Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
COLOMBIANA 5698-
1
2009-08-19
colonias.
I.C.S.: 07.100.30
ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.
Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.
DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 5698-1
CONTENIDO
Página
INTRODUCCIÓN.................................................................................................................... 1
1. ALCANCE................................................................................................................... 2
2. REFERENCIAS NORMATIVAS..................................................................................2
3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES....................................................................................2
4. PRINCIPIO.................................................................................................................. 3
5.1 DILUYENTE................................................................................................................ 3
7. MUESTREO................................................................................................................ 6
9. PROCEDIMIENTO......................................................................................................7
BIBLIOGRAFÍA.................................................................................................................... 10
DOCUMENTO DE REFERENCIA.........................................................................................11
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES.
MÉTODO HORIZONTAL PARA LA ENUMERACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS
PARTE 1: TÉCNICA DE RECUENTO DE COLONIAS EN PRODUCTOS CON
ACTIVIDAD ACUOSA (Aw) SUPERIOR A 0,95
Esta norma consta de las siguientes partes, bajo el título general de Microbiología de alimentos
y productos de alimentación animal. Método horizontal para la enumeración de mohos y
levaduras :
INTRODUCCIÓN
Debido a la gran variedad de alimentos y productos para alimentación, las aplicaciones del
método horizontal que se especifica en esta parte de la norma y en la NTC 5698-2 pueden no
ser adecuadas para determinados productos. En este caso, se pueden utilizar métodos
diferentes específicos para estos productos, si es absolutamente necesario por razones
técnicas justificadas. Sin embargo, se debe hacer todo el esfuerzo para aplicar el método
horizontal que se especifica en esta parte de la norma y en la NTC 5698-2 , en la medida de lo
posible.
ADVERTENCIA Es esencial que la enumeración de los mohos se realice con el máximo cuidado para proteger
al operario y evitar la contaminación de la atmósfera con las esporas de mohos.
1 de 11
1. ALCANCE
2. REFRENCIAS NORMATIVAS
NTC 4491 (todas las partes), Microbiología de alimentos y alimentos para animales.
preparación de muestras para ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para análisis
microbiológico. Parte 1: Reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y de
diluciones decimales.
NTC 4092 Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. reglas generales para el
análisis microbiológico.
GTC 171, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Guía para la preparación y
producción de medios de cultivo. Guía general para los ensayos de desempeño de medios de
cultivo.
ISO 8261, Milk and Milk Products. General Guidance for the Preparation of Test Samples, Initial
Suspensions and Decimal Dilutions for Microbiological Examinations.
3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES
Para los propósitos de este documento, se aplican los siguientes términos y definiciones.
NOTA Existen algunas formas intermedias y la distinción entre una levadura (véase el numeral 3.1) y un moho
(véase el numeral 3.2) puede ser arbitraria.
2
NOTA Las levaduras dentro, en lugar de sobre un medio, desarrollan colonias redondas, lenticulares.
NOTA Los mohos dentro, en lugar de sobre un medio, pueden desarrollar colonias redondas, lenticulares.
EJEMPLO Células vegetativas, grupos de células, esporas, cúmulos de esporas o una porción de micelio de
hongos.
[NTC 3650-6]
3.4 Colonia. Acumulación visible localizada de masa microbiana, desarrollada sobre o dentro
de un medio nutritivo sólido a partir de una partícula viable.
[NTC 3650-6]
4. PRINCIPIO
Se pueden preparar placas adicionales bajo las mismas condiciones, utilizando diluciones
decimales de la muestra de ensayo o de la suspensión inicial.
4.4 Se calcula el número de levaduras y de mohos por gramo o por mililitro de muestra a
partir del número de colonias/propágulas/gérmenes que se obtuvieron sobre las placas
seleccionadas en niveles de dilución que producen colonias contables. Si es necesario, los
mohos y las levaduras se cuentan independientemente.
Con respecto a la práctica actual de laboratorio, véase la NTC 4491(todas las partes).
5.1 DILUYENTE
5.1.1 Generalidades
Véase la NTC 4491 (todas las partes), ISO 861 y las normas específicas que tratan de los
productos en cuestión.
NOTA Es posible adicionar agentes tensoactivos como poli(oxietileno)sorbatitan monooleato1) sódico [0,05 %
(concentración de masa)] a los diluyentes para reducir la formación de grumos de esporas de mohos y conidias
(referencia [2]).
Excepto para la preparación específica de la muestra de ensayo, se recomienda utilizar como diluyente caldo de
agua de peptona al 0,1 % (concentración de masa).
5.2.1 Agar de Dicloran rosa de bengala y cloranfenicol (DRBC) (referencias [3] y [4])
5.2.1.1 Composición
NOTA Teniendo en cuenta la legislación nacional vigente se puede considerar la utilización de medios de cultivo
de la GTC 125; para reportar según las indicaciones de esta Norma Técnica Colombiana se debe utilizar el medio de
cultivo referenciado en el mismo.
5.2.1.2 Preparación
5.2.1.2.1 Generalidades
Elabore una suspensión en agua de todos los ingredientes, excepto el cloranfenicol, y lleva a
ebullición hasta disolverlos completamente. Si es necesario, ajuste el pH (véase el numeral 6.4)
de modo que después de la esterilización esté en 5,6 0,2 a 25 ºC.
1)
Tween 80 es un ejemplo de un producto adecuado disponible en el comercio. Esta información se brinda
para conveniencia de los usuarios de esta norma y no constituye una aprobación de este producto por parte
de ISO.
Enfríe inmediatamente el medio en un baño de agua (6.3) conservado a una temperatura entre
44 °C y 47 °C. Enfríe hasta alcanzar temperatura inferior a 50 °C y dispense en cantidades de
15 ml en cajas de Petri estériles (véase el numeral 6.6).
Permita que el medio se solidifique y, si es necesario, seque la superficie de las placas tal
como se describe en NTC 4092 y GTC 171 (todas las partes).
Utilice inmediatamente o almacene en un lugar oscuro, según la GTC 171 (todas las partes)
hasta que se necesite.
PRECAUCIÓN evite la exposición del medio a la luz ya que los productos de la ruptura citotóxica pueden dar
como resultado una subestimación de la micoflora en las muestras.
Cuando el exceso de crecimiento bacteriano puede ser un problema (por ejemplo en carnes
crudas), se recomienda cloranfenicol (50 mg/l) y clortetraciclina (50 mg/l). En este caso,
prepare el medio básico tal como se describe arriba, solamente con 50 mg de cloranfenicol,
dispénselo en cantidades de 100 ml y esterilice. Preparé también una solución al 0,1%
(concentración de masa) de clortetraciclina hidroclórica en agua (relativamente inestable en
solución, se debe preparar fresco) y esterilice mediante filtración. Justo antes de la utilización,
adicione 5 ml de esta solución, en forma aséptica, a 100 ml del medio básico y vierta en las
placas. No se recomienda la gentamicina ya que se ha reportado que causa inhibición de
algunas especies de levaduras.
Para que los mohos exhiban su morfología total, en particular algunos pigmentos que
normalmente producen, necesitan de elementos traza que pueden no estar presentes en el
agar DRBC. Para identificar los mohos en este medio, adicione la siguiente solución de
elementos traza en 1 ml por litro de medio, antes de llevar al autoclave: ZnSO 4 7H2O 1g;
CuSO4· 5H2O 0,5 g; agua destilada o desionizada 100 ml (referencia [1]).
Con el fin de evitar el exceso de crecimiento de Mucorales sobre las placas de agar, se
recomienda la adición de Tergitol (1 ml/l) al medio de cultivo.
5.2.1.3.1 Generalidades
5.2.1.3.2 Productividad
Incubación: 5 d a 25° C 1° C
Cepas: Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763
Candida albicans ATCC 10231
Aspergillus niger ATCC 16404
2)
Ejemplo de un producto disponible en el comercio. Esta información se suministra para conveniencia de los
usuarios de esta norma y no constituye una aprobación del producto por parte de ICONTEC .
Mucor racemosus ATCC 42647
o cepas registradas como equivalentes en otras
colecciones de hongos.
Incubación: 5 d a 25 °C 1 °C
Cepas: Escherichia coli ATCC 24922 o
Bacillus subtilis ATCC 6633
o cepas registradas como equivalentes en otras colecciones de
bacterias.
6.3 Baño de agua, o equipo similar, con capacidad de funcionar entre 44 °C y 47 °C.
6.5 Frascos, matraces y tubos, para ebullición y almacenamiento del medio de cultivo y
para hacer las diluciones.
6.7 Microscopio, para diferenciar las levaduras de las células bacterianas (campo
luminoso, amplificación de 250 veces a 1 000 veces).
7. MUESTREO
El muestreo no es parte del método que se especifica en esta NTC. El muestreo debería
llevarse a cabo de acuerdo con la norma específica, adecuada al producto en cuestión. Si no
existe norma específica, se recomienda que las partes involucradas lleguen a un acuerdo sobre
este tema.
Prepare la muestra de ensayo según la NTC 4491(todas las partes), NTC 4092 y la norma
específica que trate del producto en cuestión. Si no existe norma específica, se recomienda
que las partes involucradas lleguen a un acuerdo sobre este tema.
9. PROCEDIMIENTO
9.2.1 Sobre una placa de agar DRBC (véase el numeral 5.2.1), utilizando una pipeta o
micropipeta estéril (véase el numeral 6.2), transfiera 0,1 ml de la muestra de ensayo, si es
líquida, o 0,1 ml de la suspensión inicial, en el caso de otros productos (véase el numeral 8).
Sobre una segunda placa de agar DRBC, utilizando una pipeta o micropipeta estéril, transfiera
0,1 ml de la primera dilución decimal (10 -1) (producto líquido) o 0,1 ml de la dilución de 10 -2
(otros productos).
Para facilitar la enumeración de poblaciones bajas de levaduras y mohos, sobre tres de las
cajas se pueden dispersar volúmenes de hasta 0,3 ml de una dilución de 10 -1 de la muestra, o
de la muestra de ensayo, si es líquida.
Repita estas operaciones con diluciones posteriores utilizando una pipeta o micropipeta estéril
para cada dilución decimal.
NOTA Si se sospecha la presencia de mohos de crecimiento rápido, utilice la norma ISO 21527-2[6].
9.2.2 Disperse el líquido sobre la superficie de la placa de agar con un esparcidor estéril
(véase el numeral 6.8) hasta que el líquido se absorba por completo en el medio.
También se puede utilizar la inoculación de las placas mediante el método de vertido en placa,
pero en este caso la equivalencia de los resultados se debe convalidar en comparación a la
inoculación sobre la superficie, y la discriminación y diferenciación de mohos y levaduras no
son admisibles. El método de esparcido sobre la superficie puede dar enumeraciones
superiores. La técnica de esparcido de la placa facilita la exposición máxima de las células al
oxígeno atmosférico y evita el riesgo de desactivación térmica de las propágulas de hongos.
Los resultados pueden depender del tipo de hongos.
9.2.3 Incube aeróbicamente en posición invertida las placas preparadas (véanse los numerales
9.2.2 y 6.1) a 25 °C 1 °C durante 5 d. Si es necesario, deje las placas de agar en reposo en
luz natural difusa durante los 2 primeros días.
Se recomienda incubar las cajas (véase el numeral 6.6) en una bolsa plástica abierta con el fin
de no contaminar la incubadora en el caso de diseminación de los mohos fuera de las cajas.
NOTA 1 Los métodos de enumeración para levaduras y, en especial para los mohos, son imprecisos dado que
consisten en una mezcla de micelio y esporas sexuales y asexuales. Las cantidades de unidades formadoras de
colonias dependen del grado de fragmentación del micelio y de la proporción de esporas capaces de crecer en el
medio en la placa.
NOTA 2 A menudo se presenta la no linealidad de los recuentos de las placas que contienen la dilución, es decir,
las diluciones de 10 veces de la muestra con frecuencia no dan como resultado reducciones de 10 veces en los
números de colonias recuperadas del medio en la placa. Esto se ha atribuido a la fragmentación del micelio y a la
ruptura de los cúmulos de esporas durante la dilución además de la inhibición competitiva cuando hay un gran
número de colonias sobre las placas.
PRECAUCIÓN las esporas de los mohos se dispersan en el aire con gran facilidad. Manipule las cajas de Petri
con cuidado para evitar el desarrollo de colonias satélites que ocasionarían una sobreestimación de la población en
la muestra.
Si es necesario, realice un examen (véase el numeral 6.9) con microscopio (véase el numeral 6.7)
con el fin de diferenciar entre células de levaduras o de mohos y bacterias provenientes de las
colonias.
d) todos los detalles operativos que no se especifican en esta norma o que se consideran
opcionales, junto con los detalles de todos los incidentes que hayan podido tener
influencia en los resultados de ensayo,
[1] Bell, C., Neaves, P., Williams, A.P. Food Microbiology and Laboratory Practice.
Blackwell, Oxford, 2005. 324 p.
[2] Beuchat, L.R. Media for Detecting and Enumerating Yeasts and Moulds. In: Corry,
J.E.L., Curtis, G.D.W., Baird, R.M., Editors. Handbook of Culture Media for Food
Microbiology, pp. 369-386. Elsevier, Amsterdam, 2003. Progress in Industrial
Microbiology, Vol 37).
[3] Beuchat, L.R., Frändberg, E., Deak, T., Alzamora, S.M., Chen, J., Guerrero, A.S.,
López-Malo, A., Ohlsson, I., Olsen, M., Peinado, J.M., Schenurer, J., De Siloniz, M.I.,
Tornai-Lehoczki, J. 2001 Performance of Mycological Media in Enumerating
Desiccated Food Spoilage Yeasts: An Interlaboratory study. Int. J. Food Microbiol. 2001,
70, pp 8-96.
[4] King Jr., A.D., Hocking, A.d., Pitt, J.I. (1979) Dichloran-Rose Bengal Medium for
Enumeration and Isolation of Moulds from Foods. Appl. Environ. Microbiol. 1979, 37, pp.
959-964.