MORFOLOGIA BACTERIANA

COLORACIONES

Objetivos
 Conocer los pasos para la realización de una coloración.
 Interpretar la coloración de Gram con base a los componentes de la pared bacteriana.
 Identificar la morfología de las bacterias utilizando la coloración de Gram.
 Revisar otras coloraciones para visualizar estructuras bacterianas.

Técnicas para realizar una preparación

coloreada
Una preparación coloreada exige la sucesión de tres pasos: preparación del extendido,
fijación y coloración.

1. Preparación del extendido:

Debe utilizarse un portaobjetos limpio y desengrasado.
Si el cultivo proviene de un medio líquido, se transfiere con asa una gota del mismo y se
extiende hasta formar una fina película que cubra el centro del portaobjetos.

Si el cultivo proviene de un medio sólido, se procede así de la siguiente manera:

• Con pipeta o asa se coloca una gota de agua en el centro del portaobjetos
• Se quema el exceso de cultivo que queda en el asa, se deja enfriar y luego se extiende la
suspensión bacteriana hasta formar una fina película sobre el portaobjetos sin tocar los
bordes. Esperar hasta que el líquido se evapore o bien acelerar el proceso acercando el
portaobjteto al aire caliente de la llama del mechero.
2. Fijación
Este segundo paso se efectúa para que los microorganismos queden adheridos al vidrio y no
se desprendan del portaobjetos con los lavados a los que hay que someterlos posteriormente.
La fijación coagula las sustancias proteicas de las células, lo cual hace que los
microorganismos queden pegados al portaobjetos. Con este procedimiento no mueren todas
las bacterias. Existen dos tipos de fijación: con calor (o método de Koch) y fijación química.
Método Koch
El procedimiento ideado por Koch consiste en pasar lentamente el preparado por la llama del
mechero 3 veces seguidas, con la precaución de llevar el extendido hacia arriba. El
inconveniente de este método es que los microorganismos pueden deformarse demasiado si
el calentamiento resulta excesivo. Después del procedimiento, el portaobjetos debe notarse
caliente pero no debe quemar cuando se coloca en la parte posterior de la mano.

Fijación química
La coagulación del protoplasma microbiano con sustancias químicas es lo ideal pues las
células no resultan deformadas. Existen varios métodos:

- Se inunda el preparado con alcohol metílico, se deja actuar 3 minutos y se lava con agua.
Es el más usado.

- Igual procedimiento pero con formalina al 5 % (v/v).

- Se inunda el extendido con licor de Hoffman (partes iguales de etanol absoluto y éter -
sulfúrico) y se deja actuar hasta su evaporación completa.
3. Coloración

En este paso se hacen actuar sobre el preparado ya fijado las soluciones de colorantes de
acuerdo al método de tinción que se realice.

TIPOS DE TINCIONES

Para la observación microscópica existen diferentes tipos de coloraciones según las

características morfológicas o estructuras que quieran ponerse de manifiesto. Se clasifican
en simples y compuestas.

TINCIÓN SIMPLE

Se entiende por tinción (o coloración) simple al teñido de los microorganismos aplicando

sólo una solución colorante. Este tipo de tinciones pueden ser positivas o negativas.

La coloración positiva es la tinción de los microorganismos, efectuada con colorantes

básicos que poseen afinidad por los constituyentes celulares y se combinan químicamente
con el citoplasma microbiano. Técnica: La coloración consiste en cubrir el frotis, después de
fijado, con la solución colorante y se deja actuar el tiempo preciso. Luego se lava con agua y
se deja secar.

• Con fucsina básica: se diluye 1/10 la solución de uso (fucsina fenicada de Ziehl) y se deja
actuar 30 a 60 segundos.

• Con violeta de genciana: se diluye al 1/10 la solución de uso y se deja actuar 30 a 60

segundos.

• Con azul de metileno: se cubre el preparado con la solución de uso (azul de metileno
alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos.

El azul de metileno es el colorante más débil de los tres, razón por la cual se usa más
concentrado y se deja actuar durante más tiempo. También a la solución de azul de metileno
de uso se le agrega un álcali (KOH) como intensificante, que actúa haciendo más rápida e
intensa la reacción de coloración. Generalmente como intensificante se usa un álcali para un
colorante básico y un ácido para un colorante ácido. Debido a que el protoplasma bacteriano
tiene una débil carga negativa que aumenta al aumentar el pH, se explica que en medios
alcalinos las coloraciones de bacterias se hagan más intensas.

En la coloración negativa los microorganismos quedan sin teñir y se colorea el medio que
los rodea. Por lo tanto, lo que se ve es el perfil de las células.
La sustancia usada para la tinción negativa es un colorante opaco que no tiene afinidad por
los constituyentes celulares y que simplemente rodea a las células, tal como:

• Tinta china (suspensión de partículas de Carbono coloidal demasiado grandes como para
penetrar en la bacteria)
• Colorantes ácidos (no poseen afinidad por los constituyentes celulares). El más utilizado es
la nigrosina dado que ofrece un mayor contraste por ser negro.

La coloración negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de los

microorganismos en microscopía óptica, pero su máxima utilidad está en revelar estructuras
como cápsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos
refringentes y espiroquetas que, por su pequeño diámetro transversal, resulta difícil ponerlas
en evidencia. Técnica: Método de Burri (con tinta china o nigrosina). Se coloca en un extremo
del
portaobjetos una gota de tinta china o nigrosina y otra de la suspensión microbiana y se
mezclan bien con el asa. Luego, con otro porta se apoya sobre la mezcla y se hace un
extendido a lo largo del porta. Con este procedimiento el espesor del frotis va disminuyendo
a medida que se extiende, con lo cual se conseguirá una zona donde el contraste sea el
adecuado. Se deja secar bien y se observa con el objetivo de inmersión.

Video coloración Tinta China

TINCIÓN COMPUESTA (O DIFERENCIAL)

Aunque existen múltiples tipos de tinciones, aquí vamos a referirnos a los dos métodos de
coloración compuesta más comúnmente empleados en la práctica corriente del laboratorio de
microbiología: la tinción de Gram y la de Ziehl-Neelsen. Estas coloraciones permiten
diferenciar las bacterias incluso cuando tienen igual forma y tamaño, por esta razón es una
“tinción diferencial”.

Coloración de Gram

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio

bacteriológico y con el que deben estar perfectamente familiarizados. Su utilidad práctica es
indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las
referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos) se basan
justamente en la tinción de GRAM descripta en forma breve, la secuencia de la tinción es la
siguiente: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se
cubre con solución Yodada de Lugol (mordiente) durante 1 min y se lava de nuevo con agua,
decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de
contraste) durante 20 seg. Lavar y secar.

Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló
en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en
dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los términos positivo y negativo no
tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfologicos
distintos de bacterias).
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve
para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material
de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula
gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano así
como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva
es peptidoglicano. La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa
mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior
compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de
la célula gram-negativa es peptidoglicano.

Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales

de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con algún detalle la tinción
de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqué de su
funcionamiento.

Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal
violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el
exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las grampositivas como las
gramnegativas, están teñidas de azul.

El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente

activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y
forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células
grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación.

e lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-

acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta.
Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo
hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a
la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de
bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la
membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana citoplásmica
a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el
de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Las células grampositivas, a causa
de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son
permeables al disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra los poros,
disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el de complejo cristal
violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las
células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras.

Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después
de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas, mientras que las
grampositivas permanecen azules.

Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tinción de Gram:

1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por sí
solo tiene poca afinidad con las células.

2) La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las células
grampositivas. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del
tiempo para obtener resultados satisfactorios.

3) Cultivos más viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal
violeta - yodo.

Ver el Video de Coloracion de Gram.

COLORACION DE ZIELH NEELSEN

Las paredes celulares de ciertas bacterias y parásitos contienen ácidos grasos tipo ácidos
micólicos de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de
resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por
esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M.
leprae y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades
de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento
para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

Se ha desarrollado una coloración de ácido-alcohol resistencia modificada que diferencia las

especies de Nocardia (bacilos grampositivos ramificados filamentosas cuyas paredes
celulares contienen ácidos-grasos de unos 50 átomos de carbono), de los Actinomyces (muy
semejantes pero no ácido-alcohol resistentes). Nocardia spp son decoloradas por la mezcla
ácido-alcohol estándar pero no por un tratamiento más suave con ácido sulfúrico 0,5 a 1%.
Estos microorganismos se denominan ácido-alcohol resistentes parciales o débiles.

El frotis se tiñe durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave. Lavar con agua.
Decolorar con alcohol etílico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teñir durante 30-
60 seg con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar

Video Coloracion de Zielh Neelsen

RETROALIMENTACIÓN: Observe microorganismos Acido Alcohol Resistentes:
1. Mycobacterium tuberculosis

2. Nocardia asteroides

3. Cryptosporidium parvum

4. Mycobacterium leprae