Manual Biorreactores

Ing.
de
Biorreactores
MANUAL DE LABORATORIO
Rosa María Zavaleta Martínez

Ingeniería Bioquímica
Versión 2016_2do. SEMESTRE
MANUAL DE LABORATORIO Ing. de Biorreactores
ÍNDICE
Pág.
Introducción al Manual………………………………………………………. 3
Reglamento de los Laboratorios de Ing. Bioquímica…………………….. 4
1.-Análisis in silico……………………………………………………………. 6
2.-Conteo de células con la cámara de Neubauer……………………….. 8
3.-Determinación de biomasa por peso húmedo…………………………. 11
4.-Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano y……… 13

determinación de peso húmedo.
5.-Fermentación aerobia……………………………………………………... 15
6.-Fermentación anaerobia………………………………………………….. 17
7.-Determinación del efecto de la agitación sobre la viscosidad………… 19
de un cultivo microbiano.
8.-Uso del fermentador a escala laboratorio……………………………….. 22
9.-Caracterización cinética del proceso de muerte térmica de un………. 24

microorganismo.
10.-Métodos de esterilización……………………………………………….. 26
2
INTRODUCCIÓN AL MANUAL
El presente Manual de Laboratorio tiene como propósito el cumplimiento

del programa por competencias en lo que respecta a las horas de práctica en la
Asignatura de Ingeniería de Biorreactores.
En ésta asignatura, se revisan los inicios de la Biotecnología y su

aplicación a los procesos fermentativos que llevan a la obtención de productos
de interés industrial, desde productos alimenticios como yogur, quesos,
cerveza, vino, hasta antibióticos y vacunas. Se estudian los factores que
intervienen en el desarrollo de los microorganismos, que son la parte central
del proceso fermentativo, se revisan y analizan los diferentes tipos de
biorreactores y procesos productivos, los fenómenos de transporte aplicados a
los mismos, los métodos de esterilización de medios y equipo y el escalamiento
del proceso fermentativo. Para lograr comprender el desarrollo de un proceso
fermentativo a escala laboratorio ó industrial, se requiere aplicar los
conocimientos adquiridos en asignaturas como: Química, Análisis Instrumental,
Microbiología, Bioquímica, Cinética química y biológica, Operaciones Unitarias,
Fenómenos de Transporte, entre otras.
Las Prácticas propuestas a continuación involucran al estudiante en el

conocimiento y cumplimiento del Reglamento de Laboratorio, se realiza una
práctica introductoria al análisis in silico, herramienta usada en la actualidad
para el estudio de las características geno y fenotípicas de los organismos, en
el presente manual se aborda para el caso específico de microorganismos de
interés biotecnológico. Se realizan diferentes prácticas para demostrar los
factores que afectan el crecimiento microbiano y el modo de obtener el
rendimiento de una fermentación, a través de la cuantificación de biomasa y de
producto. Se hace uso del biorreactor a escala laboratorio como introducción a
los tipos de biorreactores. Otras prácticas tienen como propósito la
demostración de la influencia de algunas operaciones unitarias y su relación
con los fenómenos de transporte aplicados a un proceso dentro del biorreactor.
La esterilización, factor de suma importancia en el proceso fermentativo, se
revisa en las prácticas 9 y 10.
3
REGLAMENTO DE LABORATORIO
1. EL PRESENTE REGLAMENTO ES APLICABLE PARA LOS

LABORATORIOS DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA, SU OBSERVANCIA
ES OBLIGATORIA PARA TODAS LAS PERSONAS INVOLUCRADAS
EN LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO.
2. MANTENER LA CORDIALIDAD Y RESPETO ENTRE ALUMNOS,
DOCENTE Y TÉCNICOS DE LABORATORIO.
3. QUEDA PROHIBIDA LA ENTRADA A PERSONAS AJENAS AL
LABORATORIO DURANTE EL DESARROLLO DE CADA UNA DE LAS
PRÁCTICAS.
4. ES OBLIGATORIO USAR GAFETE CON FOTOGRAFÍA Y BATA
BLANCA DE ALGODÓN, ABOTONADA, LIMPIA, DE MANGA LARGA Y
EQUIPO DE SEGURIDAD SI ASI LO REQUIERE LA PRÁCTICA.
5. PROHIBIDO USAR ZAPATO ABIERTO Y CON TACÓN, FALDA,
PANTALÓN CORTO, ARETES, PULSERAS Y CUALQUIER OTRO
TIPO DE ACCESORIO PERSONAL.
6. PROHIBIDO UTILIZAR EL TELÉFONO CELULAR, TABLETA
ELECTRÓNICA, AUDÍFONOS Y CUALQUIER DISPOSITIVO
ELECTRÓNICO DURANTE LA PRÁCTICA.
7. QUEDA PROHIBIDO FUMAR E INGERIR ALIMENTOS.
8. PROHIBIDO JUGAR DENTRO DEL LABORATORIO.
9. EN CASO DE SINIESTRO RESPETAR EL PLAN DE CONTINGENCIA
Y OBEDECER LAS INDICACIONES DEL TÉCNICO DE
LABORATORIO.
10. EL EMPLEO Y USO DE MATERIALES DE LABORATORIO SÓLO
PODRÁ EFECTUARSE MEDIANTE LA ENTREGA DEL VALE
CORRESPONDIENTE (SOLICITARLO CON EL TÉCNICO).
11. ENTREGAR LIMPIO, SECO Y EN BUENAS CONDICIONES EL
MATERIAL AL TÉRMINO DE CADA PRÁCTICA.
12. CUALQUIER MUESTRA ALMACENADA EN LOS REFRIGERADORES
E INCUBADORAS Y CUARTO FRÍO DEBERÁN ESTAR
DEBIDAMENTE EMPAQUETADAS E IDENTIFICADAS CON NOMBRE
COMPLETO DEL ALUMNO, FECHA DE ENTRADA, TIPO DE
MUESTRA, NOMBRE DE LA ASIGNATURA, NOMBRE DEL
PROYECTO, NOMBRE DEL PROFESOR RESPONSABLE.
13. TODO RESIDUO TÓXICO PELIGROSO DEBERÁ SER CONFINADO
EN CONTENEDORES ESPECIALES, ETIQUETADOS Y CERRADOS
HERMÉTICAMENTE PARA SU DISPOSICIÓN FINAL.
14. ANTES DE DESECHAR LOS MEDIOS DE CULTIVO DEBERÁN
PROCEDER A SU INACTIVACIÓN.
4
15. EL TÉCNICO, DOCENTE Y ALUMNOS DEBEN ASISTIR

PUNTUALMENTE Y PERMANECER EN EL LABORATORIO DURANTE
EL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA.
16. DURANTE EL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA EL ALUMNO DEBERÁ
COLOCAR SUS ÚTILES FUERA DEL ÁREA DE TRABAJO Y
COLOCARLOS EN LOS ESPACIOS DESTINADOS.
17. EN CASO DE NO FINALIZAR LA PRÁCTICA, SE LE PODRÁ DAR
CONTINUIDAD SI HAY DISPONIBILIDAD DE HORARIO Y
REGISTRARSE EN BITÁCORA.
18. TODO PROYECTO DE RESIDENCIA O INVESTIGACIÓN DEBE
REALIZARSE BAJO SUPERVISIÓN DE SU ASESOR Y CON LA
AUTORIZACIÓN NECESARIA.
5
Práctica No. 1
“Análisis In silico”
FUNDAMENTO:
La metodología bioquímica para comprender un proceso biológico complejo,

consiste en el aislamiento y estudio in vitro de sus componentes individuales,
para después juntar las distintas partes con objeto de lograr una visión
coherente de la totalidad del proceso. Una de las principales fuentes de
inspiración sobre estos procesos moleculares es el propio archivo de la
información de la célula, su DNA. Sin embargo, el imponente tamaño de los
cromosomas celulares constituye un enorme desafío: ¿cómo se puede
encontrar y estudiar un gen determinado entre los 100,000 genes distribuidos
entre los miles de millones de pares de bases del genoma de un mamífero?
Las soluciones empezaron a vislumbrarse en la década de 1970.
Décadas de esfuerzos de miles de científicos, trabajando en genética,
bioquímica, biología celular y química física, dieron sus frutos en los
laboratorios de Paul Berg, Herbert Boyer y Stanley Cohen, que idearon
técnicas para la localización, el aislamiento, la preparación y el estudio de
pequeños segmentos de DNA, procedentes de cromosomas mucho mayores.
Las técnicas para la clonación del DNA han abierto oportunidades antes
inimaginables para la identificación y el estudio de los genes implicados en casi
cualquier proceso biológico conocido. Estos nuevos métodos están
transformando la investigación básica, la agricultura, la medicina, la ecología, la
medicina forense y muchos otros campos, a la vez que han planteado a la
sociedad desconcertantes alternativas y difíciles dilemas éticos.
En la presente práctica se trabajará con secuencias de DNA a nivel informático,
utilizando la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology
Information).
PROPÓSITO: Que el alumno(a) conozca y utilice algunas herramientas

informáticas para la búsqueda y análisis de una secuencia de nucleótidos,
como medio para la identificación microbiana.
MATERIALES
-Computadora con servicio de Internet
-Secuencia nucleotídica
PROCEDIMIENTO
1.-Ingresar a la página: ncbi.nlm.nih.gov/
6
2.-Ingrese el siguiente nombre de acceso Listeria monocytogenes en la

ventana de búsqueda, con la opción en el menú de la izquierda en Genome.
3.-Mostrará como resultado, toda la información genética disponible para éste
microorganismo. En específico, su genoma completo.
4.-Ir a la opción Representative y visualizar y anotar las características del

microorganismo (Tamaño del genoma, número de proteínas, número de
genes), además de las características generales (morfología, ambiente,
enfermedades que produce).
5.-Consultar el dendrograma (Diagrama en forma de árbol para representar la
jerarquía de categorías según el grado de similitud y características
compartidas, típico de la taxonomía biológica).
6.-Ir al número de referencia (RefSeq) en la opción Representative y accesar.
7.-Aplicar la opción FASTA. Se obtendrá nucleótido por nucleótido, la
secuencia del genoma completo del microorganismo.
8.-Ir a la opción Graphics y visualizar los genes del genoma.
9.-Regresar a la secuencia del genoma en formato FASTA y copiar un
fragmento del genoma.
10.-Ingresarlo en una nueva ventana y utilizar la herramienta BLAST. Se
obtendrá el análisis de las secuencias con mayor similitud a la secuencia
ingresada.
11.-Introducir ahora una secuencia inventada en la ventana de la herramienta
BLAST y observar el resultado.
12.-Repetir los pasos 2-10 pero utilizando el microorganismo de interés.
RESULTADOS
Crear un archivo de Word ó Power Point en el que vaya guardando las
pantallas de su análisis para posteriormente imprimirlas e incluir como
evidencia en su reporte de práctica.
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
7
Práctica No. 2
“Conteo de células utilizando la cámara de Neubauer”
FUNDAMENTO:
Para encontrar el número total de células en un cultivo, el conteo directo al

microscopio es el método de elección. El conteo directo algunas veces es
ventajoso debido a que se puede visualizar la morfología de las células
estudiadas, una morfología inusual ó aberrante podría indicar condiciones
inadecuadas de crecimiento ó la presencia de un genotipo ó fenotipo celular
alterado.
Una desventaja de éste procedimiento, es que no distingue células vivas de

muertas, sin embargo, resulta una valiosa herramienta de trabajo para realizar
el conteo celular por su simplicidad y rapidez.
PROPÓSITO: Que el alumno(a) aprenda a utilizar la cámara de Neubauer y a

preparar diluciones microbianas a determinada concentración a partir de su
conteo celular.
MATERIALES Y MÉTODO:
A).-Materiales a utilizar:
-cámara de Neubauer
-cubreobjetos
-pipeta Pasteur
-pizeta con agua destilada
-2 tubos de ensayo de 18 x 150mm
-1 pipeta graduada de 10ml
-1 pipeta graduada de 1ml
-microscopio
-calculadora
-cámara digital
-cultivo celular de 24h de la levadura Saccharomyces cerevisiae (overnight
culture)
B).-Método
1.-Sembrar en un matraz Erlenmeyer de 25ml conteniendo caldo dextrosa
Sabouraud una colonia fresca de Saccharomyces cerevisiae, dejarlo en
incubación toda la noche a 30C.
8
2.-A partir de éste cultivo, tomar con la pipeta Pasteur un poco de muestra y
depositar en la cavidad central de la cámara, previamente cubierta por un
cubreobjetos.
3.-Permitir que por acción de la capilaridad se distribuya el medio líquido.
4.-Dejar reposar la muestra aproximadamente 10 minutos y observar al
microscopio.
5.-Ajustar la intensidad de luz de modo que las células y las líneas de la
cámara sean adecuadamente visibles. Deberá observar una imagen como la
siguiente:
Fig. 1 Vista de la cuadrícula de la región central de una cámara de Neubauer
6.-Dependiendo del número de células, puede contar todas las células del
cuadro central ó en los 5 cuadros indicados por una X dentro del cuadro
central.
7.-Cálculo del número de células.
El cuadro central tiene un volumen de 0.1mm 3. El número de células en el
cuadro central, multiplicado por 10, dará el número de células en 1mm 3 en el
cultivo. Ese número de células, multiplicado por 1000, nos dará el número de
células en 1cm3 ó 1ml de cultivo. Por lo tanto, si se cuenta por completo el
cuadro central, multiplicar ese número por 104 para obtener el número de
células por mililitro.
También puede contar sólo 5 cuadros dentro del cuadro central, en ese caso, el
número de células debe ser multiplicado por 5x10 4 para dar el número de
células por mililitro de cultivo.
Repetir la lectura por lo menos 3 veces para obtener un promedio.
8.-Ajuste del número de células en una dilución.

A partir del conteo obtenido (el promedio), realizar una dilución para ajustar el
número de células, de acuerdo a las instrucciones de su profesor.
9
RESULTADOS
-Anotar en una tabla los resultados de los conteos, incluyendo los cálculos del
promedio.
-Anotar las condiciones del experimento:
Medio de cultivo utilizado, cepa, temperatura de crecimiento.
-Realizar una investigación bibliográfica de las características de
Saccharomyces cerevisiae y su uso en biotecnología.
-Investigar y escribir el significado de los siguientes términos: fenotipo,
genotipo, capilaridad.
CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFÍA:
10
Práctica No. 3
Determinación de peso húmedo a partir de un cultivo bacteriano.
FUNDAMENTO:
Las células están compuestas fundamentalmente de macromoléculas y de

agua, y las macromoléculas se componen de unidades más pequeñas
denominadas monómeros. En esencia, la nutrición microbiana consiste en
suministrar a las células los ingredientes químicos que necesitan para sintetizar
monómeros. Estos compuestos químicos son los nutrientes. Diferentes
organismos necesitan diferentes tipos de nutrientes y a menudo los
requerimientos son específicos. Además no todos los nutrientes se requieren
en las mismas cantidades.
Un método práctico para conocer la cantidad de biomasa presente en un medio
de cultivo, es el de peso húmedo, en el que por diferencia de peso y una vez
centrifugado el cultivo, se obtiene la cantidad de biomasa formada (expresada
en gramos de biomasa por ml de medio).
PROPÓSITO: Que el alumno(a) observe la diferencia de crecimiento

bacteriano dependiendo de los nutrientes del medio de cultivo y cuantifique por
el método de peso húmedo el rendimiento de biomasa.
-tubos para centrífuga
-asa bacteriológica
-1 matraz Erlenmeyer de 250ml
-medio de cultivo (Luria Bertani)
-cepa de E. coli
B).-Metodología
1.-Preparar el medio de cultivo LB, completo y con modificaciones de acuerdo a
la Tabla 1, para observar los efectos de sustrato limitante.
2.-Inocular los 100ml de medio con una asada de la cepa crecida en agar.
3.-Incubar durante toda la noche a 37C.

4.-Centrifugar todo el contenido del matraz para obtener el rendimiento de
biomasa, para ello previamente pesar el tubo vacío y por diferencia de peso
obtener el rendimiento en gramos.
5.-Comparar sus resultados con los de cada equipo para elaborar una tabla ó
gráfica donde muestre los valores obtenidos.
11
Tabla 1 Distribución de nutrientes para cada matraz.
REACTIVO MATRAZ 1 MATRAZ 2 MATRAZ 3 MATRAZ 4

Peptona 1g 1g 0 1g
Extracto de 0.5g 0 0.5g 0.5g
levadura
Cloruro de 1g 1g 1g 0
sodio
Agua c.b.p. 100ml 100ml 100ml 100ml
RESULTADOS
- Graficar ó hacer una tabla con los resultados del punto 5 de la metodología.
-Responder las siguientes preguntas
a).-¿Cómo es el comportamiento del crecimiento microbiano con
respecto a la composición del medio de cultivo?
b).-¿En cuál de los 4 medios se obtuvo un mayor crecimiento
bacteriano?
CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFÍA:
12
Práctica No. 4
“Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento de un cultivo

microbiano.”
FUNDAMENTO:
Las células están compuestas fundamentalmente de macromoléculas y de

agua, y las macromoléculas se componen de unidades más pequeñas
denominadas monómeros. En esencia, la nutrición microbiana consiste en
suministrar a las células los ingredientes químicos que necesitan para sintetizar
monómeros. Estos compuestos químicos son los nutrientes. Diferentes
organismos necesitan diferentes tipos de nutrientes y a menudo los
requerimientos son específicos. Además no todos los nutrientes se requieren
en las mismas cantidades.
Un método práctico para conocer la cantidad de biomasa presente en un medio
de cultivo, es el de peso húmedo, en el que por diferencia de peso y una vez
centrifugado el cultivo, se obtiene la cantidad de biomasa formada (expresada
en gramos de biomasa por ml de medio).
-COMPLEMENTAR EL FUNDAMENTO INVESTIGANDO LA IMPORTANCIA
DEL CONTROL DEL pH Y LA TEMPERATURA EN UN CULTIVO
MICROBIANO.-
PROPÓSITO: Que el alumno(a) observe la diferencia en el crecimiento

microbiano dependiendo del valor de pH y temperatura y cuantifique sus
observaciones por el método de peso húmedo (rendimiento de biomasa).
-tubos (de 15ml) para centrífuga
-potenciómetro
-asa bacteriológica
-soluciones de HCl e NaOH para ajustar pH
-2 matraces Erlenmeyer de 50ml
-autoclave
-medio de cultivo (ICC) ó LB
-cepa de E. coli
-mechero Fisher
-caldo ICC
13
B).-Metodología
1.-Preparar 60ml de medio de cultivo ICC ó LB, de acuerdo a las instrucciones
del fabricante.
2.-En un matraz estéril conteniendo 20ml del medio de cultivo anterior sembrar
E. coli y dejar crecer toda la noche (cultivo overnight) a 37C con agitación
constante.
3.-A 20ml del medio preparado ajustar el pH según se indique (Tabla 1).
4.-Preparar otro matraz con 20ml del mismo medio.
5.-Esterilizar los 2 matraces con medio de cultivo.
6.-Inocular los 20ml de medio con 0.2ml de preinóculo overnight. Este paso se
hará para cada matraz.
Incubar durante toda la noche a 37C.

7.-Centrifugar todo el contenido del matraz para obtener el rendimiento de
biomasa, para ello previamente pesar el tubo vacío y por diferencia de peso
obtener el rendimiento en gramos.
8.-Comparar sus resultados con los de cada equipo para elaborar una gráfica
donde muestre la variación de los valores obtenidos.
Tabla 1
pH 5.0 6.0 7.0 8.0

Biomasa (g/ml)
TEMPERATURA Ambiente 37 45 55
Biomasa (g/ml)
RESULTADOS
- Graficar con los resultados del punto 7 de la metodología.
-Responder las siguientes preguntas:
a).-¿Cómo es el comportamiento del crecimiento microbiano con
respecto a la temperatura de incubación y a la variación de pH del medio de
cultivo?
b).-¿En cuál de los 8 matraces se obtuvo un mayor rendimiento de
biomasa?
CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFÍA:
14
Práctica No. 5
“Fermentación Aerobia”
FUNDAMENTO:
La fermentación alcohólica se define como el proceso bioquímico por el cual las

levaduras transforman los azúcares del mosto en etanol y CO 2. Para que la
fermentación se realice de manera eficiente, el mosto ha de hallarse en
condiciones anaerobias. En condiciones aerobias, las levaduras se multiplican
abundantemente con un rendimiento de biomasa muy alto, ya que se consigue
1g de levadura por cada 4g de azúcar consumidos. Los productos obtenidos
son: muy poco etanol, agua y CO2.
En condiciones anaerobias, las levaduras realizan la fermentación con un
rendimiento de 1g de levadura por cada 100g de azúcares consumidos.
Tanto levaduras como bacterias han sido utilizadas para la producción de
etanol. Saccharomyces cerevisiae es la levadura más comúnmente utilizada. El
etanol es inhibitorio a altas concentraciones y la tolerancia de las levaduras al
alcohol es crítica para obtener rendimientos altos.
PROPÓSITO: Que el alumno(a) observe y cuantifique el rendimiento de

biomasa en una fermentación realizada por la levadura Saccharomyces
cerevisiae en condiciones aerobias.
-1 matraz Erlenmeyer de 1000ml
-tubos para centrífuga
-centrífuga
-gasa
-liga
-incubadora a 37C
-probeta de 250ml
-refractómetro portátil
-levadura en polvo ó pasta
-sacarosa
-KH2PO4
-(NH4)2SO4
-MgSO4
-extracto de levadura
-peptona ó agua peptonada
-agua destilada
-soluciones de NaOH y HCl para ajustar pH
-potenciómetro
15
B).-Método
1.-Preparar el medio de cultivo (preparar 500ml) de acuerdo a la siguiente
tabla:
REACTIVO EQUIPO 1 EQUIPO 2 EQUIPO 3 EQUIPO 4

Sacarosa 130g 100g 75g 50g
KH2PO4 2g 2g 2g 2g
(NH4)2SO4 3g 3g 3g 3g
MgSO4 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g
Agua 7.5g 7.5g 7.5g 7.5g
peptonada
Extracto de 4.0g 4.0g 4.0g 4.0g
levadura
2.-Determinar los grados Bx del medio y ajustar el pH a un rango de 4.0-4.5.

Esterilizar el medio de cultivo.
3.-Inocular los 500ml de medio con 2g de levadura en polvo ó pasta. Tapar el
matraz con gasa y ponerle la liga. Dejar en incubación a 37C durante toda la
noche.
4.-Monitorear los grados brix y el pH del cultivo a las 24h de haber inoculado.
5.-Hacer una comparación de las lecturas obtenidas para cada matraz.
6.-Centrifugar 10ml del cultivo y determinar rendimiento de biomasa por peso
seco, para ello, desechar el sobrenadante del tubo y dejar secar la pastilla a
105C durante 2h (determinación de rendimiento de biomasa por peso seco).
RESULTADOS
Reportar los datos obtenidos según sus lecturas en los diferentes matraces y
discutir sus resultados.
a).-¿Cómo fue el rendimiento de biomasa con respecto a la cantidad de
sacarosa adicionada al medio?
b).-¿Qué resultado esperaría si la fermentación se hiciera en
condiciones anaerobias?
CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFÍA:
16
Práctica No. 6
“Fermentación Anaerobia”
FUNDAMENTO:
-Investigado por el (la) alumno (a).
PROPÓSITO: Que el alumno(a) observe y cuantifique el rendimiento de

biomasa en una fermentación realizada por la levadura Saccharomyces
cerevisiae en condiciones anaerobias.
-1 matraz kitasato de 1000ml
-probeta de 250ml
-refractómetro portátil
-levadura en polvo ó pasta
-sacarosa
-KH2PO4
-(NH4)2SO4
-MgSO4
-extracto de levadura
-peptona ó agua peptonada
-agua destilada
-soluciones de NaOH y HCl para ajustar pH
-potenciómetro
B).-Método
1.-Preparar el medio de cultivo (preparar 500ml) de acuerdo a la siguiente
tabla:
REACTIVO EQUIPO 1 EQUIPO 2 EQUIPO 3 EQUIPO 4

Sacarosa 130g 100g 75g 50g
KH2PO4 2g 2g 2g 2g
(NH4)2SO4 3g 3g 3g 3g
MgSO4 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g
Agua 7.5g 7.5g 7.5g 7.5g
peptonada
Extracto de 4.0g 4.0g 4.0g 4.0g
levadura
17
2.-Determinar los grados Bx del medio y ajustar el pH a un rango de 4.0-4.5.

Esterilizar el medio de cultivo.
3.-Inocular los 500ml de medio con 2g de levadura en polvo ó pasta. Tapar el
matraz con un tapón de hule y ajustar una manguera en la salida lateral del
matraz, la cual se introducirá en el líquido contenido en una botella de plástico
de 600ml (la botella contendrá 200ml de agua. Dejar en incubación a
temperatura ambiente durante toda la noche.
4.-Monitorear los grados brix y el pH del cultivo a las 24h de haber inoculado.
5.-Hacer una comparación de las lecturas obtenidas para cada matraz.
6.-Centrifugar 10ml del cultivo y determinar rendimiento de biomasa por peso
seco, para ello, desechar el sobrenadante del tubo y dejar secar la pastilla a
105C durante 2h (determinación de rendimiento de biomasa por peso seco).
RESULTADOS
Reportar los datos obtenidos según sus lecturas en los diferentes matraces y
discutir sus resultados.
a).-¿Qué cree que pasaría si el matraz tuviera un sello hermético y no
contara con una salida de gas?
b).-¿Qué cree que hubiera pasado si el pH del medio no se hubiera
ajustado?
CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFÍA
18
Práctica No. 7
“Determinación del efecto de la agitación sobre la viscosidad de un

cultivo microbiano.”
PROPÓSITO:
Encontrar la relación entre la agitación y la viscosidad de un cultivo microbiano

mediante el uso de un viscosímetro de Ostwald y la comparación de los valores
obtenidos.
FUNDAMENTO
La viscosidad es una de las propiedades más importantes en el estudio de los

fluidos y se pone de manifiesto cuando los fluidos están en movimiento. La
viscosidad de un fluido se define como su resistencia al corte. Se puede decir
que es equivalente a la fricción entre dos sólidos en movimiento relativo.
El método de Ostwald para medir viscosidades se fundamenta en que la

diferencia entre los niveles del líquido en ambas ramas del viscosímetro genera
una diferencia de presión, que es la que impulsa a que el líquido escurra. Esa
diferencia de presión y la geometría del capilar son las que determinan la
velocidad de escurrimiento del fluido; y por lo tanto, la pérdida de presión por
fricción que el fluido experimenta entre los extremos del capilar.
Si uno toma el tiempo que tarda el fluido en llegar de un enrase a otro, se

puede calcular su valor de viscosidad (). Como se usa un líquido patrón, se
relacionan los datos, y la  del líquido x(x) se determina con la ecuación:
x = tx p x / tp p
Donde x se refiere al líquido de viscosidad desconocida, p: sustancia patrón

que se usa, t: tiempo de escurrimiento,:  densidad, : viscosidad. Se hace
circular al líquido patrón primero, toma el tiempo y su densidad. Luego se deja
escurrir el líquido x, se toma el tiempo, y su densidad. Finalmente, se
reemplazan los datos y se obtiene el valor de x.
-Agregar fundamento de efecto de la agitación sobre la viscosidad.
Material y reactivos
 Viscosímetro de Ostwald
 1 vaso de precipitados de 1000 ml
19
 1 termómetro
 1 soporte universal
 1 perilla ó jeringa con manguera
 Agua
 2 matraces Erlenmeyer de 125ml con medio con crecimiento
microbiano.
 1 pipeta de 10ml
Procedimiento
El método consiste en medir el tiempo que tarda en fluir un volumen conocido

del líquido (el que está contenido entre las marcas A y B) a través de un
capilar, de longitud y radio conocidos, bajo la acción de la gravedad, ver Fig. 1.
 Acoplar el viscosímetro con una pinza de sujeción al soporte universal,

introduciendo el viscosímetro en un baño de agua. Acoplar el
termómetro para mantener control de temperatura.
 Se introduce una cantidad definida de líquido en el viscosímetro inmerso
y se le arrastra por succión al bulbo B, hasta que el nivel del líquido se
halle por encima de la marca A.
 En ese momento se permite que el líquido descienda de A-B.
 Se lava el viscosímetro y se repite la operación.
A
A
B
B
B
Fig. 1 Viscosímetro de Ostwald
20
 Anotar sus resultados. Hacer la lectura de tiempo para: el medio sin

inocular, medio inoculado e incubado sin agitación y medio inoculado e
incubado con agitación constante.
CÁLCULOS Y RESULTADOS
CONCLUSIONES
CUESTIONARIO
1.-¿Cómo varía el valor de la viscosidad en las muestras utilizadas y a qué

crees que se debe?
2.-Investiga qué otros dispositivos se utilizan para medir la viscosidad en un

biorreactor.
BIBLIOGRAFÍA
21
PRÁCTICA No. 8
Uso del fermentador a escala laboratorio.
FUNDAMENTO:
(Investigado por el alumno).
PROPÓSITO: Que el alumno(a) observe e identifique los elementos de un

biorreactor a escala laboratorio y haga un monitoreo de los parámetros en una
fermentación realizada por la levadura Saccharomyces cerevisiae en
condiciones aerobias.
-1matraz Erlenmeyer de 50ml, 1 de 500ml y 1 de 5L
-refractómetro
-mechero de alcohol
-balanza granataria
-potenciómetro
-fermentador
-medio de cultivo para Saccharomyces cerevisiae
-levadura fresca Saccharomyces cerevisiae
B).-Método
1.-Una vez preparado el medio de cultivo, separar 1 matraz con 30ml, 1 matraz
con 300ml y otro con 3L. Inocular con la levadura en la misma proporción que
para la práctica anterior el medio del matraz con 30ml, dejar incubando toda la
noche a 30C.
2.-Inocular el matraz que tiene 300ml de medio con los 30ml de la siembra del
día anterior. Dejar incubando toda la noche a 30C.
3.-Finalmente, inocular los 3L con los 300ml de la siembra del día anterior,
teniendo especial cuidado de lavar y desinfectar previamente el equipo.
4.-Hacer funcionar el fermentador a 30C y 150rpm

5.-Comenzar a monitorear cada 3h el cultivo y haciendo un total de 48h del
proceso, para ello tomar de 25-50ml de muestra y medir pH, temperatura,
número de células y consumo de sacarosa.
22
RESULTADOS
Reportar los datos obtenidos en una tabla según sus lecturas, incluyendo los
datos de los otros equipos.
Hacer una investigación sobre las partes que componen un fermentador a
escala laboratorio como el usado en esta práctica e incluir su diagrama y
generalidades en cuanto a funcionamiento.
CUESTIONARIO
a).-¿Qué variaciones importantes observas entre las medidas reportadas?
b).-¿Qué tiempo calculas que tardará en consumirse toda la fuente de carbono
en el fermentador y qué tiempo en matraz?
CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFÍA
23
Práctica No. 9
“Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)”
FUNDAMENTO:
La actividad antimicrobiana se mide determinando la cantidad más pequeña

que se necesita de un agente para inhibir el crecimiento de un organismo
control, valor llamado “concentración mínima inhibitoria”.
Para determinar la CMI, se prepara una serie de tubos de cultivo, cada uno
conteniendo un medio con una concentración diferente del agente, y después
se inocula la serie de tubos. Después de la incubación se observa si ha habido
crecimiento (turbidez) en los tubos. El tubo que contiene la menor
concentración de agente que inhibe completamente el crecimiento del
organismo usado como referencia, define la CMI.
Este procedimiento simple y eficaz se denomina técnica de dilución en tubo. La
CMI no es constante para un determinado agente, porque depende del tipo de
microorganismo utilizado, el tamaño del inóculo y las condiciones de
incubación, como la temperatura, el pH y la aireación. Cuando se estandarizan
rigurosamente todas las condiciones, es posible comparar diferentes
antimicrobianos y determinar cuál es el agente más eficaz frente a un
organismo o calcular la actividad de un único agente frente a diversos
organismos.
PROPÓSITO: Que el alumno(a) determine a partir de la técnica de dilución en

tubo, cuál es la CMI para el ácido ascórbico sobre un cultivo control de E. coli.
MATERIALES REACTIVOS
1 matraz Erlenmeyer de 250ml Peptona

1 probeta de 100ml Extracto de levadura
1 vaso de precipitados de 250ml NaCl
1 espátula Ácido ascórbico
1 pipeta de vidrio graduada de 10ml
1 jeringa con manguera
1 gradilla
1 mechero Fisher
1 asa bacteriológica
1 tubo Falcon de 15ml
11 tubos de ensayo de 18 x 150mm con tapón de rosca
PROCEDIMIENTO
24
1.-Preparar 100ml de caldo LB y distribuir en tubos de ensayo de acuerdo a la

Tabla 1.
2.-Preparar 5ml de ácido ascórbico al 10% como agente antimicrobiano en
agua destilada estéril.
3.-Esterilizar el medio de cultivo junto con 2 puntas para micropipeta.
4.-Preparar 1ml de inóculo de E. coli a partir de una siembra en caja.
5.-A cada tubo agregar en condiciones asépticas, 100l de inóculo bacteriano.

6.-Agregar la cantidad correspondiente de ácido ascórbico a cada tubo.
7.-Incubar todos los tubos a 35+-2C durante 24 horas.

8.-Observar la turbidez de los tubos para determinar la CMI.
TABLA 1. CANTIDAD DE ANTIMICROBIANO, MEDIO DE CULTIVO E

INÓCULO
No. Conc. de Dilución ml de ác. Cantidad

de ácido ascórbico de
tubo ascórbico al 10% + ml inóculo
(%) de caldo (l)
LB
1 0 - 0 + 10 100
2 0.1 1:100 0.1 + 9.9 100
3 0.25 1:40 0.25 + 9.75 100
4 0.30 1:33.33 0.30 + 9.70 100
5 0.35 1:28.57 0.35 + 9.65 100
6 0.40 1:25 0.40 + 9.60 100
7 0.45 1:22.22 0.45 + 9.55 100
8 0.50 1:20 0.50 + 9.50 100
9 0.55 1:18.18 0.55 + 9.45 100
10 0.60 1:16.66 0.60 + 9.40 100
RESULTADOS
Determinar cuál es la CMI de ácido ascórbico para las condiciones del
experimento.
Investigar cuál es el mecanismo de acción del ácido ascórbico cuando se utiliza
como agente antimicrobiano.
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
25
Práctica No.10
“Tiempo de reducción decimal (D)”
FUNDAMENTO:
Los métodos físicos de control antimicrobiano son usados en la industria,

medicina, y en el hogar para llevar a cabo la descontaminación microbiana,
desinfección y esterilización.
Quizá el método más ampliamente usado para el control del crecimiento
microbiano es el calor como método de esterilización. Los factores que afectan
la susceptibilidad de un organismo al calor, incluyen la temperatura y la
duración del tratamiento térmico, así como del tipo de calor: seco ó húmedo.
Todos los microorganismos tienen una temperatura máxima de crecimiento,
más allá de la cual se reduce su viabilidad. Los microorganismos pierden
viabilidad porque muchas macromoléculas pierden su estructura y función,
proceso llamado desnaturalización.
La efectividad de un tratamiento térmico cuando se usa como esterilizante, es
medida por el “tiempo de reducción decimal” ó “D”, que es el tiempo requerido
para reducir diez veces la viabilidad de una población microbiana a una
temperatura determinada.
PROPÓSITO: Que el alumno(a) observe el efecto de la esterilización por calor

en la viabilidad microbiana, a través de la determinación del valor D en una
muestra de alimento.
MATERIALES REACTIVOS
1 matraz Erlenmeyer de 500ml Agar para métodos estándar

1 probeta de 250ml muestra de alimento
1 vaso de precipitados de 250ml
1 espátula
11 cajas Petri
1 jeringa con manguera
10 pipetas de vidrio de 1ml
11 tubos de ensayo
Hot plate
1 mechero Fisher
1 termómetro
26
PROCEDIMIENTO
1.-Preparar 200ml de agar para métodos estándar en el matraz Erlenmeyer y

esterilizar junto con las cajas Petri y las pipetas.
2.-Una vez estéril, mantener el agar en baño María hasta su uso.
3.-Tomar 1ml de la muestra de alimento y depositar en una caja Petri estéril.
Agregar agar, homogeneizar la muestra y dejar gelificar.
4.-Calentar a 60C la muestra de alimento, durante 3 minutos, tomar 1ml y

depositar en una caja Petri estéril. Agregar agar, homogeneizar la muestra y
dejar gelificar.
5.-Repetir el paso 4 pero calentando la muestra durante 6 minutos. Tomar una
muestra cada 3 minutos, hasta completar 30 minutos de calentamiento.
6.-Incubar todas las cajas a 35-37C durante 24 horas y realizar el conteo de

UFC/ml de muestra.
RESULTADOS
Determinar el valor D, de acuerdo a la gráfica de log de células viables vs
tiempo de calentamiento.
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
27

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Ing.

Rosa María Zavaleta Martínez

Reglamento de los Laboratorios de Ing. Bioquímica…………………….. 4

2.-Conteo de células con la cámara de Neubauer……………………….. 8

3.-Determinación de biomasa por peso húmedo…………………………. 11

4.-Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano y……… 13

7.-Determinación del efecto de la agitación sobre la viscosidad………… 19

8.-Uso del fermentador a escala laboratorio……………………………….. 22

9.-Caracterización cinética del proceso de muerte térmica de un………. 24

El presente Manual de Laboratorio tiene como propósito el cumplimiento

En ésta asignatura, se revisan los inicios de la Biotecnología y su

Las Prácticas propuestas a continuación involucran al estudiante en el

1. EL PRESENTE REGLAMENTO ES APLICABLE PARA LOS

15. EL TÉCNICO, DOCENTE Y ALUMNOS DEBEN ASISTIR

La metodología bioquímica para comprender un proceso biológico complejo,

PROPÓSITO: Que el alumno(a) conozca y utilice algunas herramientas

1.-Ingresar a la página: ncbi.nlm.nih.gov/

2.-Ingrese el siguiente nombre de acceso Listeria monocytogenes en la

4.-Ir a la opción Representative y visualizar y anotar las características del

“Conteo de células utilizando la cámara de Neubauer”

Para encontrar el número total de células en un cultivo, el conteo directo al

Una desventaja de éste procedimiento, es que no distingue células vivas de

PROPÓSITO: Que el alumno(a) aprenda a utilizar la cámara de Neubauer y a

Fig. 1 Vista de la cuadrícula de la región central de una cámara de Neubauer

8.-Ajuste del número de células en una dilución.

Determinación de peso húmedo a partir de un cultivo bacteriano.

Las células están compuestas fundamentalmente de macromoléculas y de

PROPÓSITO: Que el alumno(a) observe la diferencia de crecimiento

3.-Incubar durante toda la noche a 37C.

Tabla 1 Distribución de nutrientes para cada matraz.

REACTIVO MATRAZ 1 MATRAZ 2 MATRAZ 3 MATRAZ 4

“Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento de un cultivo

Las células están compuestas fundamentalmente de macromoléculas y de

PROPÓSITO: Que el alumno(a) observe la diferencia en el crecimiento

Incubar durante toda la noche a 37C.

pH 5.0 6.0 7.0 8.0

La fermentación alcohólica se define como el proceso bioquímico por el cual las

PROPÓSITO: Que el alumno(a) observe y cuantifique el rendimiento de

REACTIVO EQUIPO 1 EQUIPO 2 EQUIPO 3 EQUIPO 4

2.-Determinar los grados Bx del medio y ajustar el pH a un rango de 4.0-4.5.

-Investigado por el (la) alumno (a).

PROPÓSITO: Que el alumno(a) observe y cuantifique el rendimiento de

REACTIVO EQUIPO 1 EQUIPO 2 EQUIPO 3 EQUIPO 4

2.-Determinar los grados Bx del medio y ajustar el pH a un rango de 4.0-4.5.

“Determinación del efecto de la agitación sobre la viscosidad de un

Encontrar la relación entre la agitación y la viscosidad de un cultivo microbiano

La viscosidad es una de las propiedades más importantes en el estudio de los

El método de Ostwald para medir viscosidades se fundamenta en que la

Si uno toma el tiempo que tarda el fluido en llegar de un enrase a otro, se

Donde x se refiere al líquido de viscosidad desconocida, p: sustancia patrón

-Agregar fundamento de efecto de la agitación sobre la viscosidad.

El método consiste en medir el tiempo que tarda en fluir un volumen conocido

 Acoplar el viscosímetro con una pinza de sujeción al soporte universal,

Fig. 1 Viscosímetro de Ostwald

 Anotar sus resultados. Hacer la lectura de tiempo para: el medio sin

1.-¿Cómo varía el valor de la viscosidad en las muestras utilizadas y a qué

2.-Investiga qué otros dispositivos se utilizan para medir la viscosidad en un

Uso del fermentador a escala laboratorio.

(Investigado por el alumno).

PROPÓSITO: Que el alumno(a) observe e identifique los elementos de un

4.-Hacer funcionar el fermentador a 30C y 150rpm

“Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)”