SOLUCIÓN CUESTIONARIO LABORATORIO 7

1. Qué es la coloración de gram

Es una técnica de laboratorio que se utiliza rutinariamente en los estudios
microbiológicos de las bacterias. Fue diseñada por Christian Gram, un científico
danés, en el año 1884. La técnica se basa en aplicar una serie de colorantes a
una muestra de cualquier origen (esputo, orina, pus, etcétera) que supuestamente
contenga bacterias no identificadas. Los colorantes tiñen la pared de las bacterias
de color morado y, tras unos minutos, se realiza un lavado del colorante. Después
de eso puede que el colorante permanezca en la pared bacteriana o que se haya
ido. En el primer caso permanecería el color morado, y se trataría de bacterias
Gram positivas y, en el segundo, la pared tendría un color rosado, y serían Gram
negativas.
2. Colorantes y funciones

 Cristal violeta: El violeta de metilo, comúnmente denominado cristal violeta

o violeta de genciana, es el nombre dado a un grupo de compuestos
químicos empleados como indicadores de pH y colorantes. Penetra en
todas las células bacterianas (tanto gram positivas como gram negativas) a
través de la pared bacteriana.
 Lugol: Es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro
de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales están presente para solubilizar el
yodo, y actúan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con
mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las
células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal
violeta.
 Alcohol acetona: Sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es
soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos gram positivos no se
decoloran, mientras que los gram negativos sí lo hacen.
 Safranina: Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de
manifiesto las bacterias gram negativas. Al término del protocolo, las gram
positivas se verán azul-violáceas y las gram negativas, se verán rosas (si
no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).

3. Procedimiento
 Recoger muestras para ubicarlas en el microscopio.
 Hacer el extendido con un palillo de madera.
  Dejar secar a temperatura ambiente y fijarlas utilizando un mechero.
 Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado tres
veces aproximadamente).
 Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar un
minuto.
 Enjuagar con agua no directamente sobre la muestra
 Agregar lugol y esperar un minuto aproximadamente.
 Agregar alcohol acetona y esperar entre 5 y 30 segundos según la
concentración del reactivo (parte crítica de la coloración). (las gram - se
decoloran, las gram + no)
 Enjuagar con agua.
 Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar un
minuto. Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias gram
negativas.
 Lavar levemente con agua.
Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de
inmersión. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana,
como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana,
considerándose bacterias grampositivas a las que se visualizan de color morado, y
bacterias gramnegativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.

4. Actuación de los colorantes en la pared y membrana celular

Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El
mismo microorganismo, si sufre daño de la pared por una u otra causa, se vuelve
gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape
del colorante. Según la distribución del peptidoglicano de la pared celular que las
envuelve, se tiñen de una forma u otra. Así, las bacterias que no se tiñen mediante
esta técnica se denominan Gram negativas. Están formadas por una pared más
fina formada por menos capas de peptidoglicano y una segunda membrana rica en
lípidos (que repele la tinción Gram), al microscopio aparecen incoloras.
Las Gram positivas tienen una pared celular mucho más gruesa, formada por un
gran número de capas de peptidoglicanos entre las que se inserta la tinción Gram,
dando un color violeta intenso al microscopio y se clasifican como Gram +.

5. Diferencias
 Gram negativas: Son aquellas que no se tiñen de azul oscuro o de violeta
por la tinción de Gram, y lo hacen de un color rosado tenue. Las bacterias
gramnegativas presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza
 una fina pared celular de peptidoglicano. Al ser la pared fina, no retiene el
colorante durante la tinción de Gram.

 Gram positivas: Son aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o

violeta por la tinción de Gram. Esta característica química está íntimamente
ligada a la estructura de la envoltura celular, por lo que refleja un tipo
natural de organización bacteriana. La envoltura celular de las bacterias
grampositivas comprende la membrana citoplasmática y una pared celular
compuesta por una gruesa capa de peptidoglucano, que rodea a la anterior.
La pared celular se une a la membrana citoplasmática mediante moléculas
de ácido lipoteicoico. La capa de peptidoglicano confiere una gran
resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante
la tinción de Gram. A diferencia de las bacterias grampositivas, las
gramnegativas presentan una segunda membrana lipídica externa a la
pared celular

Bacterias de
productos lácteos.
Colocar una gota de agua estéril
sobre el portaobjetos.
Añadir una gota de azul de
metileno a la muestra y dejar
actuar durante 3 minutos.
Lavar el exceso de
colorante y dejar secar.
CITOLOGÍA VII
Preparación de Coloración de gram
muestras
Con un hisopo, Con el asa, arrastrar En una lámina muy limpia
tomar una pequeña un poco de la colonia agregar 1 gota de solución
muestra de yogurt. de E.Coli, colocar en salina.
la lámina y dispersar.
Esparcir y dejar Agregar cristal violeta y
Fijar al calor.
evaporar flameando dejar actuar por 1 min.
la lámina. Luego, lavar con agua.
Cubrir con gotas de
Lugol por 1 min. Y
Fijar la muestra en el lavar.
microscopio y
observar hasta lograr Decolorar con alcohol-
un buen enfoque. acetona por 30 seg.
Lavar con agua.
Observar en:
Teñir con safranina por
4x, 10x,
1 min. Lavar con agua
20x, 40x y sin salpicar y secar.
100x.
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES

LABORATORIO PROCARIOTAS
CITOLOGIA VII

BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

CUBILLOS CASTELLANOS ELCY KATHERINE

23 DE OCTUBRE DE 2019

GRUPO 1 CIE-D