
ácida(amarilla) con formación de gas (burbujas) y (en aproximadamente el 90 % de los casos)
formación de sulfuro de hidrógeno (ennegrecimiento del agar) (véase el numeral 9.5.3.7).
Cuando se aísla una Salmonella lactosa positivo (véase numeral 4.4), la parte inclinada del TSI
es amarilla. Por esto la confirmación preliminar de los cultivos de Salmonella no debe estar
basada sólo en los resultados de las pruebas del TSI (véase el numeral 9.5.3)
Si la reacción es positiva, la descomposición de la urea libera amonio, que cambia el color del rojo
de fenol a rosa y luego a cereza oscuro. La reacción es a menudo visible al cabo de 2 h a 4 h.
9.5.3.4 Medio para la descarboxilación de la L-lisina (véase el numeral 5.2.8)
Se siembra justo por debajo de las superficie del medio líquido. Se incuba a 37 °C 1 °C
durante 24 h 3 h.
La turbidez y un color morado después de la incubación indican una reacción positiva. Un color
amarillo indica una reacción negativa.
La formación de un color rosa a rojo brillante en 15 min indica una reacción positiva.
Se siembra con la colonia sospechosa un tubo que contenga 5 ml de medio SIM (movilidad).
Se incuba a 37 °C 1 °C durante 24 h 3 h.
La formación de un anillo rojo indica una reacción positiva. Un anillo amarillo-marrón indica una
reacción negativa.
Cepa de
Prueba Salmonella
(9.5.3.2 a S.typhi S. paratyphi A S. paratyphi S. paratyphi Otras
9.5.3.7) B C cepas
Re Re Re Re Re
ac % ac %b ac %b ac %b ac %
b b
- - - - -
ci ci ci ci ci
ón ón ón ón ón
Ácido de glucosa en
TSI + 1 + 1 + + 1
0 0 0
0 0 0
Gas de glucosa
- 0 + 1 + + 9
en TSI
0 2
d 0
Ácido de lactosa
- 2 - 1 - - 1
en TSI
0
0
Ácido de sacarosa
- 0 - 0 - - 1
en TSI
Producción de
+ 9 - 1 + + 9
sulfuro de
7 0 2
hidrógeno en TSI
Hidrólisis de urea - 0 - 0 - - 1
Descarboxilación
+ 9 - 0 + + 9
8 5
de la lisina
Reacción de VP - 0 - 0 - - 0
Producción de Indol - 0 - 0 - - 1
4
a
De la referencia [5]
b
Estos porcentajes indican que no todos los aislamientos de serotipos de Salmonella dan las reacciones
marcadas como + +o -. Estos porcentajes pueden variar dentro de un mismo serotipó y entre un serotipo
y otro de los causantes de toxi-infecciones alimentarias de diferentes procedencias.
c
Los porcentajes no son conocidos según la literatura disponible.
d
Salmonella Typhi no produce gas.
e
Las Salmonella enterica subespecie arizonae dan una reacción de lactosa positiva o negativa pero son
siempre β-galactosidasa positivo. Para el estudio de estas cepas puede ser útil realizar pruebas
complementarias.
9.5.4.1 Generalidades
Se sitúa una gota de la disolución salina (véase el numeral 5.2.12) en un portaobjetos de vidrio
perfectamente limpio. Se dispersa parte de la colonia a probar en la gota, con un asa de
manera que se obtenga una suspensión homogénea y turbia.
NOTA También es posible dispersar parte de la colonia a analizar en una gota de agua, y luego mezclar esta
disolución con una gota de la disolución salina (véase el numeral 5.2.12).
Si las bacterias se agrupan en unidades más o menos distintas, se considera la cepa como
autoaglutinable y no debe someterse a las siguientes pruebas, porque la detección de
antígenos no es posible.
9.5.4.3 Comprobación de los antígenos O
Empleando una colonia pura no aglutinable, se procede según el numeral 9.5.4.2, empleando
una gota de suero anti O, en lugar de la disolución salina.
Empleando una colonia pura no aglutinable, se procede según el numeral 9.5.4.2, empleando
una gota de suero anti Vi, en lugar de la disolución salina.
Se inocula el agar nutritivo semisólido con una colonia pura no autoaglutinable. Se incuba el
medio a 37 °C 1 °C durante 24 h 3 h.
Se usa ese cultivo para el examen de los antígenos H, procediendo según el numeral 9.5.4.2,
empleando una gota de suero anti H, en lugar de la disolución salina.
La Tabla 2 da las interpretaciones de las pruebas de confirmación (véanse los numerales 9.5.3
y 9.5.4) realizadas en las colonias seleccionadas (véase el numeral 9.5.2).
Las cepas que se consideran que son Salmonella o pueden ser Salmonella (véase la Tabla 2),
deben enviarse a un centro de referencia de Salmonella reconocido para el tipificado definitivo.
Este envío debe acompañarse de toda a información posible referente a la cepa(s) y si se trata
de un brote o de un alimento aislado.
10. EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Véase el Anexo C para los datos de precisión obtenidos del análisis interlaboratorios.
- el resultado obtenido.
El informe del análisis debe también hacer constar si se obtuvo un resultado positivo
exclusivamente con un medio en placa (véase el numeral 5.2.4) no especificado en la presente
norma.
Se debe verificar la capacidad del laboratorio de detectar la Salmonella con los métodos y los
medios descritos en esta norma e introducir una muestra de referencia en los recipientes de
control del medio de preenriquecimiento (véase el numeral 5.2.1). Se prosigue con los
recipientes de control como para los ensayos de cultivo.
ANEXO A
(Normativo)
DIAGRAMA DE PROCEDIMIENTO
Muestra 25 g
PRE-ENRIQUECIMIENTOCaldoNOdeSELECTIVO
Muller-o caldo lactosado
225 ml de agua peptonada
Incubación a 35°C ±Kauffman
2°C - 18 h ± 2 h
tetratronato
novobiocina
(MKTTn) 37°C
Rapport Vassiliadis Incubar ± 1°C
ENRIQUECIMIENTO 24 h ± 3 h
41,5°C ± 0,5°C 24 h ± 3 h
SELECTIVO
Bism Salmonell
Colonias características
uto a-
PRUEBAS BIOQUÍMICAS sulfi Shiguell
to a
Lisina
SEROLOGIA
Antisuero Polivalente
Antisuero monovalente
Reacción Producció
de Voges- T Urea n de
Proskauer S Indol
I
ANEXO B
(Normativo)
B.1.1.1 Composición
B.1.1.2 Preparación
Disolver 9,23 g de fosfato dibásico de sodio anhidro en 800 ml de agua, ajustar la solución con
ácido cítrico saturado a un pH de 4 + 0,1 aforar con agua a 1000 ml y mezclar. Esterilizar a 121 ºC
durante 20 min.
B.1.2.1 Composición
Peptona 10,0
g
Cloruro de sodio 5,0 g
Hidrofosfato disodico .dodecahidratado(Na2HPO412H2O) 9,0 g
Fosfato dihidrógeno potasico (KH2 PO4) 1,5 g
Agua 1 000 ml
B.1.2.2 Preparación
Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal
modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 7,0. Esterilizar a 121 ºC durante 20 min.
B.1.2.1 Composición
B.1.2.2 Preparación
Disolver 13 gr por litro mezclar bien y distribuir en frascos de 250 ml. Ajustar el pH de tal modo
que después del tratamiento en autoclave, sea de 6,9 . Esterilizar a 121 ºC durante 15 min.
B.2.1 Solución A
B.2.1.1 Composición
Triptona 5,0 g
Cloruro de sodio 8,0 g
Fosfato dipotásico (KH2 PO4) 1,6 g
Agua 1 000
ml
B.2.1.2 Preparación
B.2.2 Solución B
B.2.2.1 Composición
Oxalato verde malaquita 0,4 g
Agua 100
ml
B.2.2.2 Preparación
Disolver el oxalato verde malaquita en agua y mantenerlo en frasco oscuro y a una temperatura
fresca.
B.2.3.1 Composición
Solución A 1000
ml
Solución B 10 ml
B.2.3.2 Preparación
Mezclar 1 000 ml de solución A con 10 ml de solución B ajustar el pH de tal modo que después
del tratamiento en autoclave, sea de 5,2. Distribuir en tubos en cantidades de 10 ml y esterilizar
en autoclave a 115 ºC por 15 min. Mantener el medio en refrigeración.
B.3.1.2 Preparación
Se disuelven los componentes básicos deshidratados o el medio completo deshidratado en el
agua mediante ebullición durante 5 min..
Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que sea de 8,2 0,2 a 25 °C.
Se mezcla el medio completamente. El medio base puede ser almacenado durante 4 semanas
a 3 °C 0,2 °C.
B.3.2.1 Composición
Yodo 20,0
g
Yoduro potásico (KI) 25,0
g
Agua 100
ml
B.3.2.2 Preparación
B.3.3.1 Composición
B.3.3.2 Preparación
B.4.1 Composición
B.5.1 Base
B.5.1.1 Composición
Extracto de carne 5,0 g
Peptona 10,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Disodio hidrogeno fosfato Na2HPO4 1,0 g
Sodio dihidrogeno fosfato NaH2PO4 0,6 g
Agar 12 g a 18 g
1)
Agua 900 ml
1)
Depende de la fuerza del gel
B.5.1.2 Preparación
B.5.2.1 Composición
Lactosa 10,0 g
Sucrosa 10,0 g
Rojo de fenol 0,09 g
Agua hasta completar volumen 100 ml
B.5.2.2 Preparación
Disolver los componentes en 50 ml de agua, luego llevar a 100 ml, calentar en un baño de
agua a 70 °C por 20 min. Enfriar a 55 °C ± 1 °C y usar inmediatamente.
B.5.3.1 Composición
B.5.3.2 Preparación
B.5.4.1 Composición
Base 900 ml
Caldo carbohidrato rojo de fenol 100 ml
Solución de verde brillante 1 ml
B.5.4.2 Preparación
B.6.1 Composición
Extracto de carne 3,
0
g
Peptona 5,
0
g
Agar 12 g a 18 g 1)
Agua 1000 ml
1)
Depende de la fuerza del gel
B.6.2 Preparación
Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal
modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 7,0. Esterilizar a 121 ºC durante 20 min.
B.7.1 Composición
Extracto de carne 3,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Peptona 20,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Lactosa 10,0 g
Sacarosa 10,0 g
Glucosa 1,0 g
Citrato férrico(III) 0,3 g
Triosulfato de sodio 0,3 g
Rojo fenol 0,024 g
Agar 12 g a 18 g 1)
Agua 1 000 ml
1)
Depende de la fuerza del gel
B.7.2 Preparación
Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal
modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 7,4. Distribuir en tubos en cantidades
de 10 ml y esterilizar a 121 ºC durante 10 min.
B.8 CALDO UREA (CHRISTENSEN)
B.8.1 Base
B.8.1.1 Composición
Peptona 1,0 g
Glucosa 1,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Fosfato dihidrógeno potasico (KH2 PO4) 2,0 g
Rojo fenol 0,012 g
Agua 1 000 ml
B.8.1.2 Preparación
Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal modo
que después del tratamiento en autoclave, sea de 6,8. Esterilizar a 121 ºC durante 20 min.
B.8.2.1 Composición
Urea 400 g
Agua 1 000
ml
B.8.2.2 Preparación
B.8.3.1 Composición
Base 950 ml
Solución de urea 50 ml
B.8.3.2 Preparación
B.9.1 Composición
L-lisina monohidroxiclorada 5,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Glucosa 1,0 g
Púrpura de bromocresol 0,015 g
Agua 1 000 ml
B.9.2 Preparación
Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal
modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 6,8. Distribuir en tubos en cantidades
de 5 ml. Esterilizar a 121 °C durante 10 min.
B.10 REACTIVOS PARA LA REACCIÓN DE VOGES PROSKAUER (VP)
B.10.1 Medio VP
B.10.1.1 Composición
Peptona 7g
Glucosa 5g
Hidrógeno fosfato dipotásico 5g
Agua 1 000 ml
B.10.1.2 Preparación
B.10.2.1 Composición
B.10.2.2 Preparación
B.10.3.1 Composición
1-naftol 6g
Etanol, 96 % (fracción volumen) 100 ml
B.10.3.2 Preparación
B.10.4.1 Composición
Hidróxido de potasio 40 g
Agua 100 ml
B.10.4.2 Preparación
B.11.1.1 Composición
Triptona 10 g
Cloruro de sodio (NaCl) 5g
DL-Triptófano 1g
Agua 1 000 ml
B.11.1.2 Preparación
B.11.2.1Composición
B.11.2.2 Preparación
B.12.1 Composición
B.12.2 Preparación
Se vierten unos 5 ml del medio recién preparado en tubos. No hay que dejar que el medio se seque.
B.13.1 Composición
Se disuelve el cloruro de sodio en agua. Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que
después de la esterilización sea de 7,0 0,2 a 25 °C. Se reparten cantidades de la disolución
en matraces o tubos de manera que contengan de 90 ml a 100 ml después de la esterilización.
Esterilizar a 121 ºC durante 20 min.
B.4.1 Base
B.14.1.1 Composición
Triptona 5,0 g
Lactosa 4,0 g
Hidrofosfato disodico 10,0 g
dodecahidratado(Na2HPO412H2
O)
Sodio selenito hidrogenado 4,0 g
Agua 1 000 ml
B.14.1.2 Preparación
Disolver primero los tres componentes tribásicos en agua, llevar a ebullición por 5 min.
Después de enfriar añadir sodio selenito hidrogenado y ajustar el pH a 7,0
B.14.2.1 Composición
L-Cistina 0,1 g
Solución de hidróxido de sodio 1 mol/l 15 ml
Agua estéril hasta completar volumen 100 ml
B.14.2.2 Preparación
Colocar los componentes en un erlenmeyer estéril, llevar a 100 ml con agua estéril y no
autoclavar.
B.4.3.1 Composición
Base 1000 ml
Solución de L-Cistina 10 ml
B.14.3.2 Preparación
Las Tablas C.1 a C.4 dan las los valores del rendimiento por tipo de muestra según este
análisis colaborativo. Los resultados obtenidos por algunos laboratorios han sido excluidos de
los cálculos exclusivamente por razones técnicas identificadas claramente (desviaciones del
protocolo).
Tabla C.1. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras de cuajada de queso fresco
Cuajada
Cuajada de Cuajada de
de
queso queso fresco
queso
fresco (nivel de
fresco
(blanco) contami- nación
(nivel de
bajo)
contami-
nación alto)
Número laboratori q enviar l
23 23 23
de os u on o
resultados e s
Número de muestras por laboratorio 5 5 5
Número de laboratorios excluidos 2 2 2
Número de laboratorios retenidos después de 21 21 21
exclusión
Número de muestras aceptadas 105 105 105
Fiabilidad (especificidad), % 100 - -
Fiabilidad (sensibilidad), % - 74,3 83,8
Conformidad, % 100 83,8 95,2
Concordancia, % 100 60,5 71,7
Tabla C.2. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con
muestras de huevo deshidratado en polvo
Tabla C.3. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras de carne cruda de pollo
Tabla C.4. Resultados de los análisis de los datos obtenidos con materiales de referencia
Material de referencia
(cápsulas conteniendo unas 5 ufc de S.
Typhimurium)
Número de laboratorios que enviaron los resultados 26
Número de muestras por laboratorio 5
Número de laboratorios excluidos 1
Número de laboratorios retenidos después de exclusión 25
Número de muestras aceptadas 125
Fiabilidad (especificidad), % -
Fiabilidad (sensibilidad), % 94,4
Conformidad, % 88,8
Concordancia, % 89,1
ANEXO E
(Informativo)
Documento de
NTC 4574 (primera Sustentación
referencia ISO
actualización)
6579:2002
1. OBJETO 1. OBJETO Se modifica el objeto debido a que
Esta norma describe los Esta norma internacional describe se considera que al nombrar
métodos horizontales para la un método horizontal para la Salmonella spp, no es necesario
detección de Salmonella spp. detección de Salmonella, mencionar que aplica para
Sujeta a las limitaciones indicadas incluyendo Salmonella typhi y Salmonella typhi y Salmonella
al comienzo de esta norma, se Salmonella paratyphi. paratyphi, también.
aplica a productos para consumo Sujeta a las limitaciones discutidas
humano y para alimentación en la introducción esta norma Adicionalmente es importante
animal. internacional es aplicable a: aclarar que la temperatura de
La temperatura de incubación (35 - los productos para incubación se acordará entre las
ºC 2 °C) se acordará entre las consumo humano partes dependiendo del tipo de
partes involucradas y se debe animal; muestras que se estén procesando.
especificar en el reporte del ensayo. - las muestras ambientales
en el área de la producción
y manipulación de
alimentos.
2. 2. Se incluyó la referencia normativa
respecto a los requisitos que debe
REFERENCIAS REFERENCI cumplir el agua para uso en análisis
NORMATIVAS AS de laboratorio.
NTC 5395, Agua para uso en NORMATIV
análisis de laboratorio. AS
Especificación y métodos de
análisis.
4 PRINCIPIO 4. PRINCIPIO Se modifica la redacción de la nota,
4.1 GENERALIDADES 4.1 GENERALIDADES porque se tiende a interpretaciones
Para la detección de Salmonella spp. La detección de Salmonella respecto a “microorganismos
se necesitan cuatro etapas sucesivas necesita cuatro etapas sucesivas lesionados”. Adicionalmente se
(véase también el Anexo A). (véase también el anexo A). incluye una nota respecto al uso de
métodos alternos que son utilizados
NOTA Salmonella spp. puede NOTA Las Salmonella pueden para la detección de éste
estar presente en bajas estar presentes en números microorganismo que están
concentraciones y pequeños y, a menudo están referenciados en otros estándares
está acompañadas de números internacionales tales como la
frecuentemente acompañada por considerablemente mayores de AOAC.
otros microorganismos. Por tanto, otras Enterobacteriaceae o de
es necesario un preenriquecimiento otras familias. Además, el
no selectivo y posteriormente preenriquecimiento es necesario
realizar un enriquecimiento para permitir la detección de
selectivo. números bajos de Salmonella o de
NOTA La determinación de Salmonella lesionadas.
Salmonella puede realizarse
también por los siguientes métodos:
siembra en membranas
hidrofóbicas, PCR,
inmunofluorescencia (VIDAS) o
cualquier otro método búsqueda.
4.2 PREENRIQUECIMIENTO EN 4.2 PRE- Se divide el numeral en dos partes,
MEDIO LÍQUIDO NO SELECTIVO ENRIQUECIMIENTO EN generalidades y preenriquecimiento en
Se inocula en solución buferada, MEDIO LÍQUIDO NO medio líquido no selectivo. En
agua peptonada tamponada o caldo SELECTIVO generalidades se aclara que etapas son
lactosado con la muestra para contempladas para la detección de
ensayo, y se incuba a 37 °C 1 °C Se agua peptonada tamponada con Salmonella y dos notas respecto a
por 18 h la muestra para ensayo, y se incuba muestras con concentraciones bajas y
+/2 h. a 37 recomendaciones para uso de técnicas
Para ciertos productos alimenticios °C 1 °C por 18 h +/2 h. alternativas a la técnica propuesta en el
es necesario emplear Para ciertos productos alimenticios documento.
otros es necesario emplear otros
procedimientos de procedimientos de pre- Se adiciona como medio de
pre- enriquecimiento. Véase el numeral preenriquecimiento la solución buferada y
enriquecimiento. Véase el numeral 9.1.2. el caldo lactosado, como medios
9.1.2. Para grandes cantidades, es alternativos que tienen la misma función
conveniente calentar el agua que el agua peptonada tamponada.
peptonada tamponada a 37 °C 1 El párrafo respecto al calentamiento
°C antes de ser sembrada con la antes de sembrar la porción para análisis
porción para análisis. se retira porque este procedimiento se
da en la preparación de la muestra
dependiendo del producto.
Documento de
NTC 4574 (primera Sustentación
actualización) referencia ISO
6579:2002
4.3 ENRIQUECIMIENTO EN 4.3 ENRIQUECIMIENTO EN Se adiciona el medio de cultivo
MEDIO LÍQUIDO SELECTIVO MEDIO LÍQUIDO selenito recomendado por el
Se inocula 0,1 ml del medio de SELECTIVO método de la AOAC y que es
preenriquecimiento (véase ampliamente utilizado en los
numeral 4.2) en 10 ml del medio Se siembra el medio Rappaport- laboratorios colombianos.
Rappaport Vassiliadis/medio Vassiliadis (caldo RVS) y el caldo Adicionalmente se aclara a que
verde malaquita (medio RVS) (o Muller-Kauffmann tetrationato temperaturas y durante cuanto
medio selenito según AOAC (caldo MKTTn) con el cultivo tiempo debe realizarse la
967.25 p. 109) y 1,0 obtenido en el numeral 4.2. incubación.
ml del medio de
preenriquecimiento (véase el
numeral 4.2) en el medio
Tetrationate Mueller Kauffmann
(medio MKTTn).
El caldo RVS se incuba a 41,5
°C
1,0 °C durante 24 h 3 h y el
caldo MKTTn se incuba a 37 °C
1
°C durante 24 h 3 h.
4.4 SIEMBRA EN 4.4 SIEMBRA EN PLACA E Se modifica el numeral para incluir
MEDIO SELECTIVO IDENTIFICACIÓN como medio principal el XLD y una
A partir de los caldos de Se siembran dos medios sólidos lista de los posibles medios de
enriquecimiento líquido obtenidos selectivos a partir de los cultivos cultivo que pueden ser utilizados
en el numeral 4.3, se inoculan obtenidos en el numeral 4.3. como alternativa no como una nota
como mínimo dos medios - agar xilosa lisina como está en el documento de
selectivos sólidos: desoxicolato (agar XLD); referencia.
-Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) - cualquier otro medio
Y cualquier otro medio selectivo selectivo complementario al
complementario al XLD y que sea XLD y que sea
especialmente adecuado para el especialmente adecuado
aislamiento de cepas de para el aislamiento de cepas
Salmonella lactosa positivas y de Salmonella lactosa
Salmonella typhi y paratyphi; el positivas y, Salmonella typhi
medio se deja a la elección del y Salmonella paratyphi; el
laboratorio: medio se deja a la elección
EJEMPLO del laboratorio.
- agar Rambach
- Agar Hektoen El agar XLD se incuba a 37 °C ±
- agar McConkey 1
- agar bismuto sulfito °C y se examina después de 24 h
- agar Salmonella ±
- Shigella(SS) 3 h. El segundo agar selectivo se
- agar verde brillante incuba según las
recomendaciones del fabricante.
El agar XLD se incuba a 37 °C ±
1 NOTA – Para información, el agar
°C y se examina después de 24 h verde brillante, agar sulfito de
± 3 h. El segundo agar selectivo bismuto, etc., podrían ser
se incuba a 37 °C 1 °C, y se utilizados como el segundo medio
examina después de 24 h ± 3 h o en placa.
según las indicaciones del
fabricante del medio de cultivo, si
es necesario, después de 48 h
para verificar la presencia de
colonias las cuales, a partir de
sus características, se consideran
presuntivas de ser
Salmonella spp.
4.5 CONFIRMACIÓN 4.5 CONFIRMACIÓN DE En Colombia se entiende que
IDENTIDAD confirmación se refiere a la
identificación del microorganismo
e identidad se refiere cuando se
esta hablando de una persona;
por lo
tanto se elimina.
Documento de
NTC 4574 (primera Sustentación
actualización) referencia ISO
6579:2002
5.1 GENERALIDADES 5.1 GENERALIDADES Se adiciona la nota respecto al uso
de métodos rápidos y reactivos
Para la práctica actual de Para la práctica actual listos para uso, debido a que en el
laboratorio véase la NTC 4092 de laboratorio véase la mercado están disponibles con
(ISO 7218). ISO 7218. técnicas validadas.
NOTA 1 Se pueden
emplear reactivos listos
para usar, preparados
comercialmente.
5.2.1 Medio de pre- 5.2.1 Medio de Se adiciona como medio de pre-
enriquecimiento no selectivo: pre- enriquecimiento la solución
Solución buffer, agua enriquecimiento no selectivo: buferada y el caldo lactosado,
peptonada tamponada o caldo agua peptonada tamponada. como medios alternativos que
lactosado Véase el numeral tienen la misma
B.1. Véase el numeral B.1. función que el agua peptonada
tamponada.
5.2.4.2 Segundo medio 5.2.4.2 Segundo medio Se adiciona el listado para
La elección del segundo medio se seleccionar el segundo
deja a criterio del laboratorio de La elección del segundo medio se medio.
análisis. Es conveniente seguir de deja a criterio del laboratorio de
manera precisa las instrucciones análisis. Es conveniente seguir de
del fabricante en lo referente a su manera precisa las instrucciones
preparación. del fabricante en lo referente a su
- agar Rambach preparación.
- agar Hektoen
- agar McConkey
- agar bismuto sulfito
- agar Salmonella –Shigella
(SS)
- agar verde
brillante. Véase
numeral B.5.
5.2.9 Reactivo para la detección Este numeral se elimina de la
de la β-galactosidasa (o discos norma, debido a que actualmente
de papel listos para su uso y en los laboratorios no se cuenta
empleados según las con los reactivos para realizar
instrucciones del fabricante). esta prueba. Se considera que las
Véase el numeral B. 9. otras bioquímicas mencionadas
en el documento, sirven para
identificar una Salmonella, sin
necesidad de realizar la detección
por medio de
la β- galactosidasa.
5.2.11 Agar nutritivo semisólido 5.2.11 Agar nutritivo semisólido Se adiciona “movilidad” para
(movilidad) Véase el numeral B.12. aclarar el uso del mismo.
Véase el numeral B.12.
6.7 CAJAS DE PETRI 6.7 CAJAS DE PETRI Se incluye la nota para aclarar que
De tamaño pequeño (de 90 mm a De tamaño pequeño (de 90 mm a pueden utilizarse tanto cajas de
100 mm de diámetro) o de 100 mm de diámetro) o de vidrio, como desechables.
tamaño grande (de 140 mm de tamaño grande (de 140 mm de
diámetro). diámetro).
[3] Manual operativo de análisis microbiológicos para alimentos. Gilma Janeth Luna, Fondo
Editorial. Fundación Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano.