Facultad de Medicina / Escuela de Tecnología Médica

Aislamiento e identificación de Haemophilus influenzae

El Haemophilus influenzae es un cocobacilo Gram-negativo pleomórfico. Posee o

no un polisacárido específico, que permite clasificarlos en 6 serotipos antigénicos
encapsulados designados con letras, desde la “a” hasta la “f”. Las cepas
encapsuladas y no encapsuladas son potencialmente patógenas para el humano,
pero difieren en su virulencia y mecanismos patogénicos. El Haemophilus influenzae
serotipo b (Hib) es el patógeno más virulento, seguido del serotipo a (Hia) que afecta
principalmente niños menores de 5 años.

Materiales y equipos

• Cepas de Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus

• Discos con factores X y V
• Placas de agar tripticasa soya
• Hisopos con punta de algodón
• Placas de agar sangre de carnero
• Placas con agar chocolate
• Tubos con Caldo tripticasa soya x 2 mL

Procedimiento

• Aislamiento: Una vez recibida las muestras siembre la cepa de

Haemophilus en agar chocolate y agar sangre, siembre en forma
perpendicular la cepa de S. aureus en la placa de agar sangre. Incube a
37°C por 24 horas.
• Requerimiento de factor V y X: prepare una suspensión en caldo tripticasa
soya. Teniendo cuidado de no transferir medio al caldo. Remoje un hisopo
de algodón estéril en la suspensión y siembre por diseminación en una
placa de agar tripticasa soya, y colocar discos conteniendo factores V y X
a una distancia de 2 cm. Incube a 37°C por 24 horas
Resultados

• Revise las placas y observe las colonias en agar sangre (fenómeno de

satelitismo). En agar chocolate, H. influenzae aparece como colonias
opacas grandes, planas, de incoloras a grises. No hay hemólisis o
decoloración aparente del medio.
• Revise la placa con los discos de papel conteniendo factores X y V; H.
influenzae crecerá entre los dos discos.
• Tome una porción de las colonias y realice un extendido en láminas
portaobjetos; coloree por el método de Gram. Observe la presencia de
cocobacilos Gram negativos.

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Cuestionario
1. Explique el fenómeno de satelitismo
2. Cómo se realiza el antibiograma del Haemophilus influenzae qué discos se deben colocar?
3. Realizar el flujograma de identificación.
Referencias:
1. Ausina Ruíz, V. y Moreno Guillén, S. Tratado Seimc De Enfermedades
Infecciosas Y Microbiología Clínica. Buenos aires. Editorial Médica
Panamericana. 2006
2. Forbes, B.A., Sahm, D.F. y Weissfeld, A.S. Bailey Scott. Diagnóstico
Microbiológico. 11ª Ed. Buenos Aires. Editorial Médica Panamericana.
2004.
3. Instituto Nacional de Salud – Centro Nacional de Laboratorios de Salud
Pública. Manual de Procedimientos Laboratorios para la obtención y envío
de muestra (I). Serie de Normas Técnicas N° 4. Lima. 1997.
4. Koneman E.W., Allen S.D., Dowell S.R.Jr., Sommers H.M. Diagnóstico
Microbiológico, Texto Y Atlas Color. 6 ed. Buenos Aires: Ed. Panamericana;
2008.
5. Mac Faddin J. Pruebas Bioquímicas Para La Identificación De Bacterias De
Importancia Médica. 3 ed. Buenos Aires: Ed. Panamericana; 2003.

Aislamiento e identificación de Neisserias

La familia Neisseriaceae comprende los géneros Neisseria, Kingella, Eikenella,

Simonsiella y Alysiella . Las neisserias son cocos gramnegativos que por lo común
aparecen en pares (diplococos).
Neisseria gonorrhoeae (gonococo) y Neisseria meningitidis (meningococos) son
patógenos para el ser humano y suelen identificarse vinculados a los leucocitos
polimorfonucleares o en el interior de los mismos. Algunas neisserias son
residentes normales del sistema respiratorio humano, pocas veces en el peor de
los casos producen enfermedad y residen fuera de células. En el cuadro 20-1 se
enumeran los miembros del grupo.
Materiales y equipos

• Placas de agar chocolate y Thayer Martin Modificado

• Tubos con medio de Stuart o Amies
• Hisopos estériles
• Reactivo para oxidasa
• Reactivo catalasa
• Papel de filtro
• Láminas portaobjetos
• Batería para Gram

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• Cloruro de sodio
• Asa de siembra
• Jarra anaeróbica
• Vela
• Algodón

Procedimiento
• Tomar una muestra de secreción vaginal o uretral purulenta con un hisopo
estéril, colocar el hisopo en el medio de transporte. Con otro hisopo tomar
una segunda muestra y realizar un extendido en varias láminas portaobjetos
rotando el hisopo sobre la superficie de la lámina. Este material se llevará
al laboratorio para la práctica.
• Sacar el hisopo del medio de transporte y sembrar en una placa de agar
Thayer Martin modificado, trazando con el hisopo impregnado de la
secreción una "Z" a lo largo de la placa, luego con el asa de siembra proceda
a realizar estrías sobre el trazo realizado con el hisopo.
• Coloque la placa en una campana de vidrio, coloque también un trozo de
algodón humedecido, prenda una vela blanca pequeña dentro de la
campana, cierre esta y coloque en la estufa a 37°C por 24 horas.
• Hacer una coloración de Gram, observe la morfología, coloración y
disposición de las Neisserias.
Resultados

• Examine la placa de agar chocolate a las 24 horas.

• Si no hay desarrollo, retorne la placa inmediatamente a la campana de CO2
e incube 24 horas más.
• Si hay desarrollo observe el tipo, color y tamaño de las colonias.
• Recoger el desarrollo de cada cepa de la placa de agar chocolate en
aproximadamente 0.5 mL de suero fisiológico.
• Tome unas colonias y realizar un extendido, coloree con Gram y observe.
• Agregue una gota de reactivo de oxidasa sobre algunas de las colonias y
observar
• Agregue una gota de reactivo de catalasa sobre algunas de las colonias y
observar
Realizar la identificación
Cuestionario
1. Cite dos recomendaciones en la toma de muestra para el aislamiento de
Neisseria
2. Medios Selectivos para Neisseria
3. Realizar el Flujograma de la Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae
4 Cómo se realiza un antibiograma para estos patógenos?

Referencias

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1. Ausina Ruíz, V. y Moreno Guillén, S. Tratado Seimc De Enfermedades

Infecciosas Y Microbiología Clínica. Buenos aires. Editorial Médica
Panamericana. 2006
2. Forbes, B.A., Sahm, D.F. y Weissfeld, A.S. Bailey Scott. Diagnóstico
Microbiológico. 11ª Ed. Buenos Aires. Editorial Médica Panamericana.
2004.
3. Instituto Nacional de Salud – Centro Nacional de Laboratorios de Salud
Pública. Manual de Procedimientos Laboratorios para la obtención y envío
de muestra (I). Serie de Normas Técnicas N° 4. Lima. 1997.
4. Koneman E.W., Allen S.D., Dowell S.R.Jr., Sommers H.M. Diagnóstico
Microbiológico, Texto Y Atlas Color. Buenos Aires, Ed. Panamericana, 6ta
edición 2008.
5. Mac Faddin J. Pruebas Bioquímicas Para La Identificación De Bacterias De
Importancia Médica. 3 ed. Buenos Aires: Ed. Panamericana; 2003.