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CONTROLES ANALITICOS DE ALIMENTOS Y SUPERFICIES

PARAMETRO

VALOR OBTENIDO

Recuento
de
colonias
aerobias mesfilas

VALOR REFENCIA

1 x 10x ufc/gr

Enterobacterias

1 x 10x ufc/gr

Coliformes totales

1 x 10x ufc/gr

Escherichia coli

1 x 10 ufc/gr

Staphylococcus aureus

1 X 10 ufc/gr

Salmonella - Shigella

Ausencia/ 25gr

Mohos y Levaduras

1 x 10x ufc/gr

Bacillus cereus

1 x 10 ufc/gr

Listeria monocytogenes

1 X 10 ufc/gr

ANLISIS DE SUPERFICIE
PARAMETRO

VALOR OBTENIDO

VALOR REFENCIA

Control desinfeccin
(aerobios mesfilos)

0-10 ufc/ cm2

Control enterobacterias

0-1 ufc/ cm2

BIBLIOGRAFA
-

Enviromental sampling for the detection of microorganisms. Laboratory procedure MFLP41A. Health Protection Branch. Ottawa. Canad. Sep. 1992.

M del Rosario Pascual Anderson, Vicente Caldern Pascual. Microbiologa Analtica para
alimentos y bebidas. Ediciones Daz de Santos. 2 Edicin, 2000.

Manual Bsico de microbiologa Cultimed. Panreac Qumica S.A. 2 Edicin, 1998.

1

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RECOGIDA DE MUESTRAS EN ESTABLECIMIENTOS ALIMENTARIOS

1 OBJETIVOS
El objetivo de este protocolo es proporcionar, a las personas que vayan a realizar la recogida
de muestras en establecimientos alimentarios, las directrices que deben seguir para que esta
se realice en las condiciones higinico-sanitarias adecuadas y sean representativas del estado
higinico del establecimiento y de las condiciones de produccin.
2 MATERIAL NECESARIO
2.1.- Material estril
-

Bolsas de plstico con cierre hermtico

Envase estril 100 ml
Envase estril 1500 ml para toma de muestras de agua
Placas de contacto con el medio de cultivo: Agar biliado rojo violeta glucosa (Violet
Red Bile Glucose: VRBG)
Placas de contacto con el medio de cultivo: Agar nutritivo (Plate Count Agar: PCA)
Cuchillo, cuchara, etc

2.2.- Material no estril

-

Nevera porttil
Contenedores de hielo
Bata de algodn blanca
Gorro de para el pelo
Bolsas cubrezapatos
Guantes de latex
Mascarilla
Rotulador
Alcohol 70 % v.v.
Papel de un solo uso
Bolgrafo
Hojas de toma de muestras (2 hojas por empresa visitada)

3 PROCEDIMIENTO UTILIZADO:
3.1 Normas para el personal:
El personal que recoge las muestras puede actuar como vector en la transmisin de
microorganismos patgenos durante su estancia en el establecimiento, por lo tanto, es
importante que dicho personal tenga conocimientos de microbiologa y est instruido para ello.
Antes de desplazarse al lugar de recogida de muestras, la persona encargada deber:
-

Conocer la actividad productiva de la empresa que va a visitar

Determinar los peligros y zonas de muestreo
Tomar del laboratorio el material necesario para ello (ver apartado 2)

Si se va a visitar para la recogida de muestras varias industrias el mismo da, el vestuario ser
diferente para cada una, con el fin de evitar contaminacin cruzada.

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El vestuario se compondr bsicamente de:

-

Bata blanca
Gorro adecuados que cubran todo el pelo
Cubrezapatos de plstico

Se cumplirn las siguientes normas de higiene:

-

Empleo del vestuario antes indicado

Lavado las manos antes de la toma de muestra
Uso guantes
No comer ni beber en la zona de trabajo
No sonarse la nariz, toser o estornudar, cerca de los alimentos
No fumar en las reas alimentarias
No llevar joyas, ni perfumes fuertes
No podrn recoger las muestras aquellas personas que padezcan alguna enfermedad
infecciosa (respiratoria, drmica, gastrointestinal, etc) o sean portadores
asintomticos.

3.2 Toma de muestras de superficie

Fundamento:
El mtodo de toma de muestras de superficies empleado es el contacto de la superficie
elegida con un medio de cultivo especfico que permita el crecimiento de los microorganismos
deseados y comprobar as, el estado higienico-sanitario del establecimiento visitado y verificar
el correcto empleo de las tcnicas de limpieza y desinfeccin. Tambin se podr utilizar
torundas para esta recogida de muestras cultivando luego la muestra recogida por la torunda
humedecida en los medios de cultivo descritos.
Para la toma de muestras de superficies, se utilizarn placas de contacto con medio de cultivo
PCA (Plate Count Agar) VRBG (Violet Red Bile Glucose)
segn se quiera saber la
contaminacin por bacterias aerobias mesfilas (lo llamamos control desinfeccin) o
enterobacterias (lo llamamos control enterobacterias) respectivamente.
La composicin del medio de cultivo PCA (medio color tostado claro), basada en la peptona de
caseina como aportacin nutritiva, el extracto de levadura como sustrato vitamnico y la
glucosa como fuente energtica, favorece el crecimiento de la mayor parte de los
microorganismos, sin precisar de otros aditivos.
En el medio VRBG (medio de color rojo-violeta), las sales biliares y el cristal violeta que
forman parte del medio inhiben el crecimiento de la flora competitiva. Todas las
Enterobacteriaceae fermentan la glucosa con produccin de cido, lo que se pone de
manifiesto por un viraje al rojo y la precipitacin de las sales biliares alrededor de las colonias.
Las colonias de color rojo violeta rodeadas de un halo de precipitacin, tambin violeta, se
consideran Enterobacteriaceae.
Procedimiento:
Con los guantes puestos, se extrae la placa de contacto del blister en el que se encuentra, y
cerca de la superficie elegida, se quita la tapa y se deposita la placa por la parte del medio de
cultivo sobre la superficie, apretando un poco con la mano, para que entre bien en contacto
con el medio de cultivo. Tras un minuto aproximadamente, se vuelve a colocar la tapa sobre la
placa, se apunta en sta con el rotulador el nombre de la superficie y se guarda la placa en el
interior de una de las bolsas de plstico con cierre hermtico, se cierra y se guarda en la
nevera.

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Superficies de muestreo:
-

suelos, paredes y techos de las reas de produccin (salas de elaboracin, cmaras,

almacenes, muelles, etc)
Utensilios de trabajo: cuchillos, tablas de corte, espumaderas, etc
Maquinaria que interviene en el proceso productivo: picadoras, envasadoras, etc
Equipos de limpieza-desinfeccin: lavamanos, lavavajillas, desinfectadores, etc
Cualquier superficie con humedad, temperatura y nutrientes que permita el
crecimiento de microorganismos.

Nota:
Es importante cuando se tomen muestras de superficies
rugosas, apretar bien la placa sobre la superficie y aumentar el tiempo en contacto con sta.
3.3 Procedimiento de toma de muestras de alimentos
Para la toma de muestras del alimento, una vez seleccionado este, con guantes y mascarilla,
coger el utensilio estril adecuado, tomar aspticamente una muestra representativa del total
del alimento e introducirla en el envase o bolsa de plstico estril. Rotular con el nombre del
alimento y n lote (en su ausencia fecha de elaboracin, recepcin, sacrificio, despiece, etc).
3.4 Cumplimentacin de la hoja de toma de muestras
Una vez finalizada la toma de muestras, y fuera del rea de produccin, se proceder a la
cumplimentacin y firma por ambas partes (laboratorio y empresa) de dos hojas de toma de
muestras, quedando una hoja en poder de la empresa y la otra se llevar al laboratorio.
3.5 Transporte de muestras al laboratorio
El transporte de las muestras al laboratorio, se realizar siempre en el interior de la nevera
porttil, para que se mantengan refrigeradas, y se llevar lo ms rpido posible de vuelta al
laboratorio.

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RECEPCIN DE MUESTRAS EN EL LABORATORIO

1 OBJETIVO
El objetivo que se persigue con este protocolo, es que cualquier trabajador del laboratorio,
conozca los pasos que tiene que seguir en el momento que se reciba una muestra en el
laboratorio.
2 MATERIAL NECESARIO
-

Libro de registros
Rotulador
Bolgrafo
Frigorfico
Congelador
Ordenador con programa de procesado de textos

3 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA:
Paso 1.- Codificacin de las muestras
Cuando se reciben las muestras en laboratorio, se procede al registro y codificacin de las
mismas. Para ello, se toma el Libro de registros, y en la primera fila que est en blanco, se
inscribe una de las muestras recepcionada, destinando una fila completa a cada muestra. Para
cada muestra se rellenan todas las casillas que aparecen en la fila:
-

Fecha de entrada

Cdigo de la muestra: el cual est comprendido por 7 nmeros, de los cuales los 2
ltimos estan separados por una barra del resto, y corresponden a las dos ltimas
cifras del ao. De los cinco numeros que preceden a la barra, los 3 primeros son
correlativos al nmero de referencia de la muestra anterior, de modo que si los tres
primeros nmeros del cdigo anterior son 123, en esta muestra sern 124. Los 2
nmeros siguientes correspondern al mes del ao en que nos encontremos. As si
la muestra se recepciona en febrero de 2001, el cdigo completo de la muestra ser
12402/01.

En el caso de la recepcin de muestras de superficie, se intercalar una S entre el

tercer y cuarto nmero.

Procedencia. Direccin. Ciudad. Telfono

Tipo de muestra

Observaciones: esta casilla se destinar a poner el tipo de anlisis que se le va a

hacer a la muestra, fisico-qumico, microbiolgico, algn parmetro en concreto.

Las casillas nmero de informe y fecha de salida se rellenarn cuando se termine el

anlisis de la muestra y se elabore el informe. El N informe: ser el mismo que el
cdigo de la muestra, pero intercalando una I entre el tercer y cuarto numero.

En la hoja de toma de muestras se anotar el cdigo de la/s muestra/s que este/n detallada/s
en ella, y se guardar en la carpeta destinada a tal efecto.
En la bolsa o envase de plstico, si es una muestra de alimento, o en la tapa de placa de
contacto si es una muestra de superficie, con el rotulador, se pondr el n de referencia
asignado a la muestra/s.

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Paso 2.- Conservacin de las muestras hasta el anlisis

Una vez codificada la muestra se conservar en el frigorfico si se trata de una muestra
refrigerada, o en el congelador si se trata de una muestra congelada, hasta el momento del
anlisis, siendo ste tiempo de conservacin lo ms corto posible. En el caso de muestras
refrigeradas el tiempo de conservacin ser siempre inferior a 24 horas.
En el caso de las muestras de superficie, ver paso n 4.
Paso 3.- Elaboracin de las fichas de anlisis:
Mediante el ordenador se elaborar la Ficha de anlisis de cada muestra, con los siguientes
datos: n referencia de la muestra, fecha de entrada, tipo de muestra, fecha de salida,
parmetro investigado, valor obtenido, valor de referencia segn la legislacin vigente
correspondiente al alimento analizado, nombre de la reglamentacin seguida y casilla para la
firma del tcnico de laboratorio que realiza el anlisis y del director tcnico.
Ejemplo:
FICHA MUESTRA
FECHA ENTRADA:
FECHA SALIDA:

PARAMETRO

N REFERENCIA:
TIPO:

VALOR OBTENIDO

VALOR REFENCIA

Legislacin correspondiente vigente

Tcnico Laboratorio

Direccin Tcnica

Paso 4.- Procesado de las muestras de superficie:

Las placas de contacto correspondientes a las muestras de superficies, tras su registro y
codificacin, se introducen en la estufa de 37 C, incubando dichas placas durante 24 horas. Si
lo que se recepcionan son torundas stas se pasan por medios de cultivo y stos se introducen
en estufa igual que los descritos anteriormente
Transcurrido el tiempo de incubacin:
-

En las placas con el medio de cultivo Agar nutritivo PCA (Plata Count Agar): se
cuentan las colonias marcndolas con un rotulador para evitar que sean contadas de
nuevo. El nmero total de colonias contadas da como resultado el recuento total de
microorganismos mesfilos por cm2 de la muestra analizada.

En las placas con el medio de cultivo Agar biliado rojo violeta glucosa VRBG (Violet
Red Bile Glucose): se cuentan las colonias de color rojo violeta rodeadas de un halo
de precipitacin, tambin violeta, marcndolas con un rotulador para evitar que
sean contadas de nuevo. El nmero total de colonias caractersticas contadas da
como resultado el recuento total de enterobacterias por cm 2 de la muestra
analizada.
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PREPARACION DE MUESTRAS
1 OBJETIVO
Con esta tcnica se persigue una correcta homogeneizacin y representatividad de la muestra.
Es decir que la fraccin de alimento destinada al anlisis microbiolgico, sea representativa de
la totalidad de la misma y su posterior procesado permita su buena homogeneizacin.
2 MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO
-

Material estril (cuchillo, esptula, pinzas)

Probeta estril
Bolsas stomacher
Stomacher
Diluyentes: Agua de triptona, Solucin de Ringer , Agua de peptona tamponada
(segn determinaciones posteriores)
Pipetas estriles de 1ml con divisiones de 0.1 ml.

3 FUNDAMENTO DEL METODO

La caracterstica principal del diluyente, es que no produce modificaciones cualitativas ni
cuantitativas en la flora de los alimentos que van a ser analizados, es decir que la mantiene sin
suprimirla ni favorecer su desarrollo.
4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA
Paso 1.- Toma de muestra
La muestra analtica debe estar constituida, aproximadamente por 200 g de la misma. Para la
puesta en marcha de las distintas determinaciones se tomarn de 25 a 100 g de muestra,
dependiendo de la naturaleza de la misma. Lo que sobre, servir de reserva por si es necesaria
una repeticin.
El tamao de la muestra ser todo lo voluminosa que permita una buena trituracin y
homogeneizacin.
Si el alimento est integrado por distintos componentes, se tomarn fracciones representativas
de cada uno de ellos en superficie y profundidad.
La toma de muestra se har bajo condiciones estrictamente estriles, para lo que se utilizar
material previamente esterilizado en autoclave y cmara de flujo laminar. Esta operacin se
realizar siempre en las proximidades de la llama del mechero bunsen.
Paso 2.- Pesada de la muestra
-

Tarar el recipiente estril donde vaya a pesarse la muestra y posteriormente triturarse.

Introducir, asepticamente, una porcin adecuada y homogenea de la muestra en dicho
recipiente.
Pesar de nuevo para determinar el peso neto del alimento.
Con una probeta graduada estril, se aadir la cantidad de diluyente correspondiente
al peso neto de la muestra multiplicado por 9. De esta manera obtenemos una Dilucin
Madre de 1:10, a partir de la cual iremos preparando el resto de las diluciones.

Nota: si se sospecha una contaminacin alta del alimento a analizar, deberemos hacer
diluciones como mnimo de 10-5

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Paso 3.- Trituracin de la muestra

Durante el triturado es importante evitar la destruccin de los microorganismos por rotura de
su membrana o por un calentamiento excesivo.
Con esta etapa, se persigue obtener una mezcla homognea para lograr la distribucin
adecuada de los microorganismos y sus toxinas.
El procedimiento utilizado es el triturador de paletas o Stomacher, el cual acta golpeando
ritmicamente la mezcla de alimento y diluyente que ha sido introducida previamente en una
bolsa de plstico estril. Los choques producidos por las paletas dislacern el alimento y ponen
a las bacterias en suspensin.
Paso 4.- Preparacin de las diluciones decimales
La preparacin de las diluciones decimales a partir de una muestra tiene por objeto efectuar
diluciones progresivas de dicha muestra, para poder realizar recuentos microbianos
posteriores.
A un tubo que contenga 9 ml de diluyente se transfiere con pipeta estril 1ml de la suspensin
madre, obteniendo la dilucin 1/ 100. Se toma otra pipeta y de esta ltima dilucin se
transfiere otro ml a un tubo con otros 9 ml de diluyente, obteniendo la dilucin 1/1000. Es
importante mezclar bien la dilucin una vez preparada. Esta tcnica se repetir tantas veces
como n de diluciones se quieran preparar.
De esta forma se obtiene la serie de diluciones decimales que servir para iniciar las
determinaciones en las que sea necesario obtener recuentos. Los tubos de la serie, se
mantendrn en frigorfico hasta el comienzo del anlisis, el cual, an en condiciones de
refrigeracin, no deber demorarse ms de dos horas a partir del momento en el que se haya
preparado la serie de diluciones.

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RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS (31+/-1C)

1 OBJETIVOS
Se persigue la estimacin de la calidad sanitaria de los productos analizados indicando,
adems de las condiciones higinicas de la materia prima, la forma de manipulacin que
sufrieron durante su manipulacin.
En general, el recuento de la flora aerobio mesfila es una prueba para conocer las condiciones
de salubridad de algunos alimentos.
2 MATERIAL MEDIOS DE CULTIVO
-

Pipetas estriles de 1 ml, con divisiones de 0.1 ml.

Placas petri estriles de 90 mm de dimetro.
Estufa de incubacin, 30 +/ - 1 C
Agar nutritivo de recuento (Mtodos Estndar Agar, APHA)

3 FUNDAMENTO DEL METODO

La composicin del medio basada en la peptona de caseina como aportacin nutritiva, el
extracto de levadura como sustrato vitamnico y la glucosa como fuente energtica, favorece el
crecimiento de la mayor parte de los microorganismos, sin precisar de otros aditivos.
4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA: METODO DE RECUENTO EN PLACA
Se utiliza para determinar el nmero de microorganismos por gramo o mililitro del alimento en
estudio, partiendo de la serie de diluciones decimales, mediante el empleo de tcnicas en
placas de agar.
TECNICA:
Paso 1.- A partir de la serie de diluciones decimales y por duplicado, depositar con pipeta
estril, 1 ml de cada dilucin en otras tantas placas de Petri estriles de 90 mm de dimetro.
Paso 2.- Aadir a cada placa unos 15 ml de agar de APHA previamente licuado y atemperado
a 47 C.
El tiempo transcurrido entre depositar las distintas diluciones en la placa y el posterior vertido
del medio de cultivo sobre las mismas, no debe de exceder de 10 minutos. As mismo, el
tiempo total transcurrido entre la elaboracin de las diluciones decimales y el vertido del medio
sobre la ltima placa, no deber ser superior a 20 minutos.
Paso 3.- Mezclar perfectamente medio e inculo, lo cual se consigue moviendo la placa sobre
la superficie de la mesa en crculos y en forma de cruz, evitando que el medio llegue a
impregnar la tapa de la placa. Dejar solidificar el agar en las placas sobre una superficie
horizontal.
Una vez solidificado el agar, las placas se invierten y se introducen en la estufa de cultivo a una
T de 31 +/ - 1 C, durante 72 h.
Paso 4.- Transcurrido el tiempo de incubacin, se cuentan las colonias en aquellas placas que
muestren entre 30 y 300 colonias aisladas. Las colonias contadas sern marcadas con
rotulador, para evitar ser contadas de nuevo.
El nmero total de colonias contadas, multiplicado por el factor de dilucin de la placa elegida,
da como resultado el recuento total de microorganismos por gramo o ml de la muestra
analizada.
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INVESTIGACION Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIACEAE TOTALES EN

MEDIO SLIDO CON REVIVIFICACIN
1 OBJETIVOS
Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son grmenes de forma bacilar, gramnegativos,
aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados, mviles o inmviles, que fermentan la
glucosa, reducen nitratos a nitritos, son citocromo-oxidasa negativos y crecen en medios que
contienen sales biliares.
Las Enterobacteriaceae son indicadoras de contaminacin fecal, y su uso como ndice ha
adquirido gran aceptacin en Europa. Se utilizan preferentemente, para sealar la calidad
sanitaria de alimentos procesados. Su presencia a niveles altos en estos productos indica
elaboracin poco higinica, contaminacin posterior a su fabricacin o ambas cosas.
2 MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO
-

Pipetas estriles de 1 ml con divisiones de 0.1 ml.

Placas de Petri estriles de 90 mm de dimetro.
Estufa de incubacin a 37 +/ - 1 C
Asas de siembra
Caldo triptona-soja (Trytone Soy Broth: TSB)
Caldo EE de Mossel simple
Agar biliado rojo violeta glucosa (Violet Red Bile Glucose: VRBG)
Reactivo prueba citocromo-oxidasa: CO
Medio Kligler
Agar nutritivo (Plate Count Agar: PCA)

3.- FUNDAMENTO DEL METODO:

Caldo triptona-soja (TSB): Es un medio lquido de uso general para el cultivo de todo tipo de
microorganismos, incluidos los muy exigentes.
Se utiliza para lograr la revivificacin de las Enterobacteriaceae, as se incrementa su vitalidad
y adquiere las condiciones fisiolgicas adecuadas para su perfecto desarrollo.
Caldo EE de Mossel simple: Este medio tiene por objeto permitir el crecimiento de todas las
Enterobacteriaceae e inhibir el de otros microorganismos. Por la presencia de la Bilis de buey y
del verde brillante se inhibe la flora indeseable. A su vez la glucosa permite el crecimiento de
todas las Enterobacteriaceae, tanto lactosa + como lactosa -. La mezcla de fosfatos tampona el
medio y evita que por el efecto del descenso del pH se pudieran frenar los crecimientos.
Agar biliado rojo violeta glucosa: Las sales biliares y el cristal violeta que forman parte del
medio inhiben el crecimiento de la flora competitiva. Todas las Enterobacteriaceae fermentan la
glucosa con produccin de cido, lo que se pone de manifiesto por un viraje al rojo y la
precipitacin de las sales biliares alrededor de las colonias. Hay que tener en cuenta que esta
misma reaccin la dan en este medio las Aeromonas. Las colonias de color rojo violeta
rodeadas de un halo de precipitacin, tambin violeta, se consideran Enterobacteriaceae
Prueba de citocromo-oxidasa: prueba para la deteccin de la enzima citocromo-oxidasa. Las
Enterobacteriaceae son citocromo oxidasa negativas.
Hierro de Kligler, Agar: a travs de este medio se diferencian los bacilos entricos gram (-)
tanto por la capacidad de fermentar la lactosa y/o glucosa como por la de producir hidrgeno
sulfuro. La acidificacin del medio a causa del proceso fermentativo se pone de manifiesto con
un cambio de color del rojo de fenol que pasa de rojizo a amarillo.

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Los microorganismos que slo fermentan glucosa como Salmonella y Shigella, que se
encuentra en una concentracin 10 veces inferior a la lactosa, aunque aparece el color
amarillo, slo lo hace en la columna vertical del medio (base del tubo), mientras que en la
superficie inclinada se restablece el color rojo por oxidacin del cido. Cuando el color amarillo
obtenido en la acidificacin del medio, es producido por la fermentacin de la lactosa, es
persistente de manera que la superficie inclinada se mantiene amarilla. Los cultivos que
contienen microorganismos capaces de formar Hierro III Sulfuro, presentan el caracterstico
precipitado negro. La produccin de gas se observa por la aparicin de burbujas de aire e
incluso por rotura del propio gel.
4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA
Paso 1.- Preenriquecimiento en medio lquido no selectivo
En esta etapa se logra la revivificacin de las Enterobacteriaceae, se incrementa su vitalidad y
se adquieren las condiciones fisiolgicas adecuadas para su perfecto desarrollo.
Se pesan aspticamente, 10 gr de muestra y se aaden 90 ml de medio TSB, homogeneizar en
Stomacher y dejar a temperatura ambiente durante 2 horas, agitando de vez en cuando.
Paso 2.- Enriquecimiento en medio lquido selectivo
En esta etapa se estimula y favorece el crecimiento de las Enterobacteriaceae y se restringe la
proliferacin de la flora competitiva.
A partir del cultivo de preenriquecimiento (dilucin 1:10) se hacen diluciones al 1:100 y 1:
1000, utilizando como diluyente caldo TSB.
Se preparan 3 series de 3 tubos, conteniendo cada uno de ellos 10 ml de caldo de
enriquecimiento EE de Mossel simple.
A partir de las diluciones decimales, tomar 1ml de cada una de ellas, y aadirlo a los tubos con
10 ml de medio EE de Mossel simple. De esta manera tendremos una serie de 9 tubos
dispuestos de tres en tres en una gradilla, de manera que a los tres primeros le aadimos 1 ml
de la dilucin 1/10, a los tres segundos 1 ml de la 1/100 y a los tres ltimos 1ml de la
1/1000.
Agitar para mezclar e incubar todas las series a 37 C durante 24 horas.
Paso 3.- Identificacin de colonias tpicas en medio slido
A partir del medio lquido selectivo, agitndolo bien para mezclar bien el contenido de los tubos
que presenten crecimiento bacteriano, sembrar con asa sin recargarla demasiado, sobre
superficie bien seca del medio VRBG contenido en placas de Petri.
Incubar en estufa a 37 C todas las placas sembradas, durante 24 h.
Las colonias de color rojo violeta rodeadas de un halo de precipitacin, tambin violeta, se
consideran Enterobacteriaceae.
Paso 4.- Pruebas confirmativas
Se seleccionan, como mnimo, 2-3 colonias de cada placa VRBG donde aparezca un
crecimiento colonial caracterstico. Las colonias seleccionadas se siembran, individualmente en
agar PCA. Incubar a 37 C durante 24 h.
Partiendo de este medio de cultivo se realizan las siguientes pruebas confirmativas:

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Prueba de la citocromo-oxidasa:
Para la deteccin de esta enzima, se coloca un trozo de papel Whatman de unos 5 cm2 en una
placa de Petri vaca. En el centro del papel se depositan 3 gotas del reactivo. Con una pipeta
Pasteur con la punta cerrada, se toma una porcin del cultivo obtenido sobre agar nutritivo y
se extiende sobre el papel impregnado de reactivo, en una zona de 4-5 mm. En la reaccin
positiva aparece un color violeta oscuro en la extensin del cultivo.
Las Enterobacteriaceae son citocromo-oxidasa negativas.
Siembra de colonias en medio Kligler:
Tomar una colonia bien diferenciada de cada placa y sembrarla en picadura sobre el medio, de
manera que tambin se siembre el pico de flauta.
Todas las Enterobacteriaceae fermentan la glucosa, por lo tanto el crecimiento en medio Kligler
ser:
Superficie inclinada: roja / amarilla
Base: amarilla
Gas: +/H2 S: - / +
Lectura de resultados: Se calcula el nmero de Enterobacteriaceae totales por gramo o mililitro
de alimento consultando la Tabla del NMP de tres series de tres tubos, en los tubos que
muestren crecimiento en caldo EE de Mossel simple, los grmenes sean Citocromo-oxidasa
negativos y el crecimiento sobre agar Kligler corresponda al de las Enterobacteriaceae.

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INVESTIGACION Y RECUENTO DE ESCHERICHIA COLI

1 OBJETIVOS
La determinacin de E. coli en los alimentos, tiene como finalidad servir de ndice de
contaminacin fecal de los mismos.
E. coli es
Debido a
contrario,
alimentos

huesped constante del intestino del hombre y de los animales de sangre caliente.
su especificidad, es considerado un buen ndice de contaminacin fecal. Por el
vive poco tiempo en un ambiente extraentrico, por lo que su presencia en los
es indicativa de una contaminacin reciente.

Se destruye a temperatura de pasteurizacin y tambin durante su almacenamiento en fro,

sobre todo a temperatura de congelacin.
Su escasa resistencia hace que no sea un buen indicador de flora patgena, ya que en algunos
casos como la Salmonella, es mucho menos resistente a las condiciones ambientales y a la
accin del fro.
Pertenecen a la familia de las enterobacteriaceae y dentro de ellas al grupo de los coliformes
ya que son capaces de fermentar la lactosa en presencia de sales biliares con formacin de gas
y cido a T de 30 C y hasta ms de 44 C. Otra caracterstica bioqumica de E. coli, es su
capacidad para producir Indol en Agua de triptona incubada a 44.5C durante 48h.
2.- MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO
-

Pipetas estriles de 1 ml con divisiones de 0.1 ml.

Placas de Petri estriles de 90 mm de dimetro.
Estufa de incubacin de 44.5 +/ - 1 C
Asas de siembra
Tubos de ensayo
Campanas Durham
Agua de Triptona
Caldo Lactosado biliado verde brillante (BGBL)
Caldo EC
Agar de Levine (Eosina Azul de Metileno, Agar)
Bateria API
Reactivo de Kovacs
Medio Kliger

3.- FUNDAMENTO DEL METODO:

Caldo Lactosado Biliado Verde Brillante: el objetivo de este medio es el de poder inhibir el
crecimiento de los microorganismos distintos de los coliformes, al tiempo que stos puedan
crecer sin restriccin. Con la presencia de la Bilis de Buey y del Verde Brillante, se consigue la
inhibicin de casi la totalidad de los microorganismos gram-positivos y de los gram-negativos
distintos de los del grupo de los coliformes. Es importante conocer que la concentracin de
Verde Brillante es crtica para evitar el crecimiento de microorganismos anaerobios capaces de
fermentar la lactosa a 44 C, lo cual podra falsear los resultados.
Caldo EC: la presencia de sales biliares determina la inhibicin de las esporas y los
estreptococos fecales. La mezcla de fosfatos regula el pH del medio. La Triptosa es el elemento
nutritivo y el sodio cloruro aporta la salinidad necesaria para el buen crecimiento de los
grmenes. La Lactosa favorece el crecimiento de los coliformes, y su consumo se manifiesta
con la aparicin de gas en las campanas durham.

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Agar de Levine: la Eosina y el Azul de metileno, son productos que inhiben parcialmente el
crecimiento de microorganismos gram positivos, entre ellos los Estreptococos fecales. Adems
la combinacin de ambos componentes, permite la diferenciacin entre los microorganismos
lactosa positivos de los lactosa negativos. Los coliformes dan colonias violeta oscuro, con
centro ms oscuro. E. coli, presenta unas colonias muy caractersticas ya que van del prpura
al verde, con brillo metlico.
Hierro de Kliger, Agar: a travs de este medio se diferencian los bacilos entricos gram (-)
tanto por la capacidad de fermentar la lactosa y/o glucosa como por la de producir hidrgeno
sulfuro. La acidificacin del medio a causa del proceso fermentativo se pone de manifiesto con
un cambio de color del rojo de fenol que pasa de rojizo a amarillo.
Los microorganismos que slo fermentan glucosa como Salmonella y Shigella, que se
encuentra en una concentracin 10 veces inferior a la lactosa, aunque aparece el color
amarillo, slo lo hace en la columna vertical del medio (base del tubo), mientras que en la
superficie inclinada se restablece el color rojo por oxidacin del cido. Cuando el color amarillo
obtenido en la acidificacin del medio, es producido por la fermentacin de la lactosa, es
persistente de manera que la superficie inclinada se mantiene amarilla. Los cultivos que
contienen microorganismos capaces de formar Hierro III Sulfuro, presentan el caracterstico
precipitado negro. La produccin de gas se observa por la aparicin de burbujas de aire e
incluso por rotura del propio gel.
4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA: METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP)
Paso 1.- Siembra en medio BGBL
A partir de las diluciones decimales, tomar 1ml de cada una de ellas, y aadirlo en tubos con
10 ml de medio BGBL. De esta manera tendremos una serie de 9 tubos dispuestos de tres en
tres en una gradilla, de manera que a los tres primeros le aadimos 1 ml de la dilucin 1/10, a
los tres segundos 1 ml de la 1/100 y a los tres ltimos 1ml de la 1/1000. Comprobar que cada
uno de los tubos contiene una campana durham.
Incubar a 31 C durante 48 h.
Al cabo del tiempo de incubacin, comprobar la presencia de tubos positivos: turbidez del
medio con leve virage a amarillo y produccin de gas en la campana. Comprobar el NMP en las
tablas y anotarlo.
Paso 2.- Siembra en Caldo EC
De cada tubo positivo en BGBL, tomar 1ml y aadirlo en un tubo con 10 ml de Caldo EC y
campana.
Incubar a 45 C durante 24-48 h.
Los tubos positivos presentan turbidez y gas en la campana. Hacer recuento de los mismos,
comprobar el NMP y anotarlo.
Paso 3.- Siembra en Agar de Levine
Sembrar de cada tubo positivo en Caldo EC, dos placas con Agar de Levine. La siembra se har
con asa de platino procurando evitar el acmulo de colonias que no nos permita observar el
caracterstico color verde metlico de las mismas.

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Paso 4.- Confirmacin de las colonias

Prueba del Indol: de cada 1-2 colonias se siembran tubos con agua de triptona y se incuban en
bao mara durante 24 h a 44.5 C. Transcurrido este tiempo adicionan 0.5 ml de reactivo de
Kovacs y se observa la aparicin de un anillo rojo bermelln en la superficie del medio (prueba
positiva) o amarillento (prueba negativa).
Paso 5.- Recuento de colonias
Cuando coincide crecimiento positivo (gas) en caldo EC a 44.5 C, produccin de indol y
crecimiento caracterstico sobre Agar de Levine, se hace la lectura en la tabla de NMP para
obtener el n de E. coli por gramo o ml de muestra.
Paso 6.- Otras pruebas confirmativas:
Siembra de colonias en medio Kliger: tomar una colonia bien diferenciada de cada placa y
sembrarla en picadura sobre el medio, de manera que tambin se siembre el pico de flauta. E.
coli va a presentar las siguientes caractersticas:
Superficie inclinada: amarilla
Base: amarilla
Gas: +
H2 S: Siembra en bateria API: batera proporcionada comercialmente, en la que se encuentran varias
pruebas bioqumicas a modo de pocillos donde se realiza la siembra. Posteriormente los
resultados se leen en tablas que nos darn el nombre de la especie analizada.

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INVESTIGACION DE SALMONELLA
1 OBJETIVOS
Son las principales productoras de toxiinfecciones alimentarias y su presencia en los alimentos
puede ocasionar graves trastornos gastrointestinales en el hombre, que incluso le lleven a la
muerte. Los alimentos en los que pueden aparecer con mayor asiduidad son: carnes, sobre
todo picadas, productos de charcutera, huevos y ovoproductos, helados, cremas pasteleras,
moluscos, frutas.
La transmisin de la salmonelosis, se hace a partir de los alimentos de origen animal
contaminados, al hombre. Tambin es posible la transmisin directa de hombre a hombre y la
de portadores asintomticos a alimentos y posteriormente a hombre.
La infeccin se produce por la ingestin junto con los alimentos contaminados, de organismos
vivos. Esta contaminacin llega hasta el alimento a travs de manipulaciones higinicas
incorrectas que incluyen el no aseo de manos o utensilios que hayan estado en contacto con
heces de animales o humanos.
El gnero Salmonella, pertenece a la familia de las Enterobacteriaceae y est integrado por
microorganismos que forman colonias tpicas sobre medios selectivos slidos y poseen
caractersticas bioqumicas y serolgicas definidas. Tienen la morfologa de enterobacterias,
casi siempre mviles, gram (-), fermentan la glucosa con formacin de gas, pero no
fermentan la lactosa.
2.- MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO
-

Estufa de incubacin a 37 +/ - 1 C
Asas de siembra
Caldo TSB
Caldo Selenito Cistina
Agar Hektoen
Agar Salmonella-Shigella
Bateria API
Medio Kliger

3 FUNDAMENTO DEL METODO

3
Caldo selenito Cistina: el Sodio Hidrgeno Selenito inhibe el crecimiento de Coliformes y
Enterococos, por el contrario Salmonella, Proteus y Pseudomonas no son inhibidos. La cistina
acta como factor de crecimiento para la Salmonella. El efecto inhibidor del Selenito
desaparece a partir de la 18-24 h de incubacin y el crecimiento de la flora acompaante
puede dificultar el de Salmonella.
Agar Hektoen: por la presencia de los dos indicadores se diferencian los microorganismos
lactosa (+) de los (-). Las positivas toman un color amarillo anaranjado y las segundas un azul
verdoso. La presencia de sacarosa y salicilina evita la formacin de patgenos falsamente
positivos.Con el Sodio Tiosulfato y el Amonio Hierro III Citrato, se detectan los productores de
Hidrgeno Sulfuro por el precipitado negro de Hierro Sulfuro que presentan en el centro de las
colonias. La presencia de sales biliares inhibe el crecimiento de una gran parte de flora
acompaante. Las colonias de Salmonella presentan un color verde azulado con centro
negro o sin l.
Agar Salmonella-Shigella: por la presencia de las sales biliares, verde brillante y citrato, se
consigue la inhibicin de las bacterias gram (+). Por el mismo citrato conjuntamente con el
tiosulfato se frena notablemente el desarrollo de Coliformes y Proteus que podran acabar
cubriendo todo el cultivo.

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Las bacterias que no fermentan la lactosa dan colonias incoloras, mientras que las que
fermentan hacen virar el rojo neutro por la produccin de cido y quedan claramente
diferenciadas. Tambin se diferencian los microorganismos productores de Hidrgeno Sulfuro
que dan un precipitado negro de Hierro II Sulfuro, observndose en el centro de la colonia.
Las colonias de Salmonella son incoloras y con un punto negro en el centro.
4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA
Paso 1.- Preenriquecimiento en medio lquido no selectivo
En esta etapa se logra la revivificacin de las Salmonellas lesionadas, se incrementa su
vitalidad y se adquieren las condiciones fisiolgicas adecuadas para su perfecto desarrollo.
Se pesan asepticamente, 25 gr de muestra y se aaden 225 ml de medio TSB o de agua de
peptona, homogeneizar en Stomacher e incubar a 37 C durante 16 20 h, agitando de vez en
cuando.
Paso 2.- Enriquecimiento en medio lquido selectivo
En esta etapa se estimula y favorece el crecimiento de las Salmonella y se restringe la
proliferacin de la flora competitiva.
Agitar el cultivo de preenriquecimiento y aadir 10 ml del mismo a 100 ml de Caldo Selenito
Cistina. Incubar a 37 C durante 18 24h.
Paso 3.- Aislamiento diferencial sobre medio slido selectivo
En esta etapa se restringe an ms el crecimiento de la flora competitiva y se estimula el de la
Salmonella.
A partir del medio lquido selectivo, sembrar con asa sin recargarla demasiado, en 2 placas con
medio Hektoen y en 2 placas con medio Salmonella-Shigella. Incubar en estufa a 37 C todas
las placas sembradas, durante 24 48 h.
Paso 4.- Pruebas confirmativas
Se seleccionan, como mnimo, 2-3 colonias de cada placa donde aparezca un crecimiento
colonial caracterstico. Las colonias seleccionadas se siembran, individualmente en agar PCA.
Incubar a 37 C durante 24 h.
Siembra de colonias en medio Kliger: tomar una colonia bien diferenciada de cada placa y
sembrarla en picadura sobre el medio, de manera que tambin se siembre el pico de flauta.
Salmonella va a presentar las siguientes caractersticas:
Superficie inclinada: roja
Base: amarilla
Gas: +
H2 S: - / +
Siembra en bateria API: batera proporcionada comercialmente, en la que se encuentran varias
pruebas bioqumicas a modo de pocillos donde se realiza la siembra. Posteriormente los
resultados se leen en tablas que nos darn el nombre de la especie analizada.

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INVESTIGACION Y RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

1 OBJETIVOS
Es una especie muy sensible a la accin del calor y de los desinfectantes. Su presencia o la de
sus toxinas en los alimentos es signo evidente de falta de higiene. Estas toxinas, al ser
ingeridas por el hombre, pueden ser causa de intoxicacin. Son anaerobios facultativos.
En general un n elevado de S. Aureus en un alimento, refleja una higiene defectuosa por mala
manipulacin. Si adems los S.Aureus aislados son cepas enterotoxgenas, suponen un riesgo
para la salud.
Puede ocurrir que no se detecte S. Aureus en un alimento, pero si exista cantidad detectable
de su enterotoxina. En este caso los microorganismos han ido descendiendo en n e incluso
desapareciendo, mientras que la toxina por su mayor resistencia, pemanece en el alimento.
2 MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO
-

Tubos de ensayo
Pipetas de 1 ml estriles
Estufa de cultivo
Asa de siembra
Placas de Petri de 90 mm de dimetro
Caldo de enriquecimiento Giolitti Cantoni
Medio slido selectivo Baird Parker
Caldo cerebro corazn (BHI)
Agar desoxirribonucleasa (Agar Dnasa)

3 FUNDAMENTO DEL METODO

Caldo de enriquecimiento Giolitti Cantoni: la presencia de Manita, Sodio Piruvato y Glicina,
favorecen el crecimiento del S. Aureus. A su vez por la presencia del Litio Clururo se inhibe el
crecimiento de los microorganismos gram (-) y por la del Potasio Telurito y la Glicina, la de los
gram (+) a excepcin de S. Aureus y alguna especie de Micrococcus. Los dos extractos y la
triptona, aportan los elementos nutritivos y el Sodio Cloruro la salinidad adecuada.
Medio slido selectivo Baird-Parker: a este medio hay que aadirle Yema de huevo y Potasio
telurito. Tambin se puede aadir Sulfametacina para inhibir el crecimiento de Proteus. Por la
presencia del Litio Clururo y el Potasio Telurito, se inhibe el crecimiento de microorganismos no
deseados. Por la presencia del Sodio Piruvato y la Glicina, se favorece el crecimiento de los
Estafilococos. A su vez el Potasio Telurito combinado con la yema de huevo, permite diferenciar
los Estafilococos. El S. Aureus da colonias negras, por la reduccin del Potasio Telurito a Teluro,
rodeadas de un halo de transparencia debido a la actividad lecitinasa. Existe un paralelismo
importante entre los coagulasa (+) y la reaccin descrita con el Potasio Telurito y la Yema de
huevo; es por lo que estas caractersticas se utilizan como indicativo de esta actividad.
Caldo cerebro corazn (BHI): la peptona, infusin de cerebro de ternera e infusin de corazn
de res, son los nutrientes bsicos de este medio. La glucosa se emplea para la fermentacin y
el fosfato como tampn. Lo emplearemos como paso intermedio en la prueba de la Dnasa.
Agar desoxirribonucleasa (Agar DNasa): los microorganismos productores de Dnasa
despolimerizan al cido desoxirribonucleico que contiene el medio, dando lugar a unas zonas
de transparencia alrededor de las zonas sembradas, despues de inundar la placa con ac.
Clorhdrico 1 N. La acidificacin provova la precipitacin de ADN quedando el medio turbio,
excepto alrededor de las colonias DNasa (+).

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4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA
Paso 1.- Siembra sobre medio de enriquecimiento
Se parte de la suspensin madre del producto a analizar, sembrando, por duplicado, 1 ml de
dicha suspensin que contengan 19 ml de caldo Giolitti Cantoni. Cubrir la superficie con
parafina estril, para evitar el crecimiento de Micrococus. Incubar en estufa a 37 C durante 18
24 h. Se consideran positivos los tubos que presenten ennegrecimiento.
Paso 2.- Siembra en medio slido selectivo
De los tubos positivos, se resiembra 0.1 ml por diseminacin con asa de platino estril, sobre
placas con medio selectivo Baird-Parker. Incubar las placas en estufa a 37 C durante 48 h con
lectura a las 24h.
El aspecto de las colonias de S. Aureus sobre medio Baird Parker es el siguiente: redondas, de
bordes lisos, convexas, de 2-3 mm de dimetro, hmedas, brillantes, negras, con un borde
blanco fino, rodeadas de una zona opaca y de un halo claro de 2-5 mm.
El medio de cultivo es opaco debido a la adicin de la Yema de huevo. El S. Aureus elabora una
lipasa que, al actuar sobre la lipoprotena de la yema de huevo, produce un aclaramiento
alrededor de las colonias y una zona opaca como consecuencia de la formacin de un
precipitado de las sales de calcio y magnesio, insoluble en cidos grasos. Esta zona opaca se
hace visible a partir de las 24 horas de incubacin.
Paso 3.- Prueba de confirmacin:
termonucleasa (DNasa)

investigacin

de

la

desoxirribonucleasa

A partir de las colonias tpicas crecidas sobre medio Baird Parker, se siembra, es estras
radiales o en una sola estra, sobre la superficie de agar Dnasa. Se incuba a 37C durante 1824 h. Sobre el crecimiento se vierte ac. Clorhdrico 1N y se esperan unos minutos a que se
produzca una zona transparente alrededor de la zona de crecimiento.

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RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS

1 OBJETIVOS
Estudio de la presencia de mohos y levaduras que estn presentes en una muestra de
alimento.
De la amplia dispersin de los hongos en todos los estratos biticos e inertes se desprende su
fcil y frecuente aparicin como contaminantes en productos alimentarios, ya que stos,
constituidos por sustancias inorgnicas y orgnicas ms o menos complejas, constituyen
excelentes medios para la sustentacin y reproduccin de un gran nmero de especies
fngicas.
El significado de la contaminacin fngica de los alimentos, especialmente por mohos, viene no
solo del potencial de los hongos para deteriorarlos, sino tambin del potencial de muchos de
ellos para producir una gran variedad de micotoxinas a las que el hombre tiene susceptibilidad,
as como su capacidad para provocar infecciones e incluso, reacciones alrgicas en personas
hipersensibles a antgenos fngicos.
Existe un riesgo potencial en la contaminacin fngica de los alimentos y, por ello, para
conocer la calidad microbiolgica de diversos productos, se procede a la evaluacin de su tasa
de contaminacin por mohos y levaduras.
En cuanto a su significado para la salud del consumidor, la accin de las levaduras es
meramente infectiva, mientras que el mayor problema originado por los mohos se refiere a su
gran capacidad de elaboracin de micotoxinas. No obstante, ciertos mohos pueden ser tanto
agentes de micosis como responsables de intoxicaciones.
2 MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO
-

Material estril
Etanol 96% v/v
Bolsas stomacher
Stomacher
Pipetas estriles de 1ml con divisiones de 0.1 ml.
Diluyentes: Agua de triptona, Solucin de Ringer , Agua de peptona tamponada
(segn determinaciones posteriores)
Agar Saboreaud

3 FUNDAMENTO DEL METODO

Agar Sabouraud: la peptona es la fuente nitrogenada para el crecimiento de hongos y
levaduras, el carbonato es la fuente energtica. El crecimiento selectivo de los medios que no
contienen antibitico, depende exclusivamente del pH cido de estos medios.
4 PROCEDIMIENTO DE REFERENCIA: METODO DE RECUENTO EN PLACA
Se utiliza para determinar el nmero de microorganismos por gramo o mililitro del alimento en
estudio, partiendo de la serie de diluciones decimales, mediante el empleo de tcnicas en
placas de agar Sabouraud.
TECNICA:
Paso 1.- A partir de la serie de diluciones decimales y por duplicado, depositar con pipeta
estril, 1 ml de cada dilucin en otras tantas placas de Petri estriles de 90 mm de dimetro.
Paso 2.- Aadir a cada placa unos 15 ml de agar Sabouraud previamente licuado y
atemperado a 47 C.

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El tiempo transcurrido entre depositar las distintas diluciones en la placa y el posterior vertido
del medio de cultivo sobre las mismas, no debe de exceder de 10 minutos. As mismo, el
tiempo total transcurrido entre la elaboracin de las diluciones decimales y el vertido del medio
sobre la ltima placa, no deber ser superior a 20 minutos.
Paso 3.- Mezclar perfectamente medio e inculo, lo cual se consigue moviendo la placa sobre
la superficie de la mesa en crculos y en forma de cruz, evitando que el medio llegue a
impregnar la tapa de la placa. Dejar solidificar el agar en las placas sobre una superficie
horizontal.
Una vez solidificado el agar, las placas se invierten y se introducen en la estufa de cultivo a una
t de 25C +/ - 1 C, durante 5 das, realizando un primer contage de colonias al
tercero (se hace para observar el crecimiento de micelios areos invasores)
Paso 4.- Transcurrido el tiempo de incubacin, se cuentan las colonias en aquellas placas que
muestren entre 0 y 50 colonias aisladas. Las colonias contadas sern marcadas con
rotulador, para evitar ser contadas de nuevo.
El nmero total de colonias contadas, multipilcado por el factor de dilucin de la placa elegida,
da como resultado el recuento total de mohos y/o levaduras por gramo o ml de la muestra
analizada.

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