“Año del Buen Servicio al Ciudadano”

Universidad Nacional de Ingeniería

Facultad de Ingeniería Ambiental

PRACTICA N°03 Preparación-dilución de

muestras ambientales. Numeración de
microorganismos aerobios mesófilos viables.
 CURSO: MICROBIOLOGIA AMBIENTAL
 SECCIÓN: (Vi: 8-10 AM)
 PROFESOR: MARTIN MARTINEZ
 MIEMBROS CÓDIGOS
- Castro Vélez Joseph 20160630G
- Moreno Adrián Javier 20160326F
 ESPECIALIDAD: S3
 FECHA DE ENTREGA: 19/05/17
Índice
I. TITULO .........................................................................................3
II. OBJETIVOS: ..................................................................................3
III. FUNDAMENTO TEÓRICO:..........................................................3
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:............................................4
MATERIALES: ..................................................................................4
EQUIPOS ........................................................................................6
V. METODOLOGÍA............................................................................6
VI. RESULTADOS EXPERIMENTALES ...............................................7
VII. DISCUSIÓN ................................................................................8
VIII. CONCLUSIONES ........................................................................8
IX. RECOMENDACIONES ................................................................8
X. BIBLIOGRAFÍA ..............................................................................8
XI. ANEXOS ....................................................................................9
 I. TITULO
 Preparación-dilución de muestras ambientales. Numeración de
microorganismos aerobios mesófilos viables.

II. OBJETIVOS:
 Cultivar microorganismos presentes en una muestra.
 Contar las colonias de microorganismos que se desarrollen.
 Asegurar una óptima esterilización del medio de cultivo.
 Recontar las colonias superficiales con marcador.
 Desarrollar las técnicas usadas para poder cultivar.
 Probar la calidad del medio de cultivo compuesto anteriormente.

III. FUNDAMENTO TEÓRICO:

Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un
alimento, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta técnica no
pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el medio de
cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia de oxígeno, permiten
seleccionar grupos de bacterias cuya presencia es importante en diferentes
alimentos; por ejemplo, las bacterias mesofílicas aerobias, o mesófilos aerobios
son un indicador general de la población que pueden estar presente en una
muestra y, por lo tanto, de la higiene con que ha sido manejado el producto.
Este grupo en particular, se determina en la mayor parte de los alimentos, pero
para algunos productos, también es importante determinar la presencia de
bacterias termofílicas, psicrofílicas y/o psicrotróficas para predecir la estabilidad
del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento.
La técnica básica es la misma, pero cambian las condiciones de incubación,
medios de cultivo y algunos otros detalles, que se mencionan en la técnica. Si
se modifican las condiciones de incubación o se somete la muestra a algún
tratamiento previo, el método puede aplicarse también a la detección de otros
grupos como anaerobios o esporulados, desde luego, con la adecuada selección
de medios de cultivo.
El método permite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas
controlables, pero sujetas a la influencia de diversos factores por lo que es muy
importante apegarse a la técnica y controlar cuidadosamente las condiciones.
 La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o UFC
presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que
desarrolla en el medio de cultivo de elección después de un cierto tiempo de
incubación a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un
agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese microorganismo o
microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. Para que
las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones
decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo.

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

MATERIALES:

 Tijera: Herramienta usada para cortar pabilo y papel Kraft.

 Espátula de Drigalsky: Herramienta usada para esparcir la muestra sobre

el agar.

 Pipeta bacteridónea: Herramienta usada para trasladar pequeñas

cantidades de sustancia líquida.
 Diluyente (Agua peptonada 1°): Medio de enriquecimiento no selectivo.

 Alcohol 70°: Esterilizador.

 Algodón: Fibra estéril usada para limpiar instrumentos.

 Mechero: Proporciona la llama para calentar y mantener una parte del

ambiente estéril.

 Placas Petri: Materiales de vidrio en el que se cultiva la muestra y permite

la visibilidad de la misma.
 EQUIPOS

 Licuadora: Mezcla mediante centrifugación a la parte sólida con la parte

acuosa.

 Incubadora: Equipo que regula la temperatura y no permite la

contaminación de la muestra por factores externos.

V. METODOLOGÍA
Primero se diluyó 10gr de muestra de suelo con 90ml de agua peptonada (primera
dilución), esta mezcla se licuó con el equipo por 2 minutos. De la mezcla obtenida se
extrajo, con la pipeta, 1ml de de mezcla para mezclarse con 9ml de agua peptonada
obteniendo la segunda dilución. De la misma manera se efectuaron las siguientes
diluciones decimales hasta llegar a la quinta dilución. Luego de este proceso, se
sembrará las diluciones de muestra según dos métodos.

 Método N°01 (Recuento estándar en placa o recuento en placa por siembra en

profundidad o por incorporación-difusión).
 El método consistió en verter 1ml de cada dilución en 5 placas Petri con APC.
Esto en presencia de un mechero para evitar contaminantes. El APC se debió
haber incorporado en cada placa Petri en una cantidad de 15-18ml a 46°C y
luego se debió homogenizar por rotación. Para asegurar la esterilidad del medio
de cultivo, se usó dos placas, una solo con APC y la otra con APC junto con 1ml
de agua peptonada sin muestra. Las muestras se incubaron por 2 días en placas
invertidas a 35°C. Pasado ese tiempo se contó el número de colonias con un
marcador. Luego se guardaron en la refrigeradora en papel Kraft identificado.
 Método N°02 (Recuento en placa Petri por siembra-extensión en superficie o
diseminación).El método consistió en incorporar 0.1ml de muestra en cada placa
Petri previamente incorporada con APC. El proceso de incorporación de APC
consistió en verter 15-18ml de este a 46°C y homogenizarlo en la placa. La
siembra del inóculo consistió en esparcirlo con la espátula de Drigalsky cerca de
un mechero para evitar contaminantes. Para asegurar la esterilidad del medio
de cultivo, se usó dos placas, una solo con APC y la otra con APC junto con
0.1ml de agua peptonada sin muestra. Luego se incubaron las placas invertidas
por 72 horas. El recuento se hizo con marcador, solo se consideró a las colonias
superficiales en agar. Después del recuento se guardaron en una refrigeradora
con papel Kraft para identificarlo.

VI. RESULTADOS EXPERIMENTALES

 Para el primer método se observó que en la primera, segunda,
tercera y cuarta había un número incontable de colonias. En la
quinta dilución se contaron 135 colonias. Es decir 14 x 10-6 UFC.

 Para el segundo método se observó que en la primera, segunda,

tercera y cuarta había un número incontable de colonias. En la
quinta dilución se contaron 12 colonias. Es decir 12 x 10-6 UFC.
VII. DISCUSIÓN
 Aparición de bacilos en la placa de control de APC + AP del método 1, una
colonia.
 Aparición de levaduras en la placa de control APC del método 1, dos
colonias.
 Aparición de levaduras en la placa de control de APC + AP del método 2, dos
colonias.

VIII. CONCLUSIONES
 El laboratorio tiene una alta presencia de levaduras.
 Las técnicas de esterilización son eficaz si son seguidas de manera rigurosa.

IX. RECOMENDACIONES
 Se recomienda una limpieza microbiológica del aire del laboratorio.
 Mejorar la técnica de esparcimiento haciéndola en el menor tiempo posible.
 Hacer el recuento en los plazos establecidos para evitar el desarrollo excesivo y
hacer viable el recuento.

X. BIBLIOGRAFÍA
 Microbiología General-Schlegel-séptima edición-Año 1997-Ediciones Omega
S.A., Barcelona-España
 Guía de la Universidad Nacional del Nordeste/Facultad de
Agroindustrias/Carrera Farmacia/Microbiología General-Año 2006
 Guía del Laboratorio de Bacteriología y Micología-Dra. Natalia Iruzeta Cergneux-
Año 2011
 Guía de laboratorio/Unidad 2. Técnicas básicas de microbiología. Práctica 2.
Esterilización y preparación de medios de cultivo-UNAM
 Guía de laboratorio-Tema 02.- Cultivo de microorganismos-Universidad Pública
de Navarra-Año 2002
XI. ANEXOS

Placas identificadas según el método,

las de arriba con el método N°01 y las
de abajo con el método N°02

Siembra del inoculo con la espátula

Drigalsky

Datos tomados después de haber

incubado las muestras.