LABORATORIO CULTIVO DE BACTERIAS ENTEROPATÓGENAS

DEL SERVICIO DE
MICROBIOLOGIA AEROBIAS/MICROAERÓFILAS DE CRECIMIENTO RÁPIDO Y PNT-CO-01
HUVN ANTÍGENOS DE HELICOBACTER PYLORI Y SHIGATOXINA

PROCEDIMIENTO NORMALIZADO DE TRABAJO

CULTIVO DE BACTERIAS ENTEROPATÓGENAS

AEROBIAS/MICROAERÓFILAS DE CRECIMIENTO RÁPIDO, Y ANTÍGENOS
DE HELICOBACTER PYLORI Y SHIGATOXINA

Elaborado por Revisado por Aprobado por

Dra. Consuelo Miranda

Dr. José Gutiérrez Dr. José María Navarro
Casas
Fernández Marí
Director Técnico de
Director Técnico de Unidad Director del Laboratorio
Sección

EDICIÓN: 01 FECHA DE APROBACIÓN: 01/11//14 Página 1 de 11

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INDICE

1. Coprocultivo. Concepto…………………………………………………………3
1.1. Concepto
1.2. Microorgasnismos a investigar
2. Muestras para coprocultivos……………………………………………………3
2.1. Etiquetado.
2.2. Registro informático.
2.3. Muestras inaceptables.
2.4. Criterios de rechazo.
3. Procesamiento…………………………………………………………....................4
3.1. Examen directo.
a) Examen en fresco.
b) Tinción de Gram.
3.2. Siembra de las muestras.
4. Inoculación…………………………………………………………....................5
4.1. Examen rutinario. Medios de cultivo.
4.1.1. Placa de Agar Mac Conkey
4.1.2. Medios entéricos.
a) Moderadamente selectivos
b) Medio líquido
4.1.3. Medios para Campylobacter spp.
4.1.4. Medios para Yersinia spp.
4.1.5. Detección de Helicobacter y Toxina Shiga.
4.2. Cultivos especiales.
4.2.1. Vibrio spp.
4.2.2. Salmonella spp.
4.2.3. Escherichia coli.
4.2.4. Aeromonas mesofilas.
5. Interpretación……………………………………………………………………….8
5.1 Coprocultivo de rutina
5.2 Identificación
6. Resultados………………………………………………………………………10
6.1. Cultivos negativos.
6.2. Cultivos positivos.
6.2.1. Resultados positivos
6.2.2. Disbacteriosis
6.2.3. Detección de antígenos y toxinas.

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1. Coprocultivo. Concepto.

1.1. Concepto.

1.2. Microorganismos a investigar.

Salmonella spp.
Shigella spp.
Vibrio spp. * (petición expresa)
Yersinia enterocolitica
Campylobacter spp.
Aeromonas spp
Escherichia coli O157 (heces con sangre)

2. Muestras para coprocultivo.

Para la recogida, transporte y manipulación de muestras podrán tenerse en cuenta

los protocolos establecidos por la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y
Microbiología Clínica.
Se requiere una parte pequeña del tamaño de 1 cm3, o bien 1 ml aproximadamente
de heces diarreicas. Es necesario tomar la parte muco-purulenta, si ésta está presente, en
las heces del paciente. La muestra así tomada se depositará en un contenedor de boca
ancha, similar al utilizado para orinas.
En lactantes se pueden tomar las heces procedentes del pañal. No son aconsejables
los escobillones rectales.
La muestra se enviará al laboratorio tan pronto sea posible o se mantendrá en
frigorífico a 4 ºC, 5 ó 6 horas.
La muestra de elección para el cultivo de agentes bacterianos productores de
gastroenteritis es una porción de heces diarreicas, nunca heces formes.
A partir del cuarto día de hospitalización no debe realizarse coprocultivo para la
determinación de gérmenes enteropatógenos habituales salvo en situaciones especiales.
Las muestras de heces se procesarán para cultivo dentro de las 4-6 horas siguientes
a su emisión. Si esto no es posible, es conveniente su conservación en un medio de
transporte adecuado manteniéndose en refrigerador hasta su siembra.
Los escobillones rectales son aceptables sólo para cultivos de muestras de un niño
con diarrea aguda. Los escobillones deben mostrar heces.
No se recomienda el cultivo sistemático de meconio o heces de recién nacido para
diagnóstico de una infección neonatal.

2.1 Etiquetado.

Se procederá a etiquetar con un número y su código de barras tanto la muestra

como el volante de petición en los dos lugares preparados al efecto.

2.2 Registro informático.

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Pasará la muestra a la sección de procesamiento y el volante de petición a la

sección de registro informático, dónde se le dará entrada mediante su código.

2.3 Muestras inaceptables.

Los escobillones anales.

Muestras no conservadas de más de 4-6 horas.
Muestras conservadas cuyo indicador está virado indicando fallo del sistema
buffer.
Muestras múltiples del mismo día.

2.4 Criterios de rechazo.

No se admitirán muestras de heces que vengan derramadas en la bolsa contenedora

del recipiente, así como las que el volante no venga cumplimentado con los datos del
paciente y su ubicación o sin los datos del médico peticionario que impidan el envío
correcto de los resultados.

3. Procesamiento.

3.1 Examen directo.

El examen microscópico directo de las heces persigue la observación de

polimorfonucleares, que sugieren infección por un patógeno invasivo.

a) Examen en fresco: sólo en heces hemorrágicas y diarreicas.

b) Tinción de Gram: evaluación de purulencia y flora. Permite observar
polimorfonucleares y flora predominante.

3.2. Siembra de las muestras (Procesamiento).

Sembrar los medios de enriquecimiento líquidos.

Con un asa diseminar la muestra en cada una de las placas, procediendo a realizar
un buen aislamiento.
Placa de Agar Sangre: incubar en CO2, 35 º C. Sólo en Biopsia rectal.
Placa de Campylobacter: incubar en atmósfera con 10 % de C02 y 10 % de O2,
42 º C.24-48 h.
Resto de placas: 35 º C en aerobiosis.
Medios líquidos: Incubar en aerobiosis 6 horas a 35 º C, Dar pase al medio de
Hektoen, pasado este tiempo, e incubar en aerobiosis a 35 º C.

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4. Inoculación.

4.1. Examen rutinario. Medios de cultivo.

El coprocultivo se realiza mediante la preparación de una emulsión de 1-2 gr. de

heces en solución salina fisiológica, a partir de la cual se inoculan los medios de
cultivo.

4.1.1. Placa de Agar MacConkey.

En caso de disbacteriosis se informará el tipo de microorganismo. No es

recomendable la realización del antibiograma. Sugerir al clínico el uso
excesivo de antibióticos. Medio para diferenciar los bacilos entéricos
fermentadores de la lactosa (L+) de los no fermentadores (L-), al tiempo
que se inhibe el crecimiento de flora Gram positiva aerobia. En el caso de
la Biopsia intestinal se añade a la rutina una agar sangre para investigar
S. Aureus y una tinción de Gram para estudiar la calidad de la muestra.

4.1.2. Medios entéricos.

a) Moderadamente selectivos: Usar al menos uno de estos medios para

inhibir el crecimiento de la mayoría de las Enterobacteriaceae
mientras se permite el crecimiento de Salmonella spp y Shigella spp.
Medio Hektoen Agar (Lactosa, Tiosulfato, Citrato férrico-
amónico, Sales Biliares)
Medio XLD Agar (Xilosa. Lisina, Desoxicolato)
b) Medio líquido: Utilizar el medio Selenito F para suprimir el
crecimiento de la flora normal durante las horas iniciales de incubación.
Se resiembra en medio sólido a partir de las 6 horas. Este medio líquido
es fundamental para el estudio de portadores asintomáticos.
Caldo Selenito. (Enriquecimiento Salmonella spp).

4.1.3. Medios para Campylobacter spp.

Seleccionar uno de los siguientes medios selectivos e incubarlo 48-72 horas a

42ºC en ambiente microaerófilo. No se recomienda enriquecimiento. Poner un
disco de Cefoxitina de 30 mcg.

Campy-BAP (medio de Blaser)

4.1.4. Medios para Yersinia spp.

Mac-Conkey
Medio de CIN Agar (Cefsulodina, Irgasan, Novobiocina)

4.1.5. Detección de Helicobacter y Toxina Shiga.

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Helicobacter

MATERIAL
Atemperar las heces frescas o descongeladas.
Tubo de dilución de muestra y tarjeta de reacción, que se sacan 10 minutos antes
de la reacción.

PROCEDIMIENTO
Tomar una pequeña cantidad de heces con el tubo de dilución.
Agitar el tubo varias veces.
Abrir el sobre de la tarjeta de reacción.
Romper la punta del tubo de dilución y depositar 4 gotas en la primera zona de
la tarjeta.
Esperar 10 minutos e interpretar los resultados. Volver a leer a los 20 minutos y
confirmar si ahora es positivo.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Siempre debe aparecer la línea Roja de control.
Si además aparece la línea roja del test se informa.

Toxina Shiga

1. En un tubo Eppendorf, añadir:

a. 750µl de diluyente (tapón negro)
b. 1 gota del conjugado (tapón rojo)
c. 25µl de la muestra

2. Mezclar exhaustivamente hasta homogeneizar la mezcla.

3. Transferir 500µl en el pocillo nº 2.

4. Esperar 15 minutos.

5. Adicionar 300µl del wash buffer en el pocillo central y esperar que se absorba
completamente.

6. Añadir 2 gotas de substrato (tapón blanco)

7. Esperar 10 minutos para leer los resultados.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

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Toxina Shiga1 (+) Toxina Shiga1 (+) Toxina Shiga1(-) Toxina Shiga1(-)
Toxina Shiga2 (+) Toxina Shiga2 (-) Toxina Shiga2(+) Toxina Shiga2(-)

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4.2. Cultivos especiales.

4.2.1. Vibrio spp.

Sólo en los meses de verano.

Medios de enriquecimiento: agua de peptona alcalina a partir de las 6 horas,
subcultivar en TCBS.
Medio selectivo: TCBS Agar. (Tiosulfato, Citrato férrico, Bilis, Sacarosa).

4.2.2. Salmonella spp. y Shigella spp.

Medio XLD Agar (Xilosa, Lisina, Deoxicolato)

Medio Hektoen Agar (Lactosa, Tiosulfato, Citrato férrico-
amónico, Sales biliares).

Investigación de portadores de Salmonella: sólo se investiga en medio de

enriquecimiento , realizando la siembra en caldo selenito y tras pase a las 6 horas a
Hektoen y XLD, se investigarán las colonias típicas.

4.2.3. Escherichia coli.

Los procedimientos de aislamiento en heces de E. Coli, habitualmente quedan

fuera de la práctica rutinaria de la mayoría de los laboratorios. De las colonias no
fermentadoras del medio Mac-Conkey Sorbitol, pasar a Agar Sangre. Realizar una
suspensión en 1 ml de solución salina de tal manera que tenga una fuerte concentración
bacteriana, ha de quedar lechosa, y aglutinar con antisuero específico.
Empleamos una reacción de coaglutinación en látex con controles de suspensión
positivos y negativos así como control negativo de látex
Constituye una excepción la Escherichia coli 0157H7 por las posibles
complicaciones (síndrome hemolítico urémico), por lo que para esta cepa, por su
gravedad, podría estar indicado la utilización de medios especiales para su detección o
la investigación de toxinas fundamentalmente en heces hemorrágicas.

4.2.4. Aeromonas mesofilas.

Entre los medios utilizados para su detección está el medio de CIN-II (con sólo 4
μg/ml de Cefsulodina). La temperatura de incubación debe ser de 25-30º C.

5. Interpretación

5.1. Coprocultivo de rutina

Las placas se leen a las 18 horas. En caso de negatividad se reincuba la placa de

Campylobacter y los pases de Selenito y Peptona.
La identificación presuntiva de enteropatógenos se realiza sobre las colonias
desarrolladas con las siguientes características:
a) Salmonella spp: se desarrollan en Medio de Hk y XLD como colonias
negras o con punto negro central rodeada de halo blanco.

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b) Shigella spp: se desarrollan en medio XLD y Hk, como colonias crema,

claras, sin punto negro.
c) Yersinia enterocolitica: se desarrolla en medio de CIN como colonia
roja, pequeña. En Mac Conkey se asemeja a Enterococcus faecalis.
d) Campylobacter spp: se desarrolla en el medio Blaser como colonia
cremosa, pequeña, a menudo confluente, que presenta una reacción de
oxidasa positiva fuerte y que al Gram con Fucsina aparece como bacilos
pequeños Gram negativos.
e) Escherichia coli O157: aparece en el medio de Sorbitol como no
fermentadora, colonia grisácea, no roja, o de color claro. Estas colonias
han de aglutinar al anticuerpo especifico.
f) Vibrio spp.: Aparecen en medio TCBS como colonias amarillas,
mucosas, dando una reacción de oxidasa fuertemente positiva.
g) Aeromonas spp: En TCBS aparecen como colonias planas amarillentas.
En Mc. Conkey se asemejan a un E. Coli no fermentador. Dan una
reacción de oxidasa positiva clara.

5.2. Identificación

a) Identificación presuntiva de enterobacterias y definitiva de Campylobacter:

MALDI-TOFF
b) Identificación definitiva de enterobacterias: Micro-Scan que nos permite obtener la
identificación y antibiograma. Ciprofloxacino se ensaya con E-test.
c) Identificación serológica: las Salmonella spp. y Shigella spp, se han de serotipar. Para
ello, realizar una suspensión densa a partir de un cultivo en Agar Sangre y aglutinar con
sueros específicos somáticos.
Sueros de Salmonella spp.: Polivalente, A, B, C, D.
Shigella: Grupo A, B, C

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6. Resultados.

6.1. Cultivos negativos.

Se informará: “No desarrollo de bacterias enteropatógenas en coprocultivo de

rutina”.

6.2. Cultivos positivos.

6.2.1. Resultados positivos.

Se informará del aislamiento del agente patógeno (salmonela, shigela, yersinia,

aeromona, aquí con la observación 002) y se emitirá inicialmente el
antibiograma realizado para Ampicilia, Cefotaxima, Trimetoprim-
Sulfametoxazol y Ciptofloxacino (mediante el panel NC53 de microscan, y E-
test de ciprofloxacino para Salmonela). Las salmonelas se aglutinan.
En los aislados de Campylobcater se adelantan los resultados y se hace E-test en
MH sangre a 42ºC 24 horas de Eritro y Cripo. Se puede ampliar a Tetra,
Imipenem, Amoxicilina-Clavulánico y Tigeciclina. Para estos tres últimos no
hay puntos de corte.

6.2.2. Disbacteriosis.
Se informa escaso desarrollo bacteriano (observación EDB) en caso de no existir
crecimiento en la placa de Agar Mc Conkey

6.3. Detección de antígenos de Helicobacter y Toxina Shiga

Se informará como resultado positivo o negativo.

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CONTROL DE EDICIONES

Nº Edic/Fecha Descripción de modificaciones

Nº 01/ 01/11/2014 Creación

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