DESCRIPCIÓN BREVE

CONTROL Importancia del control microbiológico y

técnicas de análisis de ambiente y de
aire

MICROBIOLOGICO
DEL SUELO Y DE
SUPERFICIE Responsable
Hoalef Sala Campos - 47617
Microbiología Industrial
Contenido
Control microbiológico ambiental y de superficie........................................................................2
Importancia del control microbiológico.......................................................................................3
Métodos de muestreo microbiológico.........................................................................................4
Técnicas de muestreo ambiental.................................................................................................4
Técnica de sedimentación por gravedad..................................................................................4
Recogida en medio liquido.......................................................................................................6
Filtración..................................................................................................................................6
Impacto sobre superficies solidas............................................................................................6
Muestradores de aire ambiental SAS (susface air system)...........................................................7
Técnicas de muestreo de microorganismo en superficies............................................................7
Método de la placa de contacto (placa RODAC).......................................................................7
Modo de empleo......................................................................................................................8
Interpretación de resultados....................................................................................................8
Lamino cultivos........................................................................................................................8
Modo de empleo e interpretación de resultados.....................................................................8
Control microbiológico ambiental y de superficie

Es cada vez más frecuente que dentro de las normativas de control de calidad se
incluya un control microbiológico ambiental y de superficies y se hace
prácticamente imprescindible en actividades relacionadas con productos destinadas
a sanidad o alimentación.
Para llevar a cabo este análisis debemos establecer previamente:
 El método de muestreo que se va a utilizar
 Los microorganismos que se desean aislar y cuantificar
 Los lugares de muestreo
 Numero de muestras en cada punto
 Frecuencia de los muestreos
Todos estos puntos dependen de las características específicas del ambiente que
se pretenden evaluar.
Una vez determinados, conseguiremos análisis que podremos comparar y por
tanto, obtener datos estadístico. Cualquier comparación de resultados ha de tener
en cuenta los procedimientos de muestreo ya que, existen diferencias
importantes en la eficiencia de captación de los distintos métodos.
En el siguiente cuadro se muestran las principales aplicaciones del control
microbiológico del aire.
Sector de actividad Parámetro a controlar Microorganismos
buscados
Industria farmacéutica ESTERILIDAD DEL Flora aerobia mesofila.
laboratorio de AIRE. Flora fúngica.
microbiología -zonas de
empolvamiento.
-campanas de flujo
laminar.
-estación de seguridad
microbiológica.
Hospitales RIESGOS Flora aerobia mesofila.
INFECCIOSOS. Flora fúngica.
-salas de cirugía. Pseudomonas aeruginosa
-sala de pacientesAspergillius fumigatus
inmune deprimidos. Stafilococos aureus
Industrias alimentaria HIGIENE DE LA Flora aerobia mesofila
PRODUCCIÓN Flora fúngica
Mantenimiento deGérmenes específicos:
higiene. Mucor-penicillium spp
Pseudomonas-
enterococos
Stafilococos
Bodegas industriales Control después de la Flora aerobia mesofila
desinfección. Flora fúngica
Stafilococos
 Enterococos
Aspergillus

Importancia del control microbiológico

El control microbiológico del aire es cada vez más importante para muchas
industrias, como la farmacéutica y alimentaria. Un aire estará muy limpio cuando en
el haya menos de 10 microorganismos por metro cubico.
El aire de las industrias alimentarias contiene en suspensión diferentes tipos de
microorganismo, especialmente bacterias y hongos. Algunos microorganismos se
encuentran en forma de células vegetativas, pero lo más frecuente son las formas
esporuladas, ya que las esporas son metabólicamente menos activas y sobreviven
mejor en la atmosfera porque soportan la desecación.
Esto tiene una importancia especial en las instalaciones que ponen en contacto con
los alimentos grandes volúmenes de aire. También son aconsejables estos análisis en
salas de quirófanos y en general en instalaciones sensibles cercanas a lugares donde
se producen aerosoles.

Métodos de muestreo microbiológico

Para llevas a cabo este análisis debemos establecer previamente:
 El método de muestreo que se va a utilizar.
 Los microorganismos que se desean aislar y cuantificar.
 Los lugares de muestreo.
 La posición del muestreado.
 Numero de muestras en cada punto.
 Frecuencia de los muestreos.
Todos estos puntos dependen de las características específicas del ambiente que
se pretende evaluar.
Las técnicas utilizadas son diversas, de las cuales, la sedimentación, filtración,
el impacto sobre distintas superficies sólidas y el borboteo en medios líquidos,
son las más importante.

Técnicas de muestreo ambiental

Técnica de sedimentación por gravedad
El método de sedimentación en placa Petri ha sido el más ampliamente utilizado
desde que Frankland y Hart lo emplearan por primera vez en 1887. El método
consiste en exponer placas con un medio nutritivo sólido al ambiente durante un
periodo determinado, incubar las placas y hacer el recuento de las colonias
obtenidas. Este método es sencillo y económico. La deposición varía con el tamaño
y forma de los microorganismos, la velocidad y la turbulencia del aire. El método no
puede referirse a un volumen de aire, por lo que los resultados no pueden ser
cuantitativos/volumen de aire, pero si comparativos.
El tiempo de exposición depende del ambiente a evaluar, mientras mayor sea la
contaminación, menor será el tiempo de exposición de las mismas, no deben ser
extremadamente largos para evitar que se reseque la superficie de la placa. Se puede
usar: Agar de Triptona y Soja (T.S.A) para el recuento de aerobios y Agar Rosa de
Bengala para el recuento de hongos.
Normalmente se utilizan placas de 9 cm de diámetro.
Como las condiciones ambientales influyen en la sedimentación de los
microorganismos es necesario que, cuando se realiza este método, las placas se
expongan siempre en el mismo lugar y bajo las mismas condiciones para poder
comparar los resultados obtenidos.
El procedimiento es el siguiente:
1. Marcar la tapa de la placa con agar nutritivo, exponer la placa en el lugar y
durante el tiempo conveniente. (10, 20 o 30 minutos).
2. Incubar la placa a 32,5 ± 2,5°C en posición invertida durante 48 horas. 3. Contar
el número de colonias en la placa.
4. Calcular el número de microorganismos que caen por cm durante 1 minuto.

Para calcular la cantidad de microorganismos que cayeron en la placa por unidad de

tiempo:
 Contar el numero de colonias en la placa. Este numero se expresa como ufc
(unidades formadoras de colonias), ya que varios microorganismos podrían
estar juntos y al multiplicarse solo se vera una colonia.
 Calcular el área de la placa (A)

𝐴 = 𝜋𝑟2
Para una placa de 9 cm de diámetro el área es
A= 3,14 x 4,52 cm2
A=63,62 cm2
 Calcular el numero de microorganismos que caen en el área por unidad de
tiempo.
Se puede expresar en: ufc/ placa/ min, ufc/ cm2/ min o ufc/ área total/ min.
Ejemplo:
Se expone una placa de 9 cm de diámetro en un área durante 30 minutos. Se incuba 24 horas a
32,5 +/- 2 o C y se cuentan 25 colonias. Calcular el número de ufc/ placa/ min y ufc/ cm2 / min.

25 ufc ---------30 min

X --------- 1 min X = 0,833 ufc/ placa/ min

Si deseamos expresar los valores en ufc/ cm/ min

0,833ufc -------- 63,62 cm2

X -------- 1 cm2 X =0,0131 ufc/ cm2 / min

Recogida en medio liquido

El fundamento es similar al impacto sobre medios sólidos y la fuerza de inercia es esencial para
separar los microorganismos contenidos en el aire y que se depositen en el medio líquido.
Consiste en hacer pasar un volumen determinado de aire en forma de burbujas a través de un
caldo de cultivo o solución isotónica, en los cuales, teóricamente, quedan retenidos la mayor
parte de los microorganismos. El recuento de microorganismos se realiza a partir de la siembra
de alicuotas de esta muestra, pudiendo utilizar a continuación las distintas técnicas de análisis
cuantitativo NMP. Este método es más laborioso que el anterior y necesita más utillaje (bomba
de vacío o trompa de agua, material de vidrio). Se introducen por tanto en el ambiente más
variables (el propio utillaje y el analista, que debe estar presente mientras se efectúa el
muestreo). En este caso no existe peligro de
desecación del medio de cultivo y hay exactitud en
el recuento que se puede expresar en ufc/m3 de
aire. Una posible proliferación bacteriana en el
líquido puede conducir a errores en la
cuantificación. Los medios de cultivo que se utilizan
son los mismos que en el caso de la sedimentación
y además, Agua de Peptona o Solución Ringer, que
se utilizan como líquido de burbujeo en la recogida
de la muestra.

Filtración
Por filtración se entiende la captación de partículas suspendidas en el aire al quedar
retenidas a través de un material poroso, fibra de vidrio, alginato o filtros de membrana
(éstos son los más utilizados en la actualidad). Los filtros recogen los microorganismos
por sedimentación, impacto, difusión o atracción electrostática, dependiendo del tipo.
Los filtros de membrana utilizados son de policarbonato, ésteres de celulosa o cloruro
de polivinilo, con un diámetro de poro desde 0,01 a 10 µm, según la naturaleza de los
bioaerosoles. Entre los problemas que destacan, encontramos la pérdida de viabilidad de
las células vegetativas debido a la desecación durante el muestreo. En las muestras
obtenidas en los filtros de membrana se pueden estudiar los microorganismos por
microscopía o por cultivo, colocando los filtros en medios de cultivo sólidos, para
determinar el número de colonias.
Impacto sobre superficies solidas
Esta técnica es la más usada en la actualidad, los microorganismos se separan de la
corriente de aire utilizando la inercia para forzar su sedimentación sobre las superficies
sólidas. El proceso de impacto depende de las propiedades de inercia de la partícula
(tamaño, densidad y velocidad) y de las propiedades físicas del aparato tales como las
dimensiones de la boquilla y el recorrido del flujo de aire.
Se han diseñado una gran variedad de aparatos que difieren por el número de boquillas
o impactores, y por el tamaño, así como el número de pasos o etapas por las que pasa el
aire. En la mayoría de ellos, los microorganismos quedan retenidos sobre un medio de
cultivo sólido contenido en: placas de Petri de distinto tamaño, 65 o 90 mm
(bioMérieux), 100 mm (Anderson y Burkard) y 150 mm (Casella), en tiras de plástico
(Biotest) y en placas de contacto de 55 ó 84 mm (SAS y Microflow). Después de la
incubación, podemos hacer el recuento e identificación de los microorganismos.
No existe un método de muestreo de aire ideal para todas las necesidades, por lo que
para elegir uno deberemos considerar qué queremos investigar y qué información
necesitamos, es decir, deberemos determinar previamente si nos interesa saber el
número total de microorganismos o sólo el de viables, si deseamos identificarlos y
cultivarlos o sólo observar su morfología microscópicamente, si queremos detectar
todos los presentes o sólo los patógenos, etc.

Muestradores de aire ambiental SAS (susface air system)

El sistema más comodo y rápido para efectuar el muestreo ambiental y la detección de
contaminaciones de tipo biológico.
Pueden utilizarse placas RODAC (utilizada en el control de superficies) o placas Petri
convencionales de 90mm.
Facilita el trabajo bajo GLP y GPM gracias a un completo sistema de microprocesador,
que permite el registro en memoria de fecha, hora, volúmenes de muestreo, e incluso
datos de la sala y del operador.
Puede memorizar hasta 32 registros y transmitirlos a un PC o impresora.

Técnicas de muestreo de microorganismo en superficies

Los instrumentso y superficies de trabajo, debido a las condiciones habituales de uso, o
bien, a causa de una dificiente desinfecccion, pueden actuar como reservorios de los
contaminantes biológico.
Normalmente el método no recupera todos los microorganismos, pero si proporciona
una valiosa información.
Los procedimientos básicos para el muestreo de superficies son:
Método de la placa de contacto (placa RODAC)
El método de contacto directo del agar con los microorganismos que se multiplican
utiliza placas Petri especiales, ideales para la investigación de gérmenes en superficies.
Se usa medio cultivo TSA o diferentes medios selectivos a conveniencia.
Se añade a una placa de RODAC, un medio de cultivo solido (seleccionado en función
de los microorganismos buscados), en ligero exceso, para que la superficie quede
convexa. Las superficies a controlar suelen ser limpiadas periódicamente con
detergentes y/o desinfectan-tes. Para realizar el recuento total de microorganismos en
superficie, es aconsejable neutralizar los restos de detergentes y desinfectantes ya
que podrían inhibir el crecimiento. Para ello se utilizará preferentemente un medio
de cultivo que contenga polisorbato, histidina y lecitina (a ver-ces llamados Tween 80 y
lecitina) que funcionan como neutralizantes de aldehídos, compuestos fenólicos y
amonios cuaternarios, que suelen ser utilizados como desinfectantes y detergentes con
actividad antibacteriana. Con esta neutralización se consigue evitar interferencias,
debido a que estas sustancias no pueden inhibir el crecimiento colonial durante el
periodo de incubación y por tanto no afectan a la ulterior lectura e interpretación de
resultados.
Es el método ideal para examinar superficies lisas, duras y no porosas, pero no es muy
recomendable en casos de superficies muy contaminadas, donde es más práctico el uso
de medios selectivos.
Si se desea controlar un grupo de microorganismos en concreto, también recurriremos a
medios selectivos.

Modo de empleo
La placa se coloca sobre la superficie a muestrear de una forma directa, manteniéndola
inmóvil y presionando.
Cerrar e invertir la placa para su incubación, a temperatura y tiempo adecuados según el
medio y determinación realizada.
Interpretación de resultados
Contar las colonias que han crecido y expresar el resultado en ufc/placa.
El resultado también se puede expresar en UFC/cm2 de superficie. Diversos estudios
han deducido que una placa de contacto sólo recoge el 0,1% de la flora de las
superficies (se considera que una placa Rodac tiene 25 cm2), por tanto, se recomienda
que el contaje de la placa se divida por 25 y se multiplique por 1000 para poder expresar
el resultado en ufc/cm2 de superficie estudiada.

Lamino cultivos

La utilización de sistemas analíticos cada vez más rápidos y más prácticos es una
exigencia común en todos los laboratorios de control microbiológico.
Los laminocultivos son sistemas prácticos, estudiados y diseñados especialmente para
la determinación cuantitativa y cualitativa de los microorganismos en todos aquellos
sectores productivos en los cuales es necesario el control de la microbiota contaminante.
Este sistema analítico ofrece las siguientes ventajas:
• Permiten la determinación cualitativa y cuantitativa de los microorganismos.
• La presencia de dos medios de cultivo en un solo soporte permite efectuar muestreos
separados con un solo laminocultivo.
• El cierre hermético con tapón roscado disminuye la posibilidad de contaminación
accidental y mejora la estabilidad del producto.
• Su reducido volumen facilita el transporte, almacenamiento y permite una mejor
gestión del espacio siempre escaso de la estufa de incubación.
Los laminocultivos se presentan en dos versiones:
• Una estudiada para el muestreo y control de líquidos: laminocultivos con dos o tres
medios de cultivo,
• y otra pensada para el control de superficies: laminocultivos con dos superficies. En
este caso poseen un soporte flexible que con la simple presión de la mano puede
doblarse en ángulo de 90° respecto al tapón, permitiendo así una posición perfectamente
paralela con la superficie a muestrear.

Modo de empleo e interpretación de resultados

• Para muestras líquidas: La inmersión del laminocultivo en las muestras líquidas
permite que parte de las bacterias presentes en el líquido se adhieran al medio de
cultivo. El número de microorganismos que se fijan sobre el sustrato nutritivo es
proporcional a la población de la muestra. Tras la incubación, si la muestra estaba
contaminada, se desarrollarán colonias visibles sobre el laminocultivo. A flojar el tapón
y sacar el laminocultivo del tubo sin tocar la superficie del agar.
Sumergir el laminocultivo totalmente en el recipiente que contenga la muestra, durante
un máximo de 5 segundos. (El mismo tubo del laminocultivo puede servir de recipiente
para ser llenado con el líquido de muestra, recordando siempre de vaciarlo tras la
inmersión. Si se dispone de poco volumen de muestra, dejarla gotear sobre el
laminocultivo con ayuda de una pipeta Pasteur.)
Dejar escurrir el exceso de muestra del medio de cultivo.
Volver a meter el laminocultivo en su tubo y roscarlo bien.
Incubarlo en la estufa, en posición vertical, durante el tiempo y la temperatura indicada.
Sacar el laminocultivo y comparar la densidad de las colonias crecidas con la siguiente
tabla de patrones que indica la carga microbiana correspondiente por ml de muestra
líquida.El recuento microbiano en líquidos de la tabla se ha realizado por comparación
con las figuras adjuntas y se expresa en unidades formadoras de colonias (u.f.c) por ml.
Si el recuento obtenido es superior a 100.000 unidades formadoras de colonias por ml,
se recomienda repetir el proceso a partir de una dilución de la muestra en Agua de
Peptona y luego multiplicar los resultados por el factor de dilución. De esta forma
conseguiremos resultados más fiables.
Bibliografía

 https://nanopdf.com/download/control-microbiologico-ambiental-
y-de-superficies_pdf
 http://www.sanipes.gob.pe/normativas/8_RM_461_2007_SUPER
FICIES.pdf
 https://www.betelgeux.es/blog/2016/06/17/control-de-la-
contaminacion-ambiental-en-industrias-alimentarias-y-
farmaceuticas/
 https://www.betelgeux.es/noticias/&article_id=333