Capítulo 1 - Análisis de La Oxidación de Lípidos y Proteínas en Grasas, Aceites y Alimentos

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Capítulo 1
Análisis de lípidos y proteínas

Oxidación en grasas, aceites y alimentos
KM Schaich
Departamento de Ciencias de los Alimentos, Universidad de Rutgers, New Brunswick, Nueva Jersey, EE. UU.
1.1 INTRODUCCIÓN
Durante casi 20 años de la era baja en grasas o sin grasas, la oxidación de lípidos fue esencialmente
olvidado como problema de estabilidad. Ahora, la era de las grasas saludables se centra en la reforma
mulación de alimentos con ácidos grasos altamente insaturados (poliinsaturados) (PUFA).
Los PUFA son esenciales: no pueden ser sintetizados por humanos y son
necesarios para muchos procesos fisiológicos, pero también son extremadamente sensibles a
oxidación y puede degradar muy rápidamente la calidad, función y nutrición de los alimentos al
producción de sabores y olores extraños, pérdida de ácidos grasos esenciales y co-oxidación
de proteínas y vitaminas. Por lo tanto, la necesidad de un seguimiento preciso y sensible
de la oxidación de lípidos ha pasado una vez más a la vanguardia en los análisis de alimentos y
control de calidad.
Un libro publicado por la Sociedad Estadounidense de Químicos del Aceite, Oxidación de lípidos:
Desafíos en los sistemas alimentarios ( Logan et al., 2013), abordó cuestiones que plantean
obstáculos para comprender, analizar y estabilizar la oxidación de lípidos.
El libro actual avanza hacia los problemas prácticos relacionados con los lípidos.
oxidación en los alimentos. El capítulo 2 del libro anterior presenta una serie de con-
desafíos conceptuales y prácticos para analizar la oxidación de lípidos (Schaich, 2013b ).
Se remite a los lectores a ese capítulo porque proporciona una base crítica para esta
capítulo, que avanza para considerar opciones en el análisis de la oxidación de lípidos.
Decidir cómo medir la oxidación de lípidos y sus co-oxidaciones asociadas
es mucho más complicado que simplemente seleccionar un ensayo de una lista o seguir
procedimientos de métodos estandarizados. El ensayo seleccionado debe coincidir con el
istría de la oxidación de lípidos, la información necesaria y el equipo y el tiempo
disponible. Algunas preguntas clave que deben considerarse incluyen:
● ¿Está midiendo continuamente a lo largo del tiempo, con poca frecuencia (semanal o mensual),
o solo una vez en muestras aisladas?
● ¿Está más interesado en los productos de degradación temprana o secundaria, o
¿Necesita ambos para obtener una imagen más precisa?
Estabilidad oxidativa y vida útil de alimentos que contienen aceites y grasas

http://dx.doi.org/10.1016/B978-1-63067-056-6.00001-X 1
Copyright © 2016 AOCS Press. Publicado por Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
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2 Estabilidad oxidativa y vida útil de alimentos que contienen aceites y grasas
● ¿Necesita datos detallados para la investigación o simplemente marcadores que se correlacionen con
respuestas sensoriales o puntos de rechazo conocidos?
● ¿Qué tan rápido necesita la información?
● ¿Es probable que las co-oxidaciones redirijan los radicales de oxidación de lípidos y
productos a otras moléculas, particularmente proteínas, que luego también deben ser
monitoreado para determinar la oxidación del sistema?
La investigación sobre los mecanismos requiere un análisis de producto más detallado a lo largo de
ger periodos de tiempo desde la oxidación inicial hasta la prolongada, mientras que las estrategias para evaluar
Los efectos del procesamiento o de los antioxidantes sobre la estabilidad deben seguir a los cambios rápidamente.
y los análisis de control de calidad se realizan con mayor frecuencia como análisis aislados en
muestras con grado de oxidación desconocido.
Ahora agregue a estos problemas nueva información que indique que la vía de oxidación de lípidos
Las formas y la formación de productos de oxidación de lípidos pueden no seguir la secuencia.
que ha dictado la mayoría de los análisis de oxidación en uso actual (Schaich, 2005 ) pero
tienen adición, reordenamiento interno, escisión y otras reacciones que componen
pete con las conocidas abstracciones de hidrógeno. Investigación y alimentación industrial
Los laboratorios por igual se han encontrado con situaciones en las que la oxidación de lípidos estándar
se miden productos como hidroperóxidos o carbonilos, pero los resultados no
no se correlacionan con la pérdida de ácidos grasos, evaluaciones sensoriales o malos olores y amarillentos
ing en el producto. Además, los productos que se espera sean secundarios con frecuencia comienzan
formando al mismo tiempo que los dienos conjugados (CD) y los hidroperóxidos en lugar de
que después de la descomposición observable del hidroperóxido. Por lo tanto, las viejas "reglas" de cómo
medir la oxidación de lípidos no siempre proporcionan imágenes precisas de la oxidación de lípidos
ción. Lo más crítico es que a menudo subestiman los niveles de oxidación total y
resienten las vías activas.
Para abordar estos desafíos, este capítulo aboga por un nuevo paradigma en
análisis de la oxidación de lípidos. En lugar de centrarse en productos individuales, analítica
las estrategias deben avanzar hacia el análisis de múltiples clases de productos para detectar
todas las vías activas, para evitar perder algo de oxidación y para
evaluar el alcance y las vías de oxidación de los lípidos. El enfoque principal es el análisis
ses utilizados o susceptibles de ser aplicados en la industria alimentaria. Metodología altamente especializada
ods tales como resonancia paramagnética de electrones, resonancia magnética nuclear y
No se incluye la espectrometría de masas (MS) que requiere instrumentación costosa.
1.1.1 Procesos fundamentales de oxidación de lípidos
Durante más de 70 años, la oxidación de lípidos se ha considerado una cadena de radicales

reacción impulsada por abstracciones de hidrógeno. Los hidroperóxidos son el primer establo
producto y sus radicales de descomposición sirven como precursores para todos los
productos que se forman al final de las cadenas de oxidación (Figura 1.1). Muchos libros y
Las revisiones han presentado detalles de los procesos de iniciación, cinética y reacciones.
que conduce a productos secundarios ( Lundberg, 1961; Scott, 1965; Chan y Coxon ,
1987; Frankel, 2005b; Schaich, 2005). En el contexto del análisis de oxidación, un
La característica clave de la reacción en cadena es que hay una secuencia específica en
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Análisis del capítulo de oxidación de lípidos y proteínas | 1 3
MECANISMO CLÁSICO DE REACCIÓN EN CADENA DE RADICALES LIBRES DE OXIDACIÓN DE LÍPIDOS
Iniciación (formación de radicales libres lipídicos ab initio)
k yo •
L1H L1 (1)
Propagación
Reacción en cadena de radicales libres establecida
ko
•
L1 +O2 L 1 OO • (2)
kβ
k p1
L 1 OO +• L 2 H L 1 OOH + L2• (3)
•
k p1 •
L 2 OO +L3H L 2 OOH + L 3 etc. L n OOH (4)
Ramificación de cadenas de radicales libres (iniciación de nuevas cadenas)
k d1 •
L n OOH L n O + OH - (metales reductores) (5)
k d2 •
L n OOH L n OO + H + (metales oxidantes) (6)
k d3 • •
L n OOH L n O + OH (calor y uv) (7)
•
LnO L n OH (8a)
k p2
• •
L n OO +L4H L n OOH +L4 (8b)
•
k p1
HO HOH (8c)
k p3
• k p4 •
L 1 OO + L n OOH L 1 OOH + L n OO (9)
•
k p5 •
L1O + L n OOH L 1 OH + L n OO (10)
Terminación (formación de productos no radicales)
• • Recombinaciones radicales
Ln Ln (11a)
k t1
• •
LnO +LnO polímeros, productos monoméricos no radicales (11b)
k t2
(cetonas, éteres, alcanos, aldehídos, etc.)
• •
L n OO L n OO k t3 (11c)
Escisiones radicales
•
LAVABO k ts1 (12a)
productos no radicales
• (aldehídos, cetonas, alcoholes, alcanos, etc.)
LO k ts2 (12b)
i - iniciación; o-oxigenación; - Escisión de Oβ2 ; p-propagación; d-disociación; terminación en t;

ts – terminación / escisión
FIGURA 1.1 Reacción tradicional en cadena de radicales libres de oxidación de lípidos. DeSchaich (2005) ; usó
con permiso.
formación de productos: primero CD, luego hidroperóxidos y productos secundarios

Los productos sólo se desarrollan después de la descomposición del hidroperóxido. Los supuestos también tienen
Ha sido que la oxidación de lípidos es relativamente lenta, por lo que los productos solo necesitan ser monitoreados
semanal o mensual en estudios de vida útil. De hecho, la mayoría de las estrategias analíticas
ha sido diseñado para adaptarse a este escenario.
Sin embargo, los resultados experimentales tanto para la cinética como para los productos a menudo tienen
ha sido incompatible con el esquema de reacción tradicional. Intentos de encontrar explicaciones
identificaron una serie de reacciones de radicales peroxilo y alcoxilo que
pete con la abstracción de hidrógeno y tienen el potencial de complicar enormemente
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oxidación de lípidos. Estas reacciones alternativas se combinaron con las tradicionales

secuencia de abstracciones de hidrógeno para desarrollar un esquema de reacción integrado
que puede describir de forma más completa y precisa las complejas reacciones de los lípidos
oxidación, que se muestra en Figura 1.2 ( Schaich, 2005, 2012, 2013a ).
La existencia de vías alternas simultáneas tiene varias con-
secuencias que deben tenerse en cuenta al analizar la oxidación de lípidos. Los productos hacen
No espere hasta el final de la oxidación para formarse. Adición, reordenación y dismu-
Las reacciones de tation de radicales lípidos peroxilo (LOO • ) generan dímeros, epóxidos y
aldehídos desde el inicio de la oxidación en paralelo con hidroperóxidos, y
pueden desviar radicales de la formación de hidroperóxidos. De hecho, tenemos
epóxidos recientemente observados que se forman antes y en niveles más altos que los hidroperóxidos
ides en oxidación de linoleato de metilo ( Xie, 2015). Radicales lípidos alcoxilo, LO • , también
sufrir reacciones alternas de reordenamiento interno, escisión y adición en
competencia con la abstracción de hidrógeno, por lo que los aldehídos esperados no siempre son
regalo. Como consecuencia, midiendo solo los productos de escisión tradicionales
hexanal y decadienal pueden perder proporciones importantes de productos y significativamente
LH
E, 1 e - oxidación
Polímeros Dímeros
L•
Isomerización
AddiƟon β- Escisión de O 2
Cis → trans O2
Dímeros • Epidioxidos • ,
Endoperóxidos •
-CH = CH- complemento O2 LOO • Ciclización
O2
Epóxidos •
O2
+ Hidrógeno
abstracción
LO • desde LH o RH
LOO + o LOO - Epóxidos •

H+ LOOH
hν∆ M n+
HO • + • OL LO • + OH - + M (n + 1) +
norte
Aldehídos
Alcanos LOH + L •
C = AddiƟo
C
Oxo cmpds, Alcoholes
Radicales de escisión • Epóxidos Polímeros Peróxidos,
(Hidroxi-, cetonas
hidroperoxi-)
Oxidaciones secundarias
FIGURA 1.2 Esquema de reacción que integra reacciones alternativas en competencia (bucles laterales) con
abstracción de hidrógeno cional (centro de cajas). DeSchaich (2005) ; utilizado con permiso.
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subestimar el grado de oxidación de los lípidos. Energías de activación de la alternativa

las vías varían, por lo que el equilibrio entre las vías cambia con las condiciones. Esto
significa que los mismos productos no serán marcadores apropiados de oxidación en todos los
aceite o producto alimenticio durante la producción, después de un almacenamiento normal versus un almacenamiento acelerado,
en oxidación temprana versus oxidación tardía, y en alimentos húmedos versus alimentos secos.
En conjunto, estas observaciones demuestran que múltiples vías y productos
Se debe realizar un seguimiento para evaluar con precisión el grado de oxidación de los lípidos.
En alimentos complejos, la situación se complica aún más por la presencia
de co-oxidaciones en las que reaccionan radicales de oxidación de lípidos y productos secundarios
con otros componentes del sistema, particularmente proteínas. Las co-oxidaciones tienen el
efecto de mover la oxidación a otras moléculas en el sistema alimentario mientras se
productos intermedios y productos de oxidación de lípidos que consumen mucho tiempo. Bajo estos
circunstancias, la oxidación de lípidos puede parecer baja o inhibida cuando en realidad es
Transmitiendo activa y rápidamente la oxidación a otras moléculas. Por lo tanto, las medidas
de las oxidaciones apropiadas para el sistema alimentario deben incluirse para evaluar la
grado completo de degradación oxidativa y para evitar subestimar la oxidación de lípidos.
Las estrategias para analizar la oxidación de lípidos en el pasado generalmente han sido más bien
simplista, monitoreando solo unos pocos productos (por ejemplo, CD, hidroperóxidos y per-
Haps aldehídos como reactivos de hexanal o anisidina) o usando un solo ensayo
(p. ej., índice de estabilidad oxidativa [OSI] o cromatografía de gases [GC] de volátiles).
Con los desafíos de las formulaciones alimentarias y las matrices complejas actuales, es
Es hora de avanzar con análisis más completos y precisos de
oxidación de lípidos en los alimentos. Por lo tanto, al presentar una descripción general de los métodos analíticos
y consideraciones críticas para medir la oxidación de lípidos en los alimentos, este capítulo
busca proporcionar un puente entre los principales métodos empleados tradicionalmente en el
industria alimentaria y métodos que quizás no son tan conocidos pero que se están convirtiendo en
necesario para proporcionar análisis más limpios y una imagen más amplia y precisa
de la oxidación del sistema completo en los alimentos. Incluido en el puente hay una introducción a
métodos para analizar las co-oxidaciones de proteínas para proporcionar una guía para el seguimiento de la
huellas de oxidación de lípidos en otras moléculas.
Í
1.2 CONSIDERACIONES DE MANEJO CRÍTICAS
PARA ANÁLISIS DE OXIDACIÓN DE LÍPIDOS
Las prácticas descritas en esta sección pueden parecer obvias, pero sus efectos deben
nunca se subestime. La mayoría de las consideraciones planteadas se aplican a
junta cuando se manipulan lípidos, pero son absolutamente obligatorios para la prevención
ing inexactitudes y artefactos al analizar la oxidación de lípidos. De hecho, lo hará
enfatizar repetidamente a lo largo de esta sección que la extracción y manipulación
procedimientos adecuados para el análisis de la composición de lípidos u otras propiedades pueden
no siempre se aplica cuando los análisis de oxidación son el punto final. A menos que el
Las consideraciones de manejo descritas aquí son la piedra angular de todo manejo de lípidos.
y análisis de oxidación de lípidos, los resultados son erráticos e inconsistentes y tienen
Fondos de oxidación.
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6 Estabilidad oxidativa y vida útil de los alimentos que contienen aceites y grasas
1.2.1 Lavado de cristalería
El lavado de cristalería puede parecer un procedimiento de laboratorio rutinario y mundano.

dureza, pero es absolutamente crítico cuando se manipulan lípidos, especialmente para la oxidación
análisis de las operaciones. Vidrio de borosilicato que se encuentra en la mayoría de los vasos, matraces y tubos de ensayo.
contiene metales y también se une y atrapa metales en los poros de la superficie. Los metales
luego proporcionan sitios muy activos para catalizar la oxidación de lípidos y transformar los productos
ucts. Las trazas de lípidos que no se eliminan por completo durante la limpieza también proporcionan radicales
y productos secundarios para catalizar la oxidación de muestras posteriores. Por lo tanto,
tanto la prevención de la oxidación durante la manipulación normal como los análisis precisos de
La oxidación de lípidos requiere la eliminación de metales, lípidos y otros contaminantes en todos
cristalería que se utiliza.
Un protocolo simple pero efectivo para la limpieza rutinaria de cristalería utiliza los siguientes
Pasos siguientes: (1) Lave la cristalería con un detergente ácido sin fosfatos para
eliminar los residuos de la superficie, enjuagar tres veces con agua del grifo seguido de tres
veces con agua desionizada bidestilada purificada a una resistividad de 18 MΩ,
como el obtenido con los sistemas de purificación Milli-Q o Barnstead; (2) remojar
cristalería durante la noche en alcohol desnaturalizado saturado con hidróxido de potasio
para saponificar las trazas de lípidos e hidrolizar otros contaminantes, incluidas las proteínas;
(3) repita el paso 1; (4) remojar durante la noche en ácido clorhídrico bajo en metales 1 N preparado
con 18 MΩ de agua para disolver metales sobre vidrio; y (5) enjuague tres veces con
18 MΩ de agua y secar al revés en un horno caliente para eliminar los rastros de encuadernación.
agua. Dado que los niveles de metales de fondo en los ácidos y álcalis reactivos de laboratorio
puede ser muy alto, todos los reactivos utilizados en estos pasos deben ser de la más alta pureza
(especialmente el contenido de metal más bajo) razonablemente disponible para evitar agregar más
contaminación. Los reactivos de nivel Ultrex ™ son deseables pero tremendamente caros.
sive para el lavado de vidrio excepto para química altamente especializada.
Las aplicaciones especiales y las reacciones o ensayos altamente sensibles requerirán
remojar la cristalería durante períodos breves en soluciones ácidas más fuertes, como 6 mol / L
ácido clorhídrico o agua regia (1: 3 v / v concentrado nítrico y clorhídrico
ácidos) después de los dos pasos de limpieza descritos en el párrafo anterior. Para
Por ejemplo, utilizamos la limpieza con agua regia antes y después de las reacciones lipídicas con metal.
catalizadores. Hay otros procedimientos disponibles para eliminar trazas de metales, pero
tienen el potencial de dejar componentes oxidantes en el vidrio (crómico, sulfuroso
ácido rico y nítrico), son tóxicos (ácido crómico) o no son útiles para
limpieza ( McCormick, 2006). Las soluciones de aqua regia son extremadamente corrosivas
y debe manipularse con capucha con gran precaución para evitar explosiones o piel.
quemaduras Las pautas para el manejo de ácidos fuertes y agua regia están disponibles en línea.
( Universidad de Princeton, 2014; Universidad de Illinois, 2015 ).
Problemas con las lavadoras de cristalería . Se han planteado preguntas sobre el uso de
Lavadoras de cristalería de laboratorio para aplicaciones de oxidación de lípidos. Este autor tiene
nunca tuve el lujo de usar una lavadora de cristalería de laboratorio, así que no puedo hablar
de la experiencia directa. Sin embargo, compartiré mis preocupaciones sobre la cristalería.
lavadoras para análisis de oxidación de lípidos y los laboratorios individuales pueden decidir por
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ellos mismos qué método es aceptable. Primero, casi todo el material de vidrio de laboratorio
Las arandelas están hechas de acero inoxidable, lo que suena bien, pero todas de acero inoxidable,
incluso el SS 316 de alta pureza lixivia metales en ambientes ácidos. El ácido
detergentes recomendados para aplicaciones donde las proteínas y los metales deben ser
disuelto aumentan el potencial de lixiviación del acero inoxidable, y los metales se disuelven
se disuelven en el agua de lavado y luego se depositan sobre el vidrio. Cada lavadora
El modelo debe ser inspeccionado cuidadosamente para asegurar que los suministros de agua o la circulación
nunca entre en contacto con piezas metálicas que no sean de acero inoxidable. Uno de cobre o acero galvanizado
El conector puede ser desastroso para las aplicaciones de oxidación de lípidos. Los detergentes deben
estar libre de fosfatos, tensioactivos y otros componentes que puedan permanecer como
residuos en la cristalería. Modelos de lavadoras que reclaman reducción del volumen de agua
Recicle pequeños volúmenes de agua de lavado y enjuague. Esto puede ser aceptable para
aplicaciones generales, pero no cuando se trata de química sensible porque
concentra los contaminantes que pueden adherirse al vidrio. Enjuague con agua del grifo
está totalmente prohibido debido a la alta contaminación con metales y otros posibles
catalizadores de oxidación. Incluso el enjuague con agua desionizada bidestilada es cuestionable.
es posible ya que hay muchos niveles de metales restantes en el agua desionizada,
dependiendo del método de generación y manejo. Agua purificada a una resistencia de 18 MΩ
Se debe utilizar la actividad en sistemas como Milli-Q ™ o Barnstead ™, pero
trasladar los sistemas de cartuchos de laboratorio a la lavadora y proporcionar grandes volúmenes
de esta agua rápidamente requeriría modificaciones. Algunos detergentes afirman tener capacidad
para eliminar metales, proteínas y grasas durante tiempos de lavado cortos que limpian
circulación de agua a alta presión en lugar de llenar la lavadora y permitir
remojo. Este procedimiento es adecuado para la mayoría de las aplicaciones de laboratorio que no son
supersensible a trazas de contaminantes, pero no ha sido probado para oxidación de lípidos y otros
aplicaciones redox. En general, este autor es escéptico de que la cristalería automática
Las lavadoras pueden eliminar residuos y contaminantes adecuadamente para la oxidación de lípidos.
estudios, pero como se señaló anteriormente, esto es sin experiencia personal.
1.2.2 Disolventes
Al igual que la cristalería, los disolventes se dan por sentado en general en los análisis de laboratorio.
sí, pero la pureza del solvente, la estabilidad y la solubilidad del oxígeno son críticas cuando se trata
con lípidos y productos de oxidación de lípidos.
1.2.2.1 Selectividad y propiedades generales de los disolventes

Qué solvente usar es siempre un dilema, particularmente con las presiones actuales
para reemplazar los hidrocarburos clorados tradicionales debido a su cancerígeno-
ity y neurotoxicidad. Varias comparaciones de la capacidad de extracción con disolventes
Los vínculos han demostrado que, en general, la composición del solvente tiene un tamaño relativamente pequeño.
efecto sobre la extracción de clases de lípidos predominantes (triacilglicéridos, cho-
ésteres de lesterol y fosfatidilcolinas) pero influye fuertemente en la solubilización
ción de las clases de lípidos más polares (Hara y Radin, 1978; Reis et al., 2013 ).
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Esto brinda a los analistas una flexibilidad considerable en la selección de solventes para adaptar
extracciones. Sin tienen
Los respiraderos embargo, rara diferentes
efectos vez se considera
sobre ladurante la selección
oxidación de lípidosdelque
disolvente
sobre losque
rendimientos de lípidos porque
intervienen en reacciones de oxidación y analíticas, y los disolventes dan un alto contenido de lípidos
los rendimientos pueden pasar por alto los productos de oxidación de lípidos o mejorar la oxidación durante
extracción. Probablemente los laboratorios individuales hayan observado artefactos de solventes
e influencias, sino información organizada sobre efectos específicos de diferentes
disolventes sobre la solubilidad, reacciones y estabilidad de los productos de oxidación de lípidos no es
disponible. Por lo tanto, la sección que sigue no tiene por objeto volver a hacer un refrito
propiedades solventes, pero para enfatizar sus efectos sobre la oxidación de lípidos y los lípidos
análisis.
Cloroformo . Hace décadas, Schmid demostró que el cloroformo era el
El solvente más eficiente para la extracción de todas las clases de lípidos menos las más polares.
( Schmid y Hunter, 1971; Schmid, 1973 ) y, de hecho, el cloroformo ahora es
considerado el disolvente lipídico universal por excelencia. El cloroformo interrumpe
enlaces de hidrógeno entre lípidos y proteínas, lo que promueve la liberación de todos
lípidos También extrae proteolípidos, que son objetivos activos de oxidación, y
inactiva las lipoxigenasas en los alimentos musculares y las plantas, protegiendo así los lípidos
de la oxidación enzimática durante la extracción. Sin embargo, el cloroformo también tiene
hidrógeno donable que puede ser extraído por lípidos, y los radicales CCl 3 OO •
ese resultado puede intervenir tanto en las cadenas de oxidación como en los análisis (cf., hidroper-
análisis de óxido).
En los tejidos biológicos, el metanol generalmente se agrega al cloroformo en 2: 1 o 1: 1.
proporciones para aumentar la solubilización de fracciones de lípidos muy polares como esfin-
gholípidos y gangliósidos en tejidos biológicos y para mejorar la miscibili-
ity con los materiales de alto contenido de agua. Aunque agregar metanol es una práctica general
también en los alimentos, no siempre es necesario ya que el cloroformo solo puede extraer el
importantes fracciones de lípidos en la mayoría de los alimentos. La adición de metanol es beneficiosa en
tejidos limpios, productos lácteos y alimentos con alto contenido de humedad, pero pueden aumentar la extracción
de materiales no lipídicos, particularmente almidón, en alimentos secos.
Como punto práctico importante, el cloroformo es fácil de eliminar por vacío.
evaporación.
Cloruro de metileno (diclorometano) . El cloruro de metileno es similar
al cloroformo en las capacidades de extracción, pero tiene una serie de propiedades que
afectan la oxidación, particularmente una polaridad ligeramente más alta (Reichardt, 2003 ),
menor hidrofobicidad, mayor solubilidad en agua y solubilidades de gas mixto (ver
Secciones 1.2.2.3 y 1.2.3 ). Por tanto, no se comporta igual que el cloroformo en
extracciones de todos los materiales o en todos los análisis de oxidación. Ese cloruro de metileno
adsorbe la humedad y no se separa de las fases de agua tan limpiamente como el cloro
La forma causa problemas particulares para las aplicaciones de oxidación.
Aunque es menos tóxico que el cloroformo, el cloruro de metileno sigue siendo un potente
neurotoxina. Al igual que el cloroformo, está en la lista de prioridades de sustancias peligrosas.
Sustancias de la Agencia de Sustancias Tóxicas y Registro de Enfermedades (ASTDR,
2014 ), por lo que no debe considerarse una alternativa "segura" al cloroformo.
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Hexano . Entre los disolventes no polares más hidrófobos, el hexano es bueno para
eliminando lípidos en capas o cuerpos aislados. Sin embargo, no se disuelve polar
lípidos, particularmente fosfolípidos y muchos productos de oxidación. Tal comportamiento es
muy útil en extracciones de aceite de semillas oleaginosas y alimentos antes de refinar, pero en alimentos,
ane por sí mismo pierde componentes importantes para los análisis de oxidación de lípidos. Por total
extracciones de lípidos, el hexano debe mezclarse con un disolvente polar como un alcohol.
El hexano es inmiscible con metanol, pero los dos disolventes se pueden utilizar juntos en
extracción con solvente presurizado donde se agregan a la muestra bajo presión
por separado pero simultáneamente. Las mezclas de hexano: isopropanol 3: 2 fueron originalmente
demostrado por Hara y Radin (1978) para dar altos rendimientos y extractos limpios;
el isopropanol elimina la contaminación por hemo en extractos de tejidos, incluida la carne
( Rose y Oklander, 1965). Aunque tomó algún tiempo llamar la atención, el
La mezcla se utiliza ahora cada vez más como un sustituto del cloroformo: metanol.
A pesar de su comparabilidad con los disolventes, el hexano no es el mejor sustituto de la oxidación de lípidos.
análisis debido a su alta solubilidad en oxígeno (consulte la Sección 1.2.3).
Iso-octano . Con una hidrofobicidad aún mayor y una menor volatilidad y
solubilidad en agua que el hexano, el isooctano también se considera como reemplazo
Mento de hidrocarburos clorados en extracciones y análisis. Como el hexano
El iso-octano debe mezclarse con un alcohol para extraer lípidos y productos polares.
Iso-octano: se han sugerido mezclas de isopropanol para extracciones, pero pueden
no ser la mejor opción para los análisis de oxidación de lípidos debido a la alta solubilidad en oxígeno
ity en iso-octano ( Tabla 1.2) y formación de peróxido en isopropanol. El muy
El alto punto de ebullición del isooctano también dificulta la evaporación de los lípidos.
después de la extracción. Al mismo tiempo, este disolvente extrae muy poco, si es que lo hay, de
material lipídico como almidones y proteínas, por lo que se pueden usar extractos de isooctano
directamente en los análisis.
Éter de petróleo . Este solvente lipídico clásico se ha utilizado ampliamente para
Extrae lípidos neutros de muchos tipos de materiales. Al ser muy no polar, lo hace
no disolver fosfolípidos, no lípidos polares como almidón o productos de oxidación
ucts. Su principal aplicación es la extracción de lípidos libres o superficiales así como grasas
ácidos liberados después de la hidrólisis ácida.
Éter dietílico . Un solvente de grasa clásico, el éter dietílico disuelve todas las grasas y oxida-
productos de cion. Sin embargo, también disuelve materiales no lipídicos y recoge agua.
durante las extracciones, promueve la actividad de la fosfolipasa D en tejidos y formas
peróxidos fácilmente, por lo que no es un solvente de elección para análisis de oxidación. Es uso
Útil principalmente para eliminar lípidos superficiales o ácidos grasos después de la digestión ácida. Dietil
El éter no debe usarse cuando hay una alternativa disponible debido a su volatilidad,
efectos anestésicos, alta inflamabilidad y riesgos de explosión.
Éter de metil-terc-butilo (MTBE ). Este solvente sintético, inicialmente utilizado como
oxigenar en gasolina sin plomo para mejorar la eficiencia de la combustión,
planteado como un sustituto del cloroformo debido a la falta de evidencia de toxicidad humana
( Matyash et al., 2008 ). Sin embargo, el MTBE es cancerígeno en ratas (Anónimo,
1998 ). El MTBE puede tener limitaciones como disolvente lipídico porque es inflamable.
ble y forma azeótropos con agua (52,6 ° C; 96,5% MTBE) y metanol
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(51,3 ° C; 68,6% MTBE). Todavía hay una base de experiencia relativamente pequeña con
extracciones de lípidos u oxidación utilizando este disolvente.
Metanol . El metanol ha sido durante mucho tiempo el disolvente preferido para los fosfolípidos,
así como el principal modificador polar para disolventes muy hidrófobos. Se disuelve
ácidos grasos y productos de oxidación, pero no triacilgliceroles a menos que haya suficiente
El folípido está presente como codisolvente. Debido a que el metanol coextrae altas concentraciones
traciones de hemes, que catalizan la oxidación rápida en extractos y también interfieren
con análisis, debe reemplazarse con isopropanol para eliminar hemes de
extractos de alimentos musculares ( Rose y Oklander, 1965).
Isopropanol . El isopropanol es un disolvente interesante con efectos mixtos. Eso
es un buen solvente para tejidos complejos de plantas y animales porque solubiliza
lípidos polares y apolares al tiempo que limita la extracción de pro-oxidante
pigmentos clorofilaRamluckan y col., 2014) y compuestos de hemo ( Rose y d
Oklander, 1965 ). También inhibe la fosfolipasa D y las lipasas ( Christie, 1976 ),
minimizando así la degradación de lípidos por enzimas tisulares. Sin embargo, el oxígeno
la solubilidad en isopropanol es el doble que en metanol ( Sección 1.2.3; Tabla 1.2 )
por lo que se necesita un cuidado especial para evitar la oxidación durante la manipulación. Además, isopropanol
forma peróxidosRedemann, 1942) y estos deben eliminarse por destilación
u otro tratamiento antes de su uso en extracciones o análisis.
Butanol saturado de agua . Este es el solvente tradicional para interrumpir
complejos de almidón y la liberación de lípidos ligados en los cereales, pero el calor requerido
para expandir las hélices de almidón también modifica los productos de oxidación. El butanol no es
un buen solvente para estudiar la oxidación de lípidos porque promueve la fosfolipasa
D actividad en tejidos de plantas y animales, extrae cantidades significativas de no lípidos
materiales y es difícil de evaporar a temperaturas que no promueven los lípidos
oxidación, incluso en vacío.
1.2.2.2 Estabilidad del solvente
Muchos disolventes utilizados para extraer o disolver lípidos forman peróxidos que intervienen
fere con los ensayos y puede catalizar la oxidación de lípidos cuando las muestras están en reposo. De estos,
éter etílico, tetrahidrofurano, isopropanol y butanol forman peróxidos más
fácilmente y debe protegerse manteniendo todas las botellas de disolvente rociadas (líquido y
espacio de cabeza) con argón y sellado herméticamente después de abrir, bloqueando la luz y
manteniendo el espacio libre mínimo (Clark, 2001), y añadiendo descomposición de peróxido
posers como los gránulos comerciales XPell que son inertes y actúan de manera muy similar a la molécula
tamices lar en disolventes ( XploSafe, 2012). Además, el éter etílico debe almacenarse
congelado debido a su volatilidad.
Los peróxidos en disolventes inmiscibles en agua pueden detectarse agitando 2 ml
disolvente con 1 ml de yoduro de potasio al 10% recién preparado en agua de 18 MΩ y
agregando una gota de solución indicadora de almidón. Los peróxidos están indicados por desarrollo
Mento de color: amarillo-marrón claro para niveles bajos de peróxidos o azul para activos
peróxidosCyberlipid, 2014 ). Disolventes con resultados muy positivos para peróxidos
debe descartarse; Los disolventes con bajos niveles de peróxidos deben destilarse.
inmediatamente antes de su uso en ensayos o extracciones de oxidación de lípidos.
Página 11
El etanol generalmente se considera un solvente estable. Sin embargo, se oxida

a los aldehídos durante el almacenamiento. Por tanto, el etanol utilizado en los análisis de oxidación debe
almacenarse bajo argón. La presencia de aldehídos se puede detectar por reacción.
con 2,4 dinitrofenilhidrazina. Etanol libre de carbonilo para extracciones y
Los ensayos se pueden preparar agregando 1% de dinitrofenilhidrazina y unas gotas
de ácido clorhídrico concentrado, refluir durante 3 h, luego destilar. Solvente
Los blancos deben ejecutarse en todos los análisis de oxidación para eliminar las contribuciones de
contaminantes.
El cloroformo, el disolvente que se utiliza con mayor frecuencia con los lípidos, se oxida para formar CH 3
y CH 3 OO • radicales (Cunningham y col., 1985; Connor y col., 1994; Rosen y col. ,
1999), por lo que nunca debe almacenarse con lípidos oxidantes. El cloroformo también se forma
fosgeno tóxico (COCl 2 ) y ácido clorhídrico a lo largo del tiempo ( Sigma-Aldrich ,
2012). Esto se puede prevenir agregando estabilizadores y almacenando debajo
argón después de la apertura. El mejor estabilizador a utilizar lo dicta el material y el analizador.
Aplicación lítica. El etanol es el estabilizador de cloroformo preferido de una toxicidad
punto de vista, pero debe agregarse en altas concentraciones (1-2%) ( Sigma-Aldrich ,
2012). Esto aumenta la polaridad del disolvente, lo que puede alterar las extracciones y reacciones.
El etanol también suele complicar las incubaciones y las reacciones analíticas porque
es susceptible al ataque de radicales por oxidación de lípidos, formando radicales reactivos
que aceleran la oxidaciónSchaich y col., 1993), y se compleja con lípidos y
otros radicalesWu y col., 1977; Rockenbauer y Tudos, 1979; Gardner y col. ,
1985). Los alquenos de cadena corta añadidos a aproximadamente 100 ppm estabilizan los disolventes de manera similar
eliminando los radicales, pero en el proceso, forman radicales que pueden interferir con
análisis. El ciclohexeno interfiere con el análisis cromatográfico de gases de los productos
( Sigma-Aldrich, 2012 ) y el amileno (1-penteno) genera altos antecedentes en
el ensayo de hidroperóxido de tiocianato férrico (Richards y Feng, 2000 ). Alquenos
también son menos eficaces para prevenir la formación de fosgeno con el tiempo ( Turk, 1998 ).
Por lo tanto, hemos considerado necesario seleccionar los disolventes para cada ensayo para maximizar
protección y minimizar las interferencias.
1.2.2.3 Solubilidad en agua en solventes y viceversa

Aunque el cloruro de metileno (diclorometano) se sustituye cada vez más
para cloroformo en extracciones de lípidos y solvatación para menor toxicidad, no
coincidir exactamente con las propiedades del cloroformo. Como ya se mencionó, uno particularmente
El problema molesto es que el cloruro de metileno tiene una mayor solubilidad que el cloroformo.
en agua, y el agua es más soluble en cloruro de metileno (Cuadro 1.1). Esto
hace que los extractos sean más difíciles de secar, definitivamente complica las separaciones de fases
en procedimientos como el lavado de Folch, y también permite cierta difusión de catalizadores
entre fases. Además de estos efectos físicos, el agua en disolventes puede
Altera la química: estabiliza algunos productos y dirige los cambios en la degradación.
vías que cambian tanto los niveles de oxidación como la distribución de los productos.
Por tanto, el cloruro de metileno químicamente no es el disolvente de primera elección para los lípidos.
extracciones y análisis cuando la oxidación es el punto final analítico. Todos los solventes
utilizados para todos los análisis de oxidación de lípidos deben secarse para una detección precisa de
Pagina 12
TABLA 1.1 Solubilidades de agua en solvente y solvente en agua de orgánicos

Disolventes utilizados con lípidos
Solubilidad en solvente H 2 O Solubilidad

Solvente en agua (%) en disolvente (%)
n- octano 6,6 × 10 –7 0,0095
n- Hexano 0,00123 0.0111
1-octanol 0.0538 (-)
n-hexanol 0,706 7,42
1,2-dicloroetano 0,81 0,32
Cloroformo 0,815 0.0135
Diclorometano 1.3 0.093
Metil isobutil cetona 1,7 1,9
1,1-dicloroetano 5,03 0,187
Éter dietílico 6.04 1,47
n- Butanol 7,45 16,9
Isobutanol 10 7,46
Metiletilcetona 24 10
Metil t- butil éter 5.44 4.2
Extraído de Kislik (2012). Datos de MBTE del Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente (1998).
química y máxima reproducibilidad ( Burfield et al., 1977; DeLloyd, 2006 ;

Bradley y col., 2010).
1.2.3 Solubilidad de gas en disolventes

Tanto el aire como los disolventes contienen oxígeno que impulsa la oxidación de lípidos, por lo que
La primera regla empírica en el manejo de lípidos es mantener los materiales de prueba bajo
atmósfera inerte en todo momento. Obviamente, el vacío ofrece la mayor protección, pero
pocos laboratorios manejan realmente muestras en líneas de vacío, excepto para
investigación básica. Como alternativa para proteger los lípidos durante la manipulación normal,
los espacios de cabeza y los disolventes siempre deben rociarse con gas inerte, y siempre que
posible que los propios materiales también deben estar saturados para eliminar disueltos
o oxígeno atrapado.
El burbujeo o la cobertura de nitrógeno, más comúnmente utilizado en la investigación de lípidos
debido al hábito y al menor costo, se asume ampliamente que previene la oxidación de lípidos.
¡No tan! La solubilidad del oxígeno en la mayoría de los solventes es significativamente mayor que la de
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TABLA 1.2 Solubilidad de oxígeno, nitrógeno y argón en lípidos comunes

Disolventes a temperatura ambiente (293 K)
Fracción mol × 10 4
Solvente Oxígenoa Nitrógeno Argón
Octano 21.22
Iso-octano 26,81 14,13 c 29,2 días
Heptano 19,98 25,0 días
Hexano 19.60 14.0D 25,3 días
Ciclohexano 12.31 7.55 días 14,9 días
Tolueno 9.17 10,95D
Acetona 8,34 5,19 c
Tetrahidrofurano 8.03
Butanol 8.03 4.52 c
Cloroformo 7.23 b 7,89 b 3,82B
Diclorometano 5,61 b 3,27 b 5.02B
Etanol 5,87 3,55 c
Metanol 4.15 2,75 c
Isopropanol 7.88 4.66
Aceite de oliva 0,51
a A menos que se indique lo contrario, los datos recopilados deBattino y col. (1983) .
B Shirono y col. (2008).
c Kretschmer y col. (1946) .
D Jolley y Hildebrand (1958) .
De Schaich (2013b) ; utilizado con permiso.
nitrógenoTabla 1.2 ), el nitrógeno es menos denso que el aire por lo que se escapa más rápidamente,
y el oxígeno incluso en nitrógeno de alta pureza es suficiente para impulsar la oxidación de lípidos
ción ( Schaich, 2013b). Por el contrario, toda la investigación de lípidos debe utilizar argón, preferiblemente
alta pureza.1 El argón es una atmósfera mucho más protectora porque es más pesada
que el aire y, por lo tanto, no se escapa fácilmente de las soluciones o los recipientes, no
contienen las trazas de oxígeno presente en el nitrógeno y la solubilidad del argón en ambos
el agua y el aceite son el doble (o más) que el nitrógeno ( Gunstone y Padley, 1997 ).
1. Los proveedores varían, pero para nuestra fuente, el nitrógeno prepurificado estándar tiene <5 ppm de O 2 mientras que es de alta pureza.
el argón tiene <1 ppm de O 2 . Se encuentran disponibles múltiples purezas de cada gas. Los proveedores individuales deben ser
sulted para el contenido de O 2 de grados específicos del producto.
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El argón es más soluble que el oxígeno en agua y es 2,5 veces más soluble
que el nitrógeno en agua hasta 50 ° C (Battino y Clever, 1966 ). Más importante
para los lípidos, el argón es más soluble que el oxígeno y el nitrógeno en la mayoría de los
disolventes excepto diclorometano (Tabla 1.2 ). El equilibrio desventajoso
entre el oxígeno y la solubilidad del gas inerte es una de las razones por las que el diclorometano es
no es la mejor elección de disolventes para análisis de oxidación de lípidos. Nuestro laboratorio utiliza
argón de alta pureza exclusivamente en la manipulación de lípidos. La protección adicional que ofrece
más que justifica su mayor costo.
Para que sea más eficaz, el burbujeo de gas (especialmente con nitrógeno) debe modificarse
nado con vacío y realizado durante al menos tres ciclos de 15 a 30 minutos (Rolli e
et al., 1987).
La solubilidad del oxígeno en todos los principales disolventes utilizados en la investigación de lípidos es sub-
stantialCuadro 1.2), por lo que los disolventes no deben pasarse por alto como principales fuentes de
niveles catalíticos de oxígeno. Una de las razones por las que el cloroformo, y ahora también
diclorometano, se prefieren como disolventes lipídicos es que tienen casi la
solubilidades de oxígeno más bajas ( Tabla 1.2). Nos sensibilizamos a este efecto cuando
el hexano siempre provocó más oxidación que el cloroformo en las extracciones de lípidos.
Por el contrario, el isooctano, que se utiliza en muchos ensayos de oxidación, tiene el triple de
solubilidad en oxígeno del cloroformo. Por lo tanto, debería ser una práctica estándar
Reducir o eliminar significativamente el oxígeno en todos los disolventes utilizados con lípidos por destilación.
(y uso inmediato) o rociar a fondo con gas inerte. La mayoría de los laboratorios
optar por el último, pero aquí las solubilidades de los gases inertes en la muestra se convierten en la
cuestión determinante.
1.2.4 Luz
Los aceites y materiales alimenticios destinados al análisis de oxidación deben protegerse de la luz.
durante el almacenamiento, manipulación y análisis. El principal efecto de la luz ultravioleta es descomponer
plantean hidroperóxidos, mientras que la luz visible cataliza oxígeno singlete mediado
oxidación cuando están presentes pigmentos u otros fotosensibilizadores. El efecto de
La luz suele ser impredecible, ya que cataliza simultáneamente la formación y
destrucción de los mismos intermedios, pero también puede ser desastrosa. Para examen-
ple, al purificar hidroperóxidos lipídicos sintetizados en altas concentraciones por
lipoxigenasa, encontramos que todos los hidroperóxidos se perdían al pasar por una sílice
columna de gel en el laboratorio. Los rendimientos mejoraron cuando se envolvió la columna
con papel de aluminio para bloquear la luz del laboratorio, pero los rendimientos esperados fueron solo
logrado cuando la columna se trasladó a una cámara fría con luz roja durante toda
proteccion. Hemos intentado realizar un seguimiento de los efectos de luz durante la preparación de la muestra.
en el laboratorio y observaron variaciones considerables dependiendo del alimento o
forma y composición del aceite.
La luz también afecta la estabilidad de casi todos los reactivos utilizados en muchas oxidaciones.
análisis (cf., advertencias en las hojas de datos de seguridad del material). Por tanto, todos los protocolos
debe incluir procedimientos obligatorios para proteger muestras, extractos y reacciones
ciones de la luz, a menos que la luz sea un catalizador requerido. Esto se puede lograr
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apagar las luces del laboratorio cuando sea posible (suponiendo que haya luz difusa de
ventanas), envoltura de tubos de ensayo o matraces en papel de aluminio, reacciones de incubación
en un cajón cerrado o en una caja oscura, o trabajando bajo una luz roja. En caso de duda,
manejar en la oscuridad.
1.2.5 Manipulación y almacenamiento

Temperatura . Es una regla general al manipular lípidos, especialmente para
análisis de oxidación, para mantener las temperaturas de manipulación y almacenamiento tan bajas como
posible. Para el almacenamiento, −80 ° C es preferible a los congeladores estándar (−10 a −20 ° C),
y con materiales muy sensibles a veces hemos encontrado necesario
Aislamientos y análisis de conductos en cámara frigorífica. Los hidroperóxidos son razonablemente
estable hasta ∼40 ° C pero se descompone rápidamente a temperaturas más altas. Esto significa
las extracciones y evaporaciones de solventes deben limitarse a 40 ° C o un poco menos.
A 60 ° C, que se utiliza con frecuencia en estudios de vida útil acelerada, las reacciones
cambian drásticamente y no siguen la cinética de Arrhenius, por lo que las condiciones
no debe interpretarse como modelos rápidos de oxidaciones normales.
Tiempo . Una práctica común es extraer muestras durante las incubaciones y luego
guárdelos congelados hasta que se puedan completar los análisis. Sin embargo, los extractos cambian
rápidamente incluso cuando se almacenan a -80 ° C bajo argón o vacío, y se analizan
La variabilidad cal aumenta con el tiempo de almacenamiento. En estudios cinéticos, linoleato de metilo
la mayoría de las veces mostró una oleada de oxidación durante el primer día o dos seguidos de
estabilización o disminución antes de reanudar la oxidación (Xie, 2015). En sistema cerrado
temas tales como envases laminados y viales sellados, hemos observado iterativas
ciclo de productos (es decir, aumentar y luego disminuir repetidamente durante períodos cortos),
así como el cambio de productos individuales (por ejemplo, aldehídos) incluso cuando la clase total
los análisis muestran relativamente pocos cambios. El ciclismo desapareció en gran medida cuando
las muestras se analizaron con intervalos más largos entre las pruebas. En total, estos
Las observaciones indican que los nuevos enfoques para el análisis de oxidación de lípidos deben centrarse
en escalas de tiempo cortas: analice a las pocas horas de las extracciones, si no es posible
diariamente y con breves intervalos entre muestreo. Corto, en este caso, significa
no más de una vez al día para la oxidación temprana y semanalmente para incubaciones prolongadas en
para evitar perder patrones de oxidación clave.
Embalaje . Una línea de defensa crítica contra el aire es el uso de envases de vidrio.
que se pueden sellar en lugar de materiales plásticos que son permeables al oxígeno. La
práctica común de manipulación y almacenamiento de muestras en bolsas o recipientes de plástico
antes y durante los análisis permite al menos una difusión lenta de oxígeno en la prueba
materiales; con algunos plásticos, las muestras también podrían estar abiertas en el
banco de laboratorio. Polietileno, polipropileno, poliestireno y policarbonato
todos tienen permeabilidades al oxígeno relativamente altas, que van de 1 a 4 mL / sq. pulgada
( Massey, 2003 ).
La permeabilidad a la humedad a través de estos plásticos también es alta. Permeabilidad a la humedad
es el más bajo en polipropileno y polipropileno de alta densidad (0,2 a 0,5 g / 100 pulgadas cuadradas),
y aumenta con la polaridad del polímero de embalaje (p. ej., polietileno
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tereftalato, nailon, etileno alcohol vinílico) (Massey, 2003). Por lo tanto, a menudo somos
ante el dilema de bloquear el oxígeno o la humedad. Admisión de
o cambia las tasas de oxidación, las vías y los productos (Schaich, 2013b).
Los envases de plástico (bolsas y envases) también contienen varios plastificantes.
y aditivos, algunos de los cuales son solubles y reactivos con lípidos, y
potencialmente puede interferir con los análisis de productos. También es casi imposible
eliminar todos los contaminantes en las superficies de los plásticos. Así, por numerosas razones
hijos, los envases de vidrio suelen ser la mejor opción para manipular, almacenar y analizar
lijar materiales y extractos destinados a análisis de oxidación de lípidos (o proteínas).
Los recipientes de teflón son alternativas aceptables pero costosos.
1.3 EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS PARA ANÁLISIS DE OXIDACIÓN

Casi todos los análisis químicos de oxidación de lípidos requieren la extracción de lípidos como
primer paso. Las extracciones, para esta aplicación, tienen tres requisitos: proporcionar
una muestra de lípidos representativa con el máximo rendimiento, evita la oxidación de nuevos lípidos
y degradación / transformación de productos existentes, y poder manejar grandes
número de muestras simultáneamente. Desafortunadamente, estos requisitos imponen
estrictos estándares de manipulación y limitaciones que hacen que la mayoría de las extracciones estándar
métodos inaceptables cuando la oxidación de lípidos es el criterio de valoración analítico. El dis-
La discusión que sigue enfatiza las consideraciones de extracción y manejo que son
exclusivo de la oxidación de lípidos.
1.3.1 Pretratamientos
Los lípidos adsorbidos en la superficie son relativamente fáciles de eliminar, mientras que los lípidos
atrapados en matrices de alimentos o unidos a otras moléculas requieren un tratamiento especial
mentos para aumentar su disponibilidad. Pretratamientos habituales para alterar la actividad física.
matrices y facilitar la liberación de lípidos incluyen secado, homogeneización o trituración
a partículas pequeñas y digestión con enzimas como proteasas o amilasas.
Aunque es necesario, cada enfoque presenta desafíos importantes para la prevención
la oxidación adventicia y los artefactos de oxidación.
Secado . El agua es a menudo perjudicial en las extracciones porque limita el acceso de
disolventes hidrofóbicos a regiones lipídicas en tejidos y matrices alimentarias, moviliza
cataliza y apoya la actividad de las enzimas degradativas, y media cambios
en reacciones de oxidación, particularmente escisiones de radicales alcoxilo. El agua plastifica
alimentos, haciéndolos más difíciles de dispersar durante la extracción, y se mezcla
con disolventes para formar azeótropos, que son difíciles de eliminar por evaporación
ción. Para evitar estos problemas, las muestras se pueden secar antes de la extracción, pero todas
Las precauciones discutidas anteriormente con respecto a la manipulación definitivamente deben aplicarse a
Evite los artefactos de oxidación. En particular, ningún método de deshidratación que utilice calor puede
utilizarse si se va a analizar la oxidación. La liofilización es una alternativa aceptable.
tivas, pero las matrices resultantes serán muy porosas y expuestas, por lo que las muestras deben
analizarse inmediatamente después del secado.
Página 17
Molienda . La molienda puede parecer una tarea sencilla, pero presenta

desafíos importantes para el análisis de oxidación de lípidos porque no debe degradarse
cualquier molécula de alimento y debe realizarse en condiciones que protejan
ples del aire, el calor y la luz. Primero, la práctica de moler muestras individuales
por cualquier método y permitiéndoles sentarse en el mostrador bajo luces de laboratorio
hasta que todas las muestras estén preparadas es inaceptable. Las muestras deben proceder a la extracción
inmediatamente o congelarse al vacío hasta que se analice, preferiblemente dentro de
unas pocas horas como máximo. En segundo lugar, casi todos los métodos presentan algunas limitaciones.
Un problema irritante es encontrar un método que no resulte en el tapón de lípidos.
ging los tamices del molino, como ocurre con los molinos Wiley. Molinos con alto cizallamiento, tales
como molinos centrífugos, requieren enfriamiento criogénico (p. ej., nitrógeno líquido) para eliminar
calor de fricción a medida que se genera, y no deben usarse en absoluto cuando la proteína
La co-oxidación debe medirse porque rompen los enlaces disulfuro de proteínas y
generar radicales de azufre extensos (Schaich, 2002). Molienda manual con mortero
y el mortero presenta el menor estrés físico, pero requiere largos tiempos que exponen
muestras a una mayor oxidación adventicia, y a menudo es difícil reducir la
Tamaños de ticle suficientemente. Los procesadores de alimentos con argón soplado sobre la muestra pueden
ser una alternativa útil si los tiempos de molienda son limitados y se extraen muestras
inmediatamente después. Criomolinos de diseño inicial que congelaban y pulverizaban productos
directamente en nitrógeno líquido a menudo causaba daños por congelación en los materiales. Sin emabargo,
Los nuevos diseños protegen las muestras al congelarlas en contenedores refrigerados por nitrógeno líquido.
o dióxido de carbono sólido (hielo seco) y pulverizándolo bajo gas inerte. Aunque
hay una base de experiencia relativamente pequeña con el criomolido en la actualidad,
recomendar que se preste mayor atención a este método y consideren que podría
bien se convertirá en el método de molienda de elección para los análisis de oxidación de lípidos.
Digestión enzimática . El rectificado no siempre garantiza un mayor acceso
a lípidos atrapados en matrices moleculares complejas como productos extruidos,
productos horneados y otros alimentos compuestos principalmente por almidones y proteínas.
En tales casos, la digestión enzimática selectiva de las moléculas que bloquean
la liberación de lípidos puede ser beneficiosa. Por ejemplo, incubación de 1 g extruido
producto de maíz y soja con 25 mg de α-amilasa de lípidos unidos al almidón liberados durante la noche
cuantitativamente, y luego podrían recolectarse mediante extracción en cloro 2: 1
forma-metanol ( Strange y Schaich, 2000 ). Saturación cuidadosa de argón del
solución de enzima y burbujeo del espacio de cabeza del matraz, así como la incubación en
la oscuridad era necesaria para minimizar la oxidación de lípidos durante el proceso. Predi-
La gestión con amilasas o proteasas puede alterar las matrices de los productos extruidos.
( Wang, 2000 ), lo que hace que los lípidos sean más accesibles. Predigestión con trip-
sin o snailasa (mezcla de enzimas que digieren la mayoría de las biomoléculas estructurales)
aumento de la extracción de lípidos de microalgas de <10% a aproximadamente 35% ( Liang
et al., 2012). Las celulasas también aumentaron la producción de lípidos, pero las condiciones requeridas para
la actividad enzimática (pH 4, 50 ° C) degradaría los productos de oxidación.
Hidrólisis ácida . La hidrólisis ácida es el método de elección para la determinación cuantitativa.
minación
nunca, losdel contenido
lípidos total por
generados de ácidos grasosno
este método expresado como
se pueden equivalentes
analizar de triacilglicerol.
para la oxidación de lípidosCómo-
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porque la muestra requerida se refluye en HCl 6 N o HCl al 5-10% en metanol para

4-30 h dependiendo de la matriz alimentaria y el objetivo de lípidos causa una degradación extensa
de productos de oxidación de lípidos. Cuando las medidas tanto de la composición de lípidos como de lípidos
se requiere oxidación, extracciones y preparación de muestras separadas pero paralelas
debe aplicarse.
1.3.2 Métodos de extracción

Se han desarrollado muchos métodos para mejorar la eliminación de lípidos de los productos biológicos.
tejidos, tanto vegetales como animales, con el objetivo de maximizar los rendimientos
análisis posicionalSchaich, 2013b ). Normalmente, se han utilizado los mismos métodos
adaptado para extraer lípidos de los alimentos, pero la práctica no siempre es válida, incluso para
cuantificación, debido a las diferencias en los niveles de lípidos y la compartimentación. Tejido
Los métodos de extracción fueron diseñados para niveles bajos de lípidos y se vuelven cada vez más
inexacto ya que los niveles de lípidos aumentan por encima del 2%, que es un contenido de lípidos muy bajo
para alimentosAPJCN-NHRI, 2015 ). Casi todos los métodos de extracción mejorados tienen
limitaciones significativas cuando la oxidación de lípidos es el problema porque causan algunos
daño tisular para aumentar la producción de lípidos ( Schaich, 2013b). Esto tanto exagera
niveles y oscurece los mecanismos de oxidación nativa presentes. Pérdida del 1% o 2%
de lípidos totales puede no importar en la cuantificación, pero los alimentos muy oxidados
implican menos del 1% de los lípidos totales. Desafortunadamente, esto significa que
Se deben utilizar extracciones separadas para la cuantificación de lípidos y el análisis de oxidación de lípidos.
sí, o se debe desarrollar un método único que sea eficiente para ambos objetivos.
También está la cuestión de extraer lípidos libres frente a lípidos ligados. Exhaustivo
La extracción con hidrólisis ácida para tener en cuenta tanto los lípidos libres como los enlazados puede ser
requerido para el análisis de composición y el etiquetado nutricional, pero si esto es
justificado para la evaluación de oxidación de rutina es cuestionable. Productos de oxidación
en los lípidos libres, los que se extraen fácilmente, son de mayor interés para la industria
análisis de control de calidad de los ensayos porque serán más contundentes e inmediatos
percibido dianamente por los consumidores. Los lípidos ligados ciertamente se oxidan y probablemente
Contribuyen significativamente a las oxidaciones tanto en los alimentos como en los tejidos biológicos.
Para ser justos, la distinción entre oxidación de lípidos libres frente a lípidos ligados ha
apenas se ha estudiado, por una buena razón, por lo que se dispone de poca información definitiva.
Sin embargo, las tensiones químicas necesarias para interrumpir las asociaciones moleculares
también debería degradar y modificar los productos de oxidación, lo que invalidaría
análisis posteriores de oxidación. Por tanto, los métodos que se describen a continuación se centran en
extracción de lípidos que están libres (no unidos) o asociados débilmente por fuerzas que
puede ser interrumpido por interacciones de solventes.
Las limitaciones de los métodos de extracción para la oxidación de lípidos se discutieron previamente.
ouslySchaich, 2013b ). Sólo se presentará una descripción general de los problemas.
enviado aquí. No hace falta decir que todos los problemas de disolventes y gases inertes discutidos en
Se aplican las secciones 1.2.2 y 1.2.3 .
Extracción manual como referencia para la comparación . La extracción más sencilla
El método es la extracción manual, donde las muestras de alimentos se dejan reposar en solvente.
durante varios períodos de tiempo con o sin agitación, luego se filtra, y el solvente
Página 19

se
queevapora del residuo
los lípidos lipídico.
se recubren La extracción
principalmente o semanual funciona
adsorben mejor conoalimentos
en la superficie en
se distribuyen
en la matriz alimentaria sin formación de complejos, atrapamiento o unión; es mucho
menos eficaz en la eliminación de lípidos de matrices complejas. Desafortunadamente, a pesar de
Fácil aplicación, se requiere tanta manipulación que evitar accidentes
la oxidación de lípidos es casi imposible. Las extracciones manuales también requieren una gran cantidad de
cantidades de cristalería y, por lo tanto, aumentan significativamente los requisitos de limpieza y
tiempos de ciclo para experimentos. Por lo tanto, la extracción manual se reserva normalmente para
Enseñar a los estudiantes conceptos básicos de extracción, para encontrar rangos y para situaciones.
en las que no se dispone de otros métodos. Se aplican métodos alternativos para
aumento de la producción de lípidos, para la protección contra la oxidación, o ambos.
1.3.2.1 Métodos que mejoran los rendimientos y la eficiencia de la extracción

Se han realizado extracciones Soxhlet, microondas, ultrasonido y CO 2 supercrítico.
desarrollado para mejorar la producción de lípidos sobre las extracciones manuales aumentando la sol-
ventile el contacto mientras descompone las matrices moleculares que se unen o atrapan los lípidos.
Son particularmente útiles cuando la composición de lípidos (identificación o cuantificación
ción) es el objetivo analítico. Desafortunadamente, todos estos métodos aplican tensiones
(calor, radiación, radicales) que degradan los lípidos y alteran los productos de oxidación,
requieren mucho tiempo, y las muestras deben extraerse individualmente o en cantidades limitadas
( Schaich, 2013b ). En consecuencia, no son adecuados cuando el análisis de lípidos
la oxidación es el punto final.
La hidrólisis ácida como método de extracción debe distinguirse de la ácida.
hidrólisis como método analítico para determinar el contenido de ácidos grasos. En extrac-
Se hidroliza toda la muestra de alimento para liberar lípidos y determinar el contenido de grasa.
tienda, mientras que en el análisis, los extractos de lípidos se hidrolizan para liberar ácidos grasos a
determinar la composición de ácidos grasos o reconstruir el contenido de grasa equivalente total
(triacilgliceroles más todos los demás ácidos grasos esterificados). Hidrólisis ácida de lípidos
La extracción se utiliza en dos tipos de aplicaciones ( Min y Ellefson, 2010):
1. Cuando las fracciones de lípidos estén fuertemente unidas a proteínas y / o almidones; en esto
En este caso, las muestras se digieren típicamente 1 h en HCl 3 N antes de extraerlas.
lípidos en disolventes mediante cualquier método estándar;
2. Para romper emulsiones, digerir proteínas y liberar lípidos de fase interna que
luego se recolectan físicamente por centrifugación, como en los productos lácteos.
Es fcil ver que ambos mtodos destruyen toda la informacin til sobre oxi-
dación porque el calor y el ácido inducen algo de hidrólisis de triacilgliceroles
y también modifican fuertemente los productos de oxidación de lípidos.
La hidrólisis alcalina ha sido el método de digestión preferido cuando se determina
ing contenido de lípidos para las etiquetas nutricionales porque puede recolectar todos los metabolizables
ácidos grasos dondequiera que estén esterificados con mínima degradación. Estos pueden
luego ser extraído, analizado por GC y reconstruido en grasa (es decir, triacilglic
erol) equivalentes para contabilidad nutricional.
Los ácidos y los álcalis contienen altos niveles de contaminantes metálicos, en particular
principalmente hierro y cobre, que rápidamente inician la oxidación de lípidos y también transforman
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productos existentes. Por lo tanto, si no se puede evitar la hidrólisis de un alimento en particular

productos, deben usarse reactivos ultrapuros como Baker Ultrex ™.
El método de Folch ( Folch et al., 1951, 1957 ) y su simplificación Bligh-Dyer
versión fiedBligh y Dyer, 1959) han llegado a ser universalmente aceptados (casi
necesarios) métodos para la extracción de lípidos de tejidos para fines biológicos y médicos
investigar. El procedimiento de Folch se desarrolló específicamente para eliminar los lípidos totales,
incluyendo lípidos muy polares pero traza como los gangliósidos, de homogeneizados
tejidos frescos (animales o vegetales) y para eliminar contaminantes no lipídicos en
el mismo procedimiento. Brevemente, se homogeneiza 1 g de tejido durante 3 min con 19 mL
cloroformo: metanol 2: 1 para extraer lípidos. Luego se filtra la mezcla y se
La fase de disolvente del extracto se agita con 0,2 volúmenes de agua o 0,05 mol / L de potasio.
cloruro de sodio para eliminar contaminantes no lipídicos como proteínas, pigmentos,
antioxidantes y otros compuestos solubles en alcohol. Proporciones finales de disolvente
(contando el contenido de agua del tejido) son cloroformo: metanol: agua 8: 4: 3. Después
en reposo o centrifugación, los disolventes se separan en dos capas, con un compuesto no lipídico
componentes en la capa acuosa superior (C: M: H 2 O = 3:48:47) y lípidos en la parte inferior
capa orgánica (C: M: H 2 O = 86: 14: 1). Los lavados con agua sueltan algunos lípidos polares y
da como resultado la acumulación de una espuma proteolípida en la interfaz de fase (Folch y col. ,
1951 ). Esta capa de espuma se elimina y la producción de lípidos aumenta cuando la sal
los lavados reemplazan el agua.
Agregar cloroformo directamente a los tejidos a menudo conduce a aglutinamiento y agregación.
ción de proteínas y oclusiones de lípidos. Para evitarlo, Bligh y Dyer (1959)
tejido homogeneizado primero con metanol: cloroformo 2: 1 para romper el hidrógeno
uniendo redes y fuerzas electrostáticas entre lípidos y proteínas, luego
agregó más cloroformo para disolver los lípidos y completó el procedimiento con
lavados con agua. Las proporciones críticas de cloroformo: metanol: agua aquí son 1: 2: 0,8
para la primera etapa y 2: 2: 1.8 para la segunda etapa después de la adición de agua.
Ambos métodos se han aplicado extensamente tanto a tejidos vegetales como animales.
demandas con muchas modificaciones y, según se informa, también se han aplicado casi
indiscriminadamente a una amplia variedad de alimentos y materiales alimenticios a pesar de que
fueron diseñados para materiales con alto contenido de agua (por ejemplo,> 80%) con muy bajo nivel de lípidos (2%
lípido para Folch y 1% para Bligh-Dyer). "Según se informa" se utiliza aquí porque
El examen de las condiciones reales muestra que muchas extracciones enumeradas como una de
los dos clásicos son en realidad extracciones de cloroformo-metanol modificado y no
no siga las proporciones exactas del disolvente ni omita los lavados. Aplicación auténtica
de las condiciones verdaderas de Folch o Bligh-Dyer a materiales con composiciones exteriores
el rango objetivo requiere un ajuste del agua añadida, las cantidades de disolvente
y proporciones, o tamaño de la muestra para mantener la muestra requerida-solvente
proporciones y proporciones disolvente: agua. Incluso con ajustes, sin embargo, el
solvente - las proporciones de muestra de Folch / Bligh-Dyer se vuelven cada vez más ineficaces
ciente (es decir, menos del 100% de lípidos extraídos) a medida que el contenido de lípidos aumenta por encima del 2%,
con el grado de subestimación del contenido de lípidos que aumenta con el contenido de lípidos
del material (Iverson y col., 2001). Quizás los rendimientos no se consideran cuando
Las extracciones de Folch / Bligh-Dyer se aplican a alimentos con alto contenido de lípidos.
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Los procedimientos de Folch y Bligh-Dyer para extraer lípidos son básicamente tradicionales.
extracciones de cloroformo-metanol con lavados de agua o sal, principalmente para eliminar
contaminantes no lipídicos como carbohidratos y proteínas. Una alternativa para
limpiar extractos de alimentos mientras se elimina el agua e induce menos artefactos de oxidación
hechos es la filtración en columnas Sephadex G-25 (Wells y Dittmer, 1963 ). Sephadex
El G-25 se lava primero con ácido clorhídrico de alta pureza 1N (p. Ej., Baker Ultrex ™
o equivalente) para eliminar los metales contaminantes, luego se enjuaga tres veces con 18 MΩ
agua, se secó, y se envasa en una pipeta o una columna (lavado como se describe en Secció n
1.2.1). Los lípidos se cargan en el soporte y luego se eliminan selectivamente con disolventes.
en secuencia, como CHCl 3 : MeOH (19: 1) para eluir la mayoría de los lípidos, luego CHCl 3 : MeOH
(19: 1), saturado de agua, con ácido acético añadido para eluir gangliósidos y fosfato ácido.
phatides. Los materiales no lipídicos polares permanecen en la columna.
Al igual que con las extracciones de Folch / Bligh-Dyer, el manejo adicional requerido para
las columnas de Sephadex son una desventaja significativa para los análisis de oxidación de lípidos.
Es difícil evitar la exposición al aire (incluso con burbujeo de argón) y a la luz,
Las superficies en fase sólida inducen la oxidación y alteran las vías de oxidación (p. ej., ambas
Facilitar la formación de nuevos epóxidos y mejorar la descomposición de preformados.
epóxidos); sólo se pueden manipular unas pocas muestras simultáneamente. Sephadex se usa-
Útil para pequeños volúmenes de extracto, pero grandes volúmenes de extracto no se protegen fácilmente
contra la oxidación y modificación.
El procedimiento de limpieza que preferimos para minimizar la manipulación y los artefactos en los lípidos
Los análisis de oxidación eliminan el disolvente inicial al vacío seguido de redis-
disolviendo el extracto en cloroformo saturado de argón. Esto deja residuos
de almidón, proteínas, etc. aunque ocasionalmente retiene algunos pigmentos artificiales
y aditivos junto con las fracciones de lípidos en el cloroformo (estos pueden ser
detectado por cromatografía de capa fina o de alta presión). Lo más importante es
minimiza la manipulación y la oxidación accidental.
Las restricciones sobre el uso de disolventes clorados han estimulado el desarrollo de
mezclas de solventes alternativas que pueden funcionar con los procedimientos Bligh-Dyer. Una mezcla
de propan-2-ol-ciclohexano-agua (8:10:11 v / v / v) dio rendimiento de lípidos de mariscos
(solla, mejillón y arenque) que eran comparables al cloroformo: metanol pero
menos sensible a las proporciones de volumen de la fase de muestra ( Smedes, 1999). Heptano / etanol /
Las mezclas de agua / dodecilsulfato de sodio (SDS) dieron buenos rendimientos si el SDS
la tienda permaneció baja pero tendió a subextraer los fosfolípidos. Muy baja oxidación en
los extractos sugirieron que estos disolventes no extraían productos de oxidación de lípidos
( Undeland et al., 1998). Las mezclas de etanol-agua-hexano dieron rendimientos razonables
(80% de lo esperado) con microalga ( Fajardo et al., 2007 ). Hexano: isopropanol (3: 2
v / v) las mezclas no fueron muy efectivas, probablemente debido a la insolubilidad del hexano
en agua y pérdida de fracciones polares (Khor y Chan, 1985 ).
Esta sección no puede cerrarse sin enfatizar los problemas de la oxidación de lípidos en
extracciones. A pesar de su popularidad, las extracciones de Folch y Bligh-Dyer han
desventajas críticas para los puntos finales de oxidación. El agua induce la formación de liso-
lípidos y altas pérdidas de lípidos polares (incluidos los productos de oxidación) en el agua
fase, mejora la transformación de algunos productos de oxidación y facilita
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escisión de radicales alcoxilo. Los metales en las sales y el agua catalizan la oxidación de lípidos.
Quizás lo más importante es que es extremadamente difícil completar todo el manejo.
pasos bajo atmósfera inerte para que la oxidación accidental de lípidos pueda ser sustancial.
Como se señaló anteriormente, la pérdida de un pequeño porcentaje de los lípidos por oxidación es apenas visible
ible en los análisis de contenido y composición de lípidos, pero es desastroso cuando la extensión
de la oxidación de lípidos debe determinarse con precisión. Así, Folch y Bligh-Dyer
Las extracciones pueden ser apropiadas para estudios detallados del contenido de lípidos en tejidos cárnicos.
demandas o tejidos de frutas y hortalizas frescas, pero su aplicación estricta a procesados
alimentos o cuándo se medirá la oxidación lipídica de los extractos es cuestionable.
1.3.2.2 Métodos que aumentan la eficiencia de extracción

Al mismo tiempo que limita la oxidación de lípidos
Hasta ahora, todos los métodos de extracción descritos han aumentado la producción de lípidos, pero
planteó serios problemas para los análisis de oxidación de lípidos. ¿Hay alguna extracción?
métodos que no comprometen la estabilidad de los lípidos pero eliminan los lípidos de manera eficiente
de matrices complejas?
Extracción con solvente presurizado (también conocida como extracción acelerada con solvente)
ción [ASE]) es un método relativamente nuevo basado en los principios de supercrítica
extracción, pero utiliza disolventes en lugar de gases a presión. Sol presurizado
la extracción de respiraderos carece de la base de experiencia y el desarrollo metodológico de
las otras tcnicas, pero ofrece protecciones y condiciones que, en la experiencia
la opinión y la opinión de este autor, lo convierten en el método de elección para la oxidación de lípidos
análisis. Para aumentar la permeación del solvente en la muestra, los solventes desgasificados
se aplican a la muestra en celdas de acero inoxidable selladas bajo presión (típicamente
aproximadamente 1500 psi) y temperatura elevada. La temperatura elevada disminuye la sol-
Ventile la viscosidad, lo que facilita que la presión fuerce el solvente a través
incluso matrices moleculares densas. La eficiencia de extracción se incrementa aún más por
combinando pasos estáticos y dinámicos. En extracciones estáticas, el disolvente se mantiene bajo
presión en contacto con la muestra durante períodos de tiempo seleccionados para forzar el disolvente
a través de la matriz molecular para llegar a los lípidos y disolverlos. Extracciones dinámicas
Luego, haga fluir solvente nuevo continuamente a través de la muestra para eliminar el
lípidos o lípidos extraídos en pasos estáticos previos. Extracciones estáticas y dinámicas
pueden vincularse en muchas combinaciones y con ciclos repetidos para adaptar el pro-
acceso a composiciones y estructuras específicas de los alimentos (Singleton y Stikeleather ,
1999; Mendiola y col., 2007; Herraro et al., 2013).
La extracción con solvente presurizado ofrece una serie de ventajas para la oxidación de lípidos.
análisis en alimentos porque limita la manipulación al tiempo que facilita la eliminación de lípidos
a partir de matrices complejas sin tratamientos extremos. Extracciones estáticas (períodos
donde el solvente se mantiene en contacto con los alimentos) use presión para impulsar el solvente en el
matriz de alimentos para disolver los lípidos, luego los pasos de extracción dinámica lavan el líquido disuelto
lípidos en matraces de recolección. El tiempo, la temperatura y la presión de extracción estática
ciones, el volumen de extracciones dinámicas y el número de ciclos de extracción se pueden
variada para optimizar la eliminación de lípidos de diferentes tipos de materiales. De hecho, estos
los ajustes son obligatorios para la extracción total de lípidos. Las muestras están selladas en
células protegidas de la luz y presurizadas bajo gas inerte, los disolventes utilizados
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se desgasifican y se pueden extraer un gran número de muestras (p. ej., hasta 24)
en una sola operación programada. Normalmente, las extracciones se pueden completar en
15-30 min por muestra, pero se puede ampliar cuando sea necesario.
Al probar una amplia gama de matrices alimentarias, hemos encontrado que si la temperatura de extracción
La temperatura está limitada a 40 ° C, los lípidos se pueden extraer con una oxidación mínima mínima.
y sin descomposición de hidroperóxido (Yao y Schaich, 2014 ). Sol presurizado
La extracción de ventilación a menudo elimina la necesidad de digestiones de matriz por amilasas (p. ej.,
productos de cereales extruidos) y proteasas (productos a base de carne), aunque moliendo
de muestras a un tamaño de partícula de aproximadamente 250 μm todavía es necesario para permitir un solvente eficiente
penetración. Múltiples pasos de extracción con diferentes condiciones (p. Ej., Solvente) pueden
ser programado y controlado automáticamente para extraer fracciones específicas. Extractos
se puede recolectar por separado con secuencias de diferentes disolventes para cada clase individual
análisis o combinados para ensayos de lípidos totales. Tierra de diatomeas de alta pureza
en una forma expandida especial (disponible comercialmente como Hydromatrix ™) se dispersa
muestras para permitir un acceso más eficiente a los disolventes y se unen al agua y al agua
contaminantes, lo que reduce los pasos de limpieza. Volúmenes de disolvente sustancialmente más bajos
son necesarios que otros métodos de extracción. Claramente, el costo del equipo de capital es un
impedimento para adaptar esta metodología, pero los extractos son mucho más limpios
y mucho más fácil de obtener que recomendamos la extracción con solvente presurizado como
el método de elección para el análisis de oxidación de lípidos de la mayoría de los materiales alimenticios.
Como desventaja, la extracción con solvente presurizado es relativamente nueva, por lo que la guía
Las líneas para extraer lípidos de una amplia gama de materiales aún no están disponibles.
aún. Cada matriz y composición de lípidos es diferente, por lo que un disolvente y un
condiciones de extracción - disolvente, tiempo estático, número de ciclos, temperatura -
debe determinarse para cada material. Sin embargo, una vez que los procedimientos se optimizan
pueden automatizarse extracciones eficientes y optimizadas.
Ejemplos de extracciones de lípidos exitosas mediante extracción con solvente presurizado
que mostraron rendimientos de lípidos comparables o mejores que otros métodos estándar
incluyen alimentos para mascotas horneados y extruidos ( Yao y Schaich, 2014 ), maíz molido
granos y copos de avena recién molida ( Moreau et al., 2003 ), tejido de pescado ( Dodds
et al., 2004 ); cereal, yema de huevo y músculo de pechuga de pollo (Schäfer, 1998); poul-
probar carne ( Toschi et al., 2003 ): y harina de maní (Singleton y Stikeleather ,
1999 ). El método debe probarse con productos de emulsión como marga-
rines y mayonesa.
1.4 ANÁLISIS QUÍMICOS DE PRODUCTOS DE OXIDACIÓN

EN ACEITES Y EXTRACTOS
La "carne y las patatas" de los análisis de oxidación de lípidos son, por supuesto, la química
ensayos para clases individuales de productos. Mientras que los CD y los hidroperóxidos son
ensayados casi universalmente, los productos secundarios se siguen de forma variable o no en
todo, al menos en parte porque los ensayos que son sensibles, cuantitativos y fáciles de
mango no están disponibles. Otro dilema es qué ensayo utilizar.
Una consecuencia de las vías alternativas competitivas que se muestran en la Figura 1.2 es
que no se puede garantizar que uno o dos ensayos proporcionen una imagen precisa de
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oxidación. Existe un riesgo muy alto de subestimar la oxidación o de perder

oxidación en conjunto, si se analiza una vía inactiva o degradada. Esto es
especialmente crítico cuando las decisiones de descarte se toman basadas en el seguimiento de resultados
oxidación en líneas de producción o durante el almacenamiento.
Ha pasado el tiempo para definir la oxidación por niveles establecidos de un solo producto. Tenemos
Probaron muestras que estaban amarillentas y olían muy mal pero mostraban un nivel bajo de peróxido
valores (PV) y poco o nada de hexanal, pero tenían niveles de epóxido muy altos. En metilo
linoleato, los carbonilos totales permanecen bajos pero a menudo cambian en la distribución de
aldehídos con diferentes condiciones de oxidación, alterando los impactos y el potencial de los olores
para reacciones secundarias (Xie, 2015 ). Estudios de aceites oxidados a temperatura ambiente.
tura versus almacenamiento acelerado (60 ° C) versus temperaturas de fritura (150-180 ° C)
mostraron mecanismos de reacción y patrones de productos muy diferentes ( Qin, 2011; Repk o
Reader, 2013; Tian, 2013; Bogusz, 2015; Xie, 2015 ). Por lo tanto, ningún ensayo individual
reflejan con precisión las diferencias en la química que ocurren en las tres condiciones.
Más bien, necesitamos adoptar un nuevo paradigma analítico en el que múltiples productos
Los productos se analizan con el mayor detalle posible. Como mínimo, CD, hidro-
peróxidos, epóxidos, carbonilos totales y, con suerte, también alcoholes deben ser
monitoreado solo para rastrear la actividad en vías alternas. Aún mejor es determinante
productos individuales dentro de clases, tales como posiciones de hidroperóxidos y
epóxidos y aldehídos específicos. Esta información es más que académica.
interesar. Los análisis consistentes con este nivel de detalle comenzarán a desarrollar un
base de patrones de oxidación más precisos que pueden explicar el deterioro de la producción
mejorar la calidad y sugerir puntos clave para la intervención.
Proporcionar algunas pautas para comprender los diversos ensayos y para
desarrollo de combinaciones efectivas de análisis de oxidación, esta sección cubrirá
principios, ventajas, desventajas y limitaciones, y aplicaciones de los ensayos
para clases individuales de productos. Los protocolos detallados están disponibles en numerosos
recursos en otros lugares, como Wrolstad y col. (2005) , los Métodos en Molecular
Serie de biología y métodos estándar de AOCS, AOAC e IUPAC.
1.4.1 Dienos conjugados
Principio de análisis . Los lípidos no tienen cromóforos innatos para la detección óptica.
Sin embargo, la formación de radicales en ácidos grasos poliinsaturados (ácido linoleico y
arriba) provoca un cambio en la posición del doble enlace, convirtiendo no conjugado en conjugado
ácidos grasos jugadosReacción (1) ):
–CH = CH – CH 2 –CH = CH– –CH = CH – CH = CH – C • H– y –C • H – CH = CH – CH = CH– (1)
Por tanto, las CD son el primer marcador químico de oxidación relativamente estable en
ácidos grasos poliinsaturados ( Parr y Swoboda, 1976). Debido a la resonancia,
Los ácidos grasos conjugados absorben la luz ultravioleta en el rango de 231 a 235 nm. En general,
La longitud de onda de máxima absorción para CD aumenta con la longitud de la cadena y
disminuye con la conversión de dobles enlaces a configuración trans : ∼235 nm para
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cis-cis , ∼233 nm para cis-trans , trans-cis y ∼231 para trans-trans ( Recknagel y

Glende, 1984 ). Puede haber interferencia de componentes no lipídicos que absorben cerca
233 nm, especialmente fenoles antioxidantes (Gruszka y col., 2008 ; Hornero- Ménde z
et al., 2001; Dobarganes y Velasco, 2002; Frankel, 2005b), por lo que la absorción inespecífica
bance (como se muestra por muy alta absorbancia) a veces se corrige midiendo
relación de absorbancia a 233 y 215 nm (índice de oxidación) ( Klein, 1970 ).
Los procedimientos estandarizados (método AOCS Ti 1a-64) informan los CD como porcentaje
peso de lípidos para eliminar las diferencias en la composición de lípidos:
% CD = 0 . 84 [( A s / bc ) - k 0 ]
donde A s es la absorbancia de la muestra a 234 nm, b es la longitud de la cubeta en cm, c es

el peso de la muestra de lípidos (g / L) en la mezcla de reacción final, y k 0 es la absorción
actividad por ácidos (0.03) y ésteres (0.07). El factor 0,84 no está definido. Sin emabargo,
este método para informar CD está bastante desactualizado.
Para el balance de masa con otros productos, la concentración de CD también se puede calcular
culado sobre una base molar de la ley de Beer utilizando coeficientes de extinción conocidos
(ε molar = 29,500 para iso-octano, 28,000 para etanol, 25,200 para ciclohexano,
y 30.000 para tetracianoetileno) y normalizando a moles de lípidos analizados
( Tian, 2013; Xie, 2015). Cuando se estudia un solo aceite, comparaciones directas
de las molaridades de CD se pueden hacer porque la densidad de las muestras de aceite es constante.
Las densidades de la mayoría de los aceites vegetales son lo suficientemente parecidas (0,91-0,94) que varían
En las concentraciones de CD se produce a nivel submicromolar si las variaciones en
se ignoran las densidades. Por lo tanto, las comparaciones generales generalmente se pueden hacer con:
ajustes. Sin embargo, cuando las diferencias detalladas entre las muestras deben ser
determinada, la molaridad CD determinada a partir de los cálculos de la ley de Beer debe ser
corregido por diferencias de densidad entre aceites (Reacción (2)):
(Absorbancia 234 nm / ε) ∗ Rxn vol (ml) dienos conjugados mmol

=
Volumen de muestra de aceite (ml) ∗ densidad de aceite (g / ml) mol de lípidos (2)
Peso mol de aceite o ácido graso
donde ε es el coeficiente de extinción (absortividad molar) en L / (mol cm) para el

disolvente que se está utilizando.
Los trienos conjugados se forman en ácidos grasos poliinsaturados superiores durante
etapas de oxidación por oxidación simultánea en ambos extremos (C9 y C16) de
ácido linolénico y por reducción de hidroperóxidos a alcoholes seguido de deshidratación
la draciónReacción (3)).
–CH 2 –CH – CH = CH – CH = CH–

-e - –CH 2 –CH – CH = CH – CH = CH–
OH
OH
–CH 2 –CH – CH = CH – CH = CH–
(3)
-H 2 O
O
–CH = CH – CH = CH – CH = CH–
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Los trienos conjugados se detectan a 268-275 nm (Fishwick y Swoboda ,

1977). Nota: los carbonilos también absorben en este rango, por lo que la absorbancia no debe ser
interpretados como trienos conjugados sin verificación secundaria de estructura.
Ventajas . Al ser el primer producto transformado, los CD son buenos indicadores
de iniciación y oxidación temprana en lípidos poliinsaturados, y son buenos
marcadores para el siguiente inicio y progresión de la oxidación de forma continua, como
en pruebas de antioxidantes. Los CD son quizás el ensayo más simple para la oxidación de lípidos.
los lípidos se disuelven en disolvente y la absorbancia se lee a ~ 234 nm.
Desventajas y precauciones . El "pico" de los CD suele ser solo un hombro
para lo cual es difícil determinar la absorbancia máxima real. Absorbancia
a 234 nm se utiliza como promedio y se registra principalmente de memoria sin
comió espacios en blanco y correcciones. Muchos solventes y contaminantes se absorben en los rayos UV.
rango, por lo que deben usarse solventes de alta pureza para minimizar la absorción de fondo
bance, y la absorbancia debe registrarse en el rango de 210 a 250 nm para cada conjunto
de muestras para verificar que existe un pico auténtico entre 230 y 235 nm. Esto
es particularmente importante para los extractos que pueden contener fenólicos o carotenoides
antioxidantes, como se señaló anteriormente.
Corongiu y Milia (1983) han demostrado que convertir la absorción
curva en su segunda derivada da una determinación más precisa de la real
cima. Esto, a su vez, puede mejorar la diferenciación de las especies de dieno al mismo tiempo que
aumentando la precisión de los análisis. Derivatizar espectros es simple con contem-
instrumentación poraria y capacidades informáticas, por lo que la incorporación de esta modificación
cación en análisis estándar merece una atención seria.
Las estructuras de CD se retienen en los hidroperóxidos, pero no cuando los epóxidos,
Se forman productos de escisión o escisión. Por lo tanto, este ensayo se vuelve más inexacto.
como marcador único a medida que avanza la oxidación, y debe usarse con precaución
como medida cuantitativa en análisis puntuales de productos, como la comprobación de oxidación
ción de alimentos almacenados. Del mismo modo, los CD no son una medida cuantitativa precisa
de degradación térmica, donde las escisiones térmicas son una fuerza impulsora importante y
los hidroperóxidos y otros productos se transforman rápidamente. Para evitar malentendidos
Previendo niveles bajos de CD, este ensayo debe combinarse con medidas de otros
productos en la mayoría de las aplicaciones.
La oxidación continúa y los CD se transforman incluso durante el análisis, por lo que el manejo
El rociado debe minimizarse, los solventes deben rociarse con argón antes de agregar
lípidos, y las muestras deben mezclarse individualmente y analizarse inmediatamente. Lote
los análisis no son factibles.
Los volúmenes de lípidos y disolventes especificados en AOCS Ti 1a-64 (70–100 mg
y 75 mL de isooctano, respectivamente), diseñado principalmente para calidad industrial
laboratorios de control, deben estar micronizados para laborato-
Riesgos en los que sólo se dispone de muestras pequeñas y el uso de disolventes debe ser limitado.
AOCS Ti 1a-64 también especifica pesar, disolver, calentar, enfriar y
diluir muestras de lípidos. La oxidación progresiva es muy difícil de controlar bajo
estas condiciones. Se ofrece una mejor protección si las muestras de aceite (generalmente de 10 a 30 μL)
dependiendo del grado de oxidación) se pipetean directamente en argón saturado
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solvente, mezclado por inversión, y la absorbancia se mide inmediatamente. Resultados

se puede convertir fácilmente en lípidos utilizando la densidad del aceite. Extractos que se secan
y pesado después de la eliminación del solvente se puede analizar directamente agregando 10 mL
iso-octano saturado de argón al matraz evaporador, girando para disolver el lípido
residuo y análisis inmediato; los resultados se calculan en función del peso.
Se puede argumentar que el pipeteo de muestras de aceite conduce a inexactitudes y variabilidad.
de entrega de muestra inconsistente. Sin embargo, las puntas de pipeta de baja retención mejoran
precisión de pipeteo y más que contrarrestar la oxidación accidental causada
por exceso de manipulación.
Los análisis pueden ser lentos porque se requieren costosas cubetas de cuarzo. La mayoría
Los laboratorios tienen solo unos pocos, y estos deben limpiarse y secarse a fondo
entre muestras.
Aplicaciones . El ensayo solo se puede utilizar con ácidos grasos que contengan dos o
más dobles enlaces: no es aplicable a los aceites monoinsaturados. De lo contrario,
Los CD se analizan de forma rutinaria como marcadores tempranos en la mayoría de los aceites y extractos de lípidos. CD
se puede analizar fácilmente en emulsiones si primero se separan las fases de agua y aceite,
como por extracción con disolvente, centrifugación, congelación (Alemán et al., 2015 ),
o liofilización (Belhaj et al., 2010 ). Sin embargo, también se ha informado que
Las emulsiones diluidas de aceite en agua se pueden analizar directamente registrando los espectros de
200 a 300 nm y análisis de segundas derivadas con mínimo parcial multivariante
quimiometría de cuadradosBaron y col., 1997). El problema principal en todas las aplicaciones es
Limitar o eliminar el fondo y las interferencias mediante la resta de la computadora de
controles de reactivos y muestras, limpieza de muestras, etc.
1.4.2 Hidroperóxidos
Los hidroperóxidos se consideran el primer producto estable en la oxidación de lípidos.

por lo que son la medida más prevalente de oxidación de lípidos experimentalmente y
son el producto mejor entendido cuantitativamente. De hecho, los PV2 se han corregido
con respuesta sensorial, y se ha desarrollado una escala de "aceptabilidad"
donde los aceites frescos tienen PV <1, los valores de corte para uso industrial son 5 y los aceites
con 10 mEq de hidroperóxido / kg de lípidos se consideran rancios y rechazados por el gusto
Paneles Aun así, debe subrayarse que los hidroperóxidos por sí solos no pueden
evaluar el nivel real de oxidación de lípidos en un aceite o extracto. Los PV bajos pueden indicar
Se ha producido poca oxidación, pero también se producen en oxidación activa cuando
Los hidroperóxidos se descomponen en otros productos ( Figura 1.1 ), como en
temperaturas o en luz ultravioleta, y cuando los radicales peroxilo generan otros productos
en paralelo o con preferencia a los hidroperóxidos (Figura 1.2). Por otro lado, dis-
VP proporcionalmente altos pueden resultar cuando los hidroperóxidos se estabilizan, como
2. Los valores de peróxido se han expresado de diversas formas como miliequivalentes de oxígeno o hidro-
peróxidos por kg de grasa. Las concentraciones de hidroperóxido determinadas a partir de curvas estándar son casi
siempre en molaridad. Por lo tanto, la base para los cálculos debe especificarse ya que los equivalentes de oxígeno son
dos veces la molaridad del hidroperóxido.
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por bajas temperaturas o enlaces de hidrógeno a antioxidantes fenólicos. Por lo tanto, en un

mínimo, deben medirse hidroperóxidos, CD, epóxidos y carbonilos.
Ya se encuentran disponibles ensayos sensibles para todos estos productos.
Los ensayos de hidroperóxido se probaron en detalle para determinar la precisión química, requerida
manipulación, reproducibilidad y sensibilidad. Evaluación detallada de estos ensayos
se puede encontrar en Steltzer (2012) . Solo información general y pautas para
los más utilizados se proporcionan aquí.
1.4.2.1 Valoración yodométrica (AOCS Cd 8–53)

Principio de análisis . El yoduro de potasio, KI, se disocia en una solución ácida saturada.
ción para proporcionar una fuente de electrones (Reacción (4)), que luego reducen los lípidos
hidroperóxidos (LOOH) a derivados de hidroxilo (LOH) (Reacción (5)) ( Pokorný ,
2005 ). En la reacción neta (Reacción (6)), la reducción de un LOOH libera un I 2 :
2KI ↔ 2K++2I- ↔ Yo 2 + 2 e - (4)
LOOH + 2 H + + 2e - ↔ LOH + H 2 O (5)

almidón
LOOH + 2 H + + 2 KI → I 2 + LOH + H 2 O + 2 K + → almidón-I 2 (6)
(claro) (amarillo) (púrpura)
El I 2 liberado se cuantifica luego mediante titulación compleximétrica con sodio.

tiosulfato ( Reacción (7) ).
Yo 2 + 2 Na 2 S 2 O 3 → Na 2 S 4 O 6 + 2 NaI (7)
(amarillo) (incoloro)
En la práctica, el lípido se disuelve en [cloroformo o iso-octano]: ácido acético 3: 2

v / vy se añade KI para la reacción. Se agrega agua para detener la reacción y extraer
el yodo molecular en una fase acuosa para valoración con tiosulfato de sodio.
El almidón agregado como indicador durante la titulación forma un complejo azul-violeta con
Moléculas de yodo libre. La transición de púrpura a transparente marca el punto final del
reacción cuando todo el yodo ha reaccionado (Skoog y col., 1996).
Ventajas . Aunque este ensayo ha sido muy difamado, es el único
ensayo de peróxido que hemos probado que es químicamente exacto y absolutamente cuantitativo
tivo, dependiente enteramente de la funcionalidad del peróxido e independiente del grupo R
de los hidroperóxidosSteltzer, 2012). Debido a esta precisión, la titulación yodométrica
se ha recomendado para la cuantificación primaria de los estándares de hidroperóxido utilizados
en otros ensayos (Gay y col., 1999b). La titulación yodométrica es también el único ensayo que puede
manejar lípidos altamente oxidados, y se puede realizar incluso en laboratorios mínimos,
requiriendo sólo un suministro de gas inerte, un buen agitador magnético y una bureta.
Limitaciones y precauciones . La titulación yodométrica tiene dos limitaciones principales:
baja sensibilidad (detección mínima de aproximadamente 0,5 mEq / kg de lípidos) y difícil manipulación.
El ensayo es notoriamente "empírico", que requiere un cuidado especial y condiciones exactas para
producir resultados reproducibles. Sin embargo, hemos descubierto que cuando se presta atención
a la química de la reacción, esta titulación tiene buena reproducibilidad y logra
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las medidas más precisas y absolutamente cuantitativas de hidroperóxidos (Steltzer ,

2012). Se requiere una escrupulosa remoción de oxígeno para prevenir la oxidación de I - y generar
ación de VP erróneamente altos (Mehlenbacher, 1960). Esto se puede lograr mediante
rociar abundantemente los disolventes con argón antes de la reacción y mantener el argón activo
burbujeo a lo largo de la titulación. La reacción debe tener lugar en la oscuridad o en
luz diurna difusa para evitar la descomposición de hidroperóxidos (Pokorný, 2005). La
la reacción tiene dos fases inmiscibles: lípidos en cloroformo (o isooctano): metanol
y yoduro de potasio en ácido acético diluido. Para que ocurra una reacción con iones de yoduro,
los hidroperóxidos deben dividirse de la fase orgánica a la acuosa, y esta
requiere agitación o agitación activa (por ejemplo, agitación magnética). Un suave remolino de manos es
inadecuado (Steltzer, 2012). Adsorción o adición de yodo a enlaces insaturados
de ácidos grasos, que disminuye los PV, puede evitarse mediante una titulación rápida.
Los requisitos de titulación y manipulación especial hacen que este ensayo sea algo
tedioso y requiere mucho tiempo, por lo que un gran número de muestras es difícil
manejar. Los autotitradores pueden facilitar un alto rendimiento, pero el burbujeo de argón, activo
Se debe mantener la agitación y la protección de la luz.
El factor más limitante de la sensibilidad de esta reacción es la dificultad para visualizar visualmente
tinguir el cambio de color marcando la determinación del punto final real. El morado
el color se desvanece gradualmente en muchos tonos en lugar de colorearse para aclararse instantáneamente,
por lo que las reacciones a menudo se sobrevaloran. La detección visual del punto final puede oscurecerse por completo.
junto con extractos o lípidos coloreados. Como alternativa, la titulación potenciométrica puede
elimine las conjeturas de la detección del punto final y reduzca la concentración detectable
ción de peróxidos a nanoequivalentes ( Hara y Totani, 1988; Oishi et al., 1992),
aunque los requisitos de desaireación aquí son incluso más rígidos que para el estándar
ensayoOette y col., 1963). Sin embargo, dada la precisión química de la reacción de KI
ción con hidroperóxidos y la sensibilidad mucho mayor de la electroquímica
endpoints, esta detección de endpoints ciertamente merece más atención.
Finalmente, se ha afirmado que se requieren grandes muestras. Si sigue el
método AOCS estándar, se recomiendan 5 g de muestra para PV <5, y aproximadamente
1 g de muestra para PV> 10 solo para poder ver el punto final con claridad. Sin emabargo,
Se analizan de forma rutinaria cantidades más pequeñas de lípidos con procedimientos estándar,
especialmente en los laboratorios de investigación, y el método sigue siendo válido ( Crowe y
White, 2001 ). Las pautas generales para las cantidades de lípidos requeridas se dan en
Cuadro 1.3 ( Wrolstad et al., 2005). Se requieren menos de 10 mg de lípidos cuando el potencial
se utilizan puntos finales tiométricos (Hara y Totani, 1988).
Aplicaciones . Este es el único ensayo que puede detectar altas concentraciones de
hidroperóxidos con precisión sin dilución. Es igualmente aplicable a los aceites,
extractos, reactivos, disolventes e hidroperóxidos puros estándar siempre que
Se siguen las precauciones descritas anteriormente.
1.4.2.2 Xylenol Orange (XO)

Principio de análisis . El ensayo XO (o FOX) se desarrolló para aumentar en gran medida
niveles de detección de hidroperóxido, reducir los requisitos de tamaño de la muestra y eliminar
nte la sensibilidad al oxígeno en los análisis de tejidos biológicos ( Jiang et al., 1991;
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TABLA 1.3 Requisitos de la muestra (extracto de aceite o lípido)
para la valoración yodométrica de hidroperóxidos lipídicos
Valor esperado de peróxido
(mEq de O 2 activo / kg de lípido) Peso Lípido requerido (g)
0-2 5
2-10 2
10-25 1
25–50 0,5
50-100 0,3
De Wrolstad y col. (2005); utilizado con permiso.
Gay y col., 1999a). Los iones ferrosos en un medio ácido reducen los hidroperóxidos
( Reacción (8) ), y los iones férricos resultantes se complejan con el colorante XO para producir
producir un complejo azul-violeta que tiene un máximo de absorbancia a 550-600 nm
( Reacción (9)) ( Wolff, 1994; Gay et al., 1999b ).
ROOH + Fe 2+ → Fe 3+ + RO • + - OH (8)
Fe 3+ + XO → (Fe 3+ … XO) complejo (9)
Las concentraciones de hidroperóxido se determinan mediante la comparación de la absorbancia.

valores a una curva estándar y normalización al peso de lípidos en la muestra.
Se utilizan dos procedimientos para el ensayo Fe 3+ -XO (o FOX). FOX1 es un agua-
versión soluble que contiene sorbitol como potenciador de la reacción (Wolff, 1994 ); es
utilizado con proteínas y otros hidroperóxidos no lipídicos. Una segunda versión (FOX2)
omite el sorbitol y agrega hidroxitolueno butilado (BHT) y metanol (Wolff ,
1994 ) para la detección de hidroperóxidos lipídicos. Varias variaciones que utilizan diferentes
Se han desarrollado diferentes disolventes para solubilizar lípidos.
Ventajas . El ensayo XO tiene una alta sensibilidad, detectando nanomolar a
niveles micromolares de hidroperóxidos en muestras muy pequeñas de aceite o extracto
(normalmente 25 μL diluido) (Steltzer, 2012 ). Es un ensayo simple de configurar, más grande
cantidades de muestras pueden manipularse en lotes, los tubos de ensayo desechables pueden
utilizado, y el ensayo es adaptable a lectores de placas para un alto rendimiento. El ensayo
está disponible en kits comerciales de varias empresas.
Limitaciones y precauciones . Cuantificación absoluta de hidroperóxidos tales
ya que el obtenido con titulaciones yodométricas no es posible porque los ensayos con
La detección óptica depende de coeficientes de extinción precisos o de la comparación con
curvas estándar para cuantificación. Desafortunadamente, los coeficientes de extinción no varían
sólo con el sistema de reacción (proporciones de disolvente y reactivo) pero también con
el hidroperóxido que se analiza, como se muestra en la Tabla 1.4 ( Gay et al., 1999b ;
Bou et al., 2008 ). Ahora se ha demostrado en numerosos estudios que las respuestas
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TABLA 1.4 Variación en el coeficiente de extinción de xilenol naranja con

Fuente comercial, estructura de hidroperóxido y disolvente; A no ser que
Observado de lo contrario, medido a 560 nm
ε (mol / (L cm)) Naranja de xilenol Fuentea
Hidroperóxido Solvente Sin especificar Sigma Aldrich
Sulfato férrico b 25 mmol / L 13.400

H 2 SO 4
Nitrato férrico c 50 mmol / L 26,600

HClO 4
Cloruro férrico 25 mmol / L 15.000
H 2 SO 4
H2O2 25 mmol / L 43.000, 45.600, 44.000 34,360

H 2 SO 4 45.000
H 2 O 2B 25 mmol / L 26.800
H 2 SO 4
H2O2 50% acético 59.800 45,360

ácido
Cumeno-OOH 25 mmol / L 43.000 99,300 79.000

H 2 SO 4
50% acético 116.200 88,750

ácido
t -butil-OOH 25 mmol / L 43.000 98.000 78,900

H 2 SO 4
50% acético 115,700 84,500

ácido
Ácido linoleico-OOH 25 mmol / L 47.000 60.000 44.000

H 2 SO 4 /90%
MeOH
LDL-OOH 25 mmol / L 43.000

H 2 SO 4 /90%
MeOH
Lipoproteínas 25 mmol / L 45.000

H 2 SO 4
Grasas 25 mmol / L 45.000

H 2 SO 4
a Las dos empresas químicas enumeradas se han fusionado desde la publicación inicial de estos datos. No lo es
claro qué producto se comercializa actualmente, pero las diferencias en el coeficiente de extinción enumeradas ilustran
las inexactitudes que pueden introducirse cuando los valores ε publicados se aplican indiscriminadamente a todos
sistemas. Se deben ejecutar curvas estándar para cada lote de naranja de xilenol y cada sistema de analitos.
b Medido a 540 nm.
c Medido a 550 nm.
Extraído de Gay y col. (1999b).
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varían con la estructura del hidroperóxido y con el lote y la fuente de XO. Por lo tanto,
Deben generarse curvas estándar separadas para las condiciones específicas de cada
sistema de prueba y cada lote de tinte. Los hidroperóxidos estándar deben cuantificarse
independientemente por titulación yodométrica antes de trazar las curvas de cuantificación.
En la medida de lo posible, el uso de estándares de hidroperóxido de lípidos generados a partir de lipoxi
genasa y estandarizados por titulación yodométrica son preferibles al hidrogenocumeno
peróxido. Cuando los hidroperóxidos estándar que coinciden con los componentes del complejo
Los sistemas no se pueden sintetizar o no están disponibles comercialmente, los resultados deben
expresarse como equivalentes del estándar de hidroperóxido utilizado (excepto que el H 2 O 2 es
no es un buen partido para los lípidos) ( Gay et al., 1999b).
Una segunda limitación importante es que la estequiometría de la reacción y la precisión
La cuantificación se complican por reacciones secundarias de los radicales alcoxilo.
cal con solventes. Estequiometría normal de reacciones de hidroperóxido con XO
debe haber 2 mol de hierro oxidado por mol de hidroperóxido; variación de esto
el valor indica la participación de reacciones adicionales. H 2 O 2 , cumeno y t -butilo
cada uno de los hidroperóxidos tiene reacciones de interferencia que producen diferentes estequiomas
etry y hacerlos estándares menos que óptimos para los hidroperóxidos de lípidos (Gay
et al., 1999b). H 2 O 2 da una estequiometría de reacción de aproximadamente 2,5 porque el
Los radicales hidroxilo generados a partir de la reducción de H 2 O 2 reaccionan con XO, produciendo una
segunda especie que oxida Fe 2+ .
Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + HO • + HO - (10)
HO • + XO HOXO • (11)
HOXO
•
+ Fe 2+ HOXO - + Fe 3+ (12)
HO • + Fe 2+ Fe 3+ + OH - (13)
Los hidroperóxidos de cumeno y t -butilo exhiben estequiometrías de aproximadamente 5 en ambos

acuosoGay et al., 1999b ) y lipofílico (Steltzer, 2012) reacciones porque
Ambos hidroperóxidos se descomponen en radicales metilo, que se oxidan a más
radicales que también participan en el análisis.
También se ha informado de estequiometría superior a 2 para hidroperóxidos lipídicos.
( Yildiz et al., 2003; Osawa et al., 2007; Steltzer, 2012 ) y muy probablemente resulte de
contribuciones secundarias de radicales solventes generados por la reacción de radicales alcoxilo lipídico
ciones. La variación en los VP medidos entre los estudios surge en parte de las diferencias en
disolventes utilizados para solubilizar los lípidos que se están probando. Diferencias en la reactividad del solvente
Los radicales y la presencia de hidroperóxidos solventes preformados contribuyen a los PV
observado. Por lo tanto, es fundamental probar los blancos de solvente para cada ejecución y restar estos
a partir de valores experimentales de muestra. Además, dado que no es posible determinar
estequiometría de analitos con estructuras y niveles de hidroperóxido desconocidos,
Osawa y col. (2007) han recomendado el uso de "factores de ajuste" para eliminar
variaciones de estequiometría normalizando cada sistema a titulación yodométrica, es decir, para
cada experimento, analice algunas muestras con ambos métodos para determinar la proporción
racionalidad entre los dos y aplicar este factor a todos los análisis de ese sistema.
Página 33
El ensayo XO es sensible al oxígeno, que oxida los iones ferrosos y forma

nuevos peróxidos de cualquier radical secundario generado durante las reacciones
( Kolthoff y Medalia, 1949, 1951; Mihaljevic et al., 1996; Steltzer, 2012 ).
Por tanto, la reacción debe realizarse con todas las soluciones rociadas cuidadosamente con argón.
De manera similar, el hierro ferroso reactivo se oxida con el tiempo, por lo que los espacios en blanco del hierro reactivo necesitan
que se ejecutará con cada análisis.
La luz no tiene efecto sobre el XO o el hierro, pero los hidroperóxidos se descomponen bajo
Luz ultravioleta, dando dos radicales (LOOH → LO • + • OH) en lugar del LO •
generado por reducción de hierro. Hemos encontrado resultados más consistentes y más
estequiometría precisa cuando las reacciones se mantuvieron en la oscuridad hasta que ópticas
análisis.
Quizás el problema más insidioso del ensayo cuando se trabaja con
análisis de alimentos es que a altos niveles de oxidación, el exceso de hidroperóxidos reacciona
con el complejo XO – Fe y decolorar el color (Steltzer, 2012). Esta lejía
ing explica las observaciones de que los resultados de XO son comparables a la titulación yodométrica
ciones en concentraciones muy bajas de hidroperóxido, pero cada vez más divergen a medida que
las concentraciones aumentanOsawa et al., 2007). Si los analistas no tienen conocimiento de esto
potencial, las absorbancias bajas pueden malinterpretarse mucho y la oxidación
subestimado. Cuando las muestras tienen lecturas de absorbancia muy bajas, el blanqueador
Los niveles bajos de peróxido pueden distinguirse de los niveles bajos de peróxido diluyendo la secuencia de muestras.
tialmente y volviendo a analizar. El aumento de la absorbancia con la dilución de la muestra indica
blanqueamiento de altos niveles de hidroperóxidos, en cuyo caso el ensayo debe
realizarse con muestras más pequeñas o diluciones más altas de aceites originales o
extractos.
Bou ha revisado una amplia gama de factores que afectan el desempeño del XO
reacciónBou et al., 2008 ).
Aplicaciones . El ensayo XO se ha utilizado para determinar hidroperóxidos.
en una amplia gama de sistemas, incluidos los aceites ( Nourooz-Zadeh et al., 1995; Yildi z
et al., 2003; Tian, 2013); extractos de lípidos de plantas, alimentos y materiales alimenticios
als ( Hermes-Lima et al., 1995; Grau et al., 2000; DeLong et al., 2002; Nava s
et al., 2004); fosfolípidos en solución, liposomas, lipoproteínas de baja densidad y
membranasJiang y col., 1991; Yin y Porter, 2003; Fukuzawa y col., 2006);
y fluidos biológicos (Södergren y col., 1998; Banerjee et al., 2004). Es aplicable
cable a cualquier muestra con bajos niveles de oxidación siempre que se indiquen las precauciones
se siguen los anteriores. No es útil incluso para lípidos moderadamente oxidados sin
dilución extensa.
Comentarios sobre dos kits disponibles comercialmente . Lo hemos encontrado sobremanera
Es difícil ejecutar ensayos de XO directamente desde reactivos independientes, debido en parte a las diferencias
diferencias en XO de diferentes fuentes y en parte a la omnipresente contaminación de hierro
ción en todos los reactivos, particularmente ácidos. Los kits proporcionan estandarización de reactivos
que parece ser crítico con este ensayo, pero a un costo - reactivos exactos y
Las concentraciones de reactivo no se conocen, por lo que es difícil probar la precisión y ajustar
condiciones de reacción cuando sea necesario. Algunas observaciones sobre dos kits comerciales
se ofrecen aquí.
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Ensayo PeroxySafe (MP Biomedical) . Rango de detección: reclamado por el fabricante

turer - 0.01–50 mEq / kg; real medido 0,1-0,5 mEq / kg detección lineal directa
rango de acción (Steltzer, 2012). El ensayo estándar viene con reactivos en frascos.
equipado con pipetas de bomba calibradas. Descubrimos que estas unidades eran inexactas,
irreproducible, y extremadamente derrochador de reactivos costosos debido a la
ing requerido. Reemplazo de pipetas de bomba con pipeteo directo de reactivos con
las micropipetas mejoraron enormemente los resultados de los ensayos. El ensayo se ejecuta nomi-
finalmente a temperatura ambiente; encontramos que el uso de un bloque calefactor fijado a 25 ° C para
mantener una "temperatura ambiente" constante era necesario para una reproducción aceptable
ducibilidad. Contrariamente a las afirmaciones del proveedor y las reacciones en sistemas acuosos,
Descubrimos que no se alcanzó un punto final claro en la reacción ejecutada en propiedad
disolvente de isopropanol estabilizado, por lo que el tiempo de mezcla y lectura de absorbancia es
crítico. El blanqueamiento del complejo XO-hierro a altas concentraciones de peróxido es
un problema importante, por lo que los aceites alimentarios y los extractos de lípidos de los alimentos generalmente requieren
dilución en varios órdenes de magnitud para poner las muestras en respuesta lineal
distancia. Absorbancia de una reacción medida en el detector óptico MicroChem
diseñado para el ensayo genera un "número" supuestamente en mEq / kg de lípido, pero
los cálculos son ciegos y los algoritmos no están disponibles en la empresa
de modo que no está claro qué representan realmente los resultados. Convertir el ensayo en un
El espectrofotómetro convencional UV / VIS proporciona una comprensión más comprensible y
resultados controlables. El ensayo utiliza hidroperóxido de cumeno para generar estándar
curvas; como se discutió anteriormente, estos pueden no ser estándares apropiados para lípidos
hidroperóxidos. Cuando los estándares son frescos y no degradados, la pendiente del
ecuación de regresión para la curva estándar está muy cerca de 1. Sin embargo, la pendiente
Disminuye a medida que los controles envejecen, por lo que se deben monitorear las curvas de reacción de los controles.
con frecuencia y los controles se reemplazan cuando la pendiente cae por debajo de un punto límite (por ejemplo,
0.90-0.95) o los PV de las muestras son erróneamente bajos ( Steltzer, 2012). Estamos de acuerdo
con la recomendación de Osawa y col. (2007) para calcular factores de ajuste
para cada sistema de reacción normalizando a los resultados de la titulación yodométrica. Los kits
están disponibles en versiones estándar y microplaca.
A pesar de estas limitaciones, hemos descubierto que el ensayo PeroxySafe es útil y
puede ser lo suficientemente precisa para la mayoría de los análisis de hidroperóxidos de lípidos en
alimentos.
PeroxoQuant (Pierce, Thermo Scientific) . Rango de detección: cumeno hidro-
peróxidos (0.01-0.30 mEq / kg), hidroperóxido de t -butilo (0.07-0.50 mEq / kg)
( Steltzer, 2012 ). Las curvas de respuesta a la concentración no eran lineales en todo el
rango de concentración y bastante diferente para todos los hidroperóxidos probados. Esto
El patrón de respuesta general plantea serias preguntas sobre la hidro-
estándares de peróxido para usar con lípidos. El kit no proporciona estándares
pero sugiere el uso de peróxido de hidrógeno, que es muy inexacto para los lípidos
hidroperóxidos. Debido a que los factores que controlan la reactividad parecen ser más
complejos que los potenciales redox de los peróxidos, sustituimos la autenticación
tic Fe 3+ para curvas estándar. El blanqueamiento del complejo XO fue un importante
Página 35
problema. Hasta que la química de reacción esté mejor definida y los problemas de estándares puedan
resolverse, consideramos que este ensayo no es aceptable para análisis cuantitativos de
oxidación de lípidos.
1.4.2.3 Tiocianato férrico (FeSCN)

Principio de análisis . En medios ácidos, el hierro ferroso reduce los hidroperóxidos lipídicos
(LOOH) y se oxida a hierro férrico ( Reacción (14)). El alcoxilo lipídico
radical (LO • ) generada a partir de LOOH oxida un segundo ion ferroso ( Reactio n
(15)). Luego, los iones férricos reaccionan con el tiocianato para formar un complejo FeSCN rojo.
que absorbe a 500 nm ( Kolthoff y Medalia, 1949, 1951).
LOOH + Fe 2+ LO • + OH - + Fe 3+ (14)
LO • + Fe 2+ + H + LOH + Fe 3+ (15)
Las concentraciones de hidroperóxido se determinan a partir de curvas estándar preparadas

de Fe 3+ o hidroperóxidos estándar (por ejemplo, hidroperóxido de cumeno), ajustado
para la estequiometría asumida de 2 mol Fe 3+ generados por mol LOOH. Fe 3+
Las curvas estándar son más precisas porque las sales de hierro están disponibles en mayor
pureza y son más estables que los hidroperóxidos. Si los estándares de hidroperóxido son
utilizado, la estequiometría de reacción real se puede determinar dividiendo la concentración de hierro
reacción generada por la concentración de hidroperóxido. Valores de peróxido para
Las muestras de lípidos se determinan dividiendo la molaridad de hidroperóxido determinada por
peso de lípidos para normalizar, luego convertir a (mEq LOOH / kg de grasa).
Ventajas . Alta sensibilidad. Intervalo de concentración de trabajo: 5-90 nmol orgánico
hidroperóxido por reacción; rango de respuesta lineal 1–40 μmol / L en aceite o lípido
extraerSteltzer, 2012 ).
Limitaciones y precauciones . El ensayo tiene muchas limitaciones químicas y
interferencias que pueden causar estragos en su uso ( Mihaljevic et al., 1996). A partir de
con los problemas más críticos, los ensayos cuantitativos requieren una estequiometría constante
etry para todos los analitos y condiciones. Surgen grandes problemas en el ensayo FeSCN
debido a que la estequiometría de la reacción varía con la estructura del hidroperóxido
tura, la concentración de hidroperóxido, el disolvente y la presencia de oxígeno
( Steltzer, 2012 ). Las curvas de reacción para diferentes hidroperóxidos pueden superponerse
en concentraciones muy bajas, pero divergen cada vez más por encima del hidroperóxido
concentraciones de aproximadamente 10 μmol / L (en la mezcla de reacción total) debido a diferencias
diferencias en la reactividad del hidroperóxido tanto con hierro como con disolventes. Dado que los aceites y
Los extractos de lípidos contienen hidroperóxidos de diferentes estructuras, y ninguno de estos
están disponibles comercialmente en alta pureza, la selección de un hidro-
El estándar de peróxido es un desafío y el uso de cualquier estándar conduce a inexactitudes.
en cuantificación absoluta. Quizás las mejores opciones en tales circunstancias son
para usar una curva estándar de Fe 3+ e informar los resultados como equivalentes de hierro, o para
informar los hidroperóxidos de lípidos como equivalentes de cualquier estándar de hidroperóxido
se utiliza.
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Las interferencias de disolventes surgen porque los radicales alcoxilo formados en hidroper-
descomposición de óxido átomos de hidrógeno abstractos de disolventes, formando disolvente
radicales en competencia con iones ferrosos oxidantes. El efecto neto en el ensayo
varía con el solvente y el potencial redox de sus radicales y no siempre es
previsible. Por ejemplo, con cloroformo y metanol, los disolventes se componen
Normalmente utilizado en este ensayo, el cloroformo produce radicales triclorometilo (Cl 3 C • )
( Reacción (16) ), que son fuertemente oxidantes y peroxidables. Cl 3 C • oxidar
iones ferrosos directamente (Reacción (17)) y después de la oxidación a • radicales OOCCl 3
( Reacciones (18) y (19) ):
LO
•
+ CHCl 3 → LOH + • CCl 3 (dieciséis)
Fe 2+ + • CCl 3 + H + → CHCl 3 + Fe 3+ (17)
• CCl 3 + O 2 → • OOCCl 3 (18)
• OOCCl 3 + Fe 2+ → Fe 3+ + - OOCCl 3 (19)
El ataque LO • al metanol, por otro lado, produce hidroximetil

radicalesReacción (20)), que son agentes reductores fuertes y reciclan Fe 3+ para
Fe 2+ ( Reacción (21)):
LO • + CH 3 OH → LOH + CH 2 OH (20)
• CH 2 OH + Fe 3+ → HCHO + Fe 2+ + H + (21)
Todas estas son reacciones en competencia, por lo que la cantidad resultante de Fe 3+ generó
en la reacción se determinará por la naturaleza del disolvente, los niveles y el tipo de
hidroperóxido, disponibilidad de oxígeno y pH. En otras palabras, la estequiometría
Dependerá de la composición de la solución analítica (Mihaljevic y col., 1996 ).
Para la mayoría de las muestras, los resultados precisos requieren análisis de una variedad de concentraciones
ciones; probar una sola concentración de muestra tiene una alta probabilidad de error
resultados positivos, una subestimación particularmente significativa de los peróxidos. El ensayo puede
solo analizamos concentraciones bajas de hidroperóxidos por dos razones. Debido a la
altos coeficientes de extinción de los complejos FeSCN, incluso concentraciones muy bajas
empujará las absorbancias ópticas a> 1, el límite de detección confiable en la mayoría
espectrómetros. Por lo tanto, excepto en la oxidación temprana, los aceites y extractos generalmente deben
diluirse y / o analizar alícuotas muy pequeñas para permanecer dentro del rango del ensayo.
Además, incluso más que en el ensayo XO, el exceso de hidroperóxidos blanquea la
Complejo FeSCN, por lo que los lípidos altamente oxidados pueden parecer tener poca o ninguna reacción.
ción. Dado que se desconocen los niveles de hidroperóxido de los aceites de prueba o las muestras de alimentos,
la única forma de saber si la baja reactividad aparente se debe a una baja oxidación de lípidos
La solución frente al blanqueo competitivo consiste en diluir la muestra secuencialmente, incluso sobre
varios órdenes de magnitud. Si hay niveles altos de hidroperóxido, la reacción
se observará con una dilución suficiente.
Las interferencias de oxígeno surgen de la oxidación lenta del hierro ferroso (especialmente
cialmente importante a bajas concentraciones de hidroperóxido) y de la promoción
de reacciones secundarias en lípidos y solventes después de la reducción con hidroperóxido.
Página 37
Estas interferencias pueden eliminarse rociando soluciones con argón y

colocando la reacción bajo un espacio de cabeza de argón.
Finalmente, para este ensayo es importante utilizar cloroformo estabilizado con eta-
nol en lugar de amileno (Richards y Feng, 2000). Cloroformo estabilizado con
El amileno causa lecturas en blanco muy altas y curvas de calibración no lineales con
hidroperóxido de cumeno. Aunque se agrega amileno como eliminador de radicales,
no previene la formación de radicales triclorometilo en cloroformo, ni tampoco
evita que los radicales triclorometilo oxiden los iones ferrosos. En contraste, etha-
nol como conservante elimina estas interferencias.
Aplicaciones . En la forma básica desarrollada para controlar la oxidación en
lípidos lácteosFederación Internacional de Lechería, 1991 ) o la forma modificada (Shanth a
y Decker, 1994), este ensayo se ha aplicado para determinar hidroperóxidos en
una amplia gama de sistemas alimentarios y petroleros. Sin embargo, la inconsistencia de estequiom-
Los problemas con el blanqueamiento de FeSCN plantean serias dudas sobre la validez
y precisión de la cuantificación de hidroperóxido con este ensayo, incluso para comparar
muestras similares.
1.4.3 Ensayos de epóxido
Los epóxidos no se han analizado sistemáticamente en aceites o lípidos oxidados.
extractos, en parte porque antes no se consideraban importantes, y
en parte porque no se disponía de ensayos con suficiente sensibilidad. Sin emabargo,
Se han detectado epóxidos en niveles más altos que los hidroperóxidos en metilo puro.
linoleatoHaynes y Vonwiller, 1990; Xie, 2015), se sospecha que son tóxicos
y son más reactivos con las proteínas y el ADN que los aldehídos.
Esto hace que los epóxidos sean importantes mediadores potenciales de las co-oxidaciones. Por lo tanto,
Se debe prestar especial atención al análisis de epóxidos en los nuevos protocolos para lípidos.
oxidación.
Cuatro ensayos de epóxido (bromuro de hidrógeno AOCS Cd 9–57, 4- p -nitrobencil-
piridina, N, N- dietilditiocarbamato [DETC] y resonancia magnética nuclear
[RMN]) fueron evaluados recientemente para la precisión química, sensibilidad, reproducibilidad
idoneidad, requisitos de manipulación y aplicabilidad al análisis de lípidos oxidados (Liao ,
2013 ). Se encontraron numerosas limitaciones con el ensayo de nitrobencil piridina.
La RMN se muestra prometedora como herramienta de investigación, pero no está fácilmente disponible para los consumidores de calidad.
laboratorios de control en la industria alimentaria. La titulación con ácido bromhídrico tiene problemas
pero es un ensayo estandarizado AOCS que se ha aplicado en la industria alimentaria. La
El ensayo DETC-cromatografía líquida de alta presión (HPLC) mostró el mayor
sensibilidad y flexibilidad, además de que es igualmente aplicable al control de calidad y
investigar. Por lo tanto, aquí solo se discutirán los ensayos HBr y DETC.
1.4.3.1 Valoración con ácido bromhídrico (método estándar AOCS

Cd 9–57, 1997)
Principio del ensayo . Los compuestos con epóxidos se disuelven en acético glacial.
ácido luego titulado con HBr que ha sido estandarizado con hidrógeno de potasio
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ftalato. El ácido H + cataliza la apertura del anillo mediante un mecanismo SN1 y el

El ion bromuro nucleofílico (Br - ) se agrega al anillo epoxi en el extremo menos sustituido
( Reacción (22) ) ( Clayden et al., 2006 ).
O H OH
H Br + RC CR RC CR (22)
H H
Br H
La concentración de epóxido se calcula como% de oxígeno oxirano = [mL HBr * N * 1.6] /

masa de aceite (g), donde N es la normalidad del HBr (Durbetaki, 1956).
Ventajas . El ensayo es simple y no requiere equipo especial, y
Hay disponibles procedimientos estandarizados.
Desventajas y precauciones . Este ensayo tiene una serie de limitaciones serias.
ciones. Solo detecta concentraciones de epóxido relativamente altas; el rango de detección
es 0.0075-0.1 mol / L, pero la respuesta no es lineal por debajo de 10 mmol / L epóxido (Liao ,
2013). El HBr de 0,1 mol / L prescrito por el ensayo estándar (diseñado para
concentraciones de epóxido en aceites modificados) sobrevaloran considerablemente bajo epóxido
concentraciones, pero el HBr más diluido es demasiado volátil y se autooxida fácilmente, por lo que
da valoraciones erráticas e inexactas. Para limitar la oxidación de HBr, la mezcla de reacción
ture debe agitarse bien durante la titulación para asegurar el máximo contacto entre
reactivos, y tambin debe ser burbujeado continuamente con un flujo de argn que sea suficiente
cient para prevenir la oxidación del HBr pero no lo suficiente para facilitar su volatilización.
Debido a la inestabilidad y volatilidad del HBr, sus soluciones deben ser estándar.
izado con frecuencia, al menos a diario y, a veces, con mayor frecuencia.
Al igual que con la titulación de tiosulfato en el ensayo de hidroperóxido, el final de la reacción
El punto es difícil de determinar a simple vista de forma precisa y reproducible. El cristal
El indicador violeta tiene un color violeta violeta. A medida que se consume el ácido bromhídrico
mediante la adición del epóxido durante la titulación, el color se desvanece y se vuelve gradualmente
en azul verdoso. Que el color no cambie total e instantáneamente
aumenta la probabilidad de sobrevaloración; variación en la percepción del color entre los
individuales también contribuye a una alta variabilidad en los resultados.
Quizás lo más problemático para analizar los lípidos oxidados es que la reacción de HBr
La velocidad y la estequiometría varían con la estructura del epóxido, aumentando con el epóxido.
longitud de la cadena (Liao, 2013 ). Esto agrega un gran factor de incertidumbre para valores absolutos.
cuantificación y crea dificultades particulares para comparar resultados entre
Aceites y extractos de diferente composición, donde se pueden presentar múltiples epóxidos.
ent y sus estructuras no se conocen. Además, la reacción no es totalmente específica.
para epóxidos. Cetonas β-insaturadas, dienoles conjugados y otros compuestos oxigenados
Los productos secundarios de la oxidación de lípidos compiten con los epóxidos por el HBr y pueden
reaccionar además de los epóxidos; si el efecto neto es sinérgico o antagónico
varía con las muestras. En cualquier caso, da como resultado sistemas complejos como el alimentario.
los aceites o extractos (a diferencia de los materiales puros) son cuestionables.
Aplicaciones . Este ensayo, originalmente diseñado para analizar industrialmente epoxis
aceites identificados, es demasiado insensible para detectar los niveles de epóxidos esperados en los alimentos,
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especialmente durante las primeras etapas de oxidación. Sin embargo, si se mantiene un gran cuidado
Para limitar la oxidación y volatilización del HBr, este ensayo es adecuado para determinar
niveles de epoxidación minera en aceites modificados para lubricantes y otros usos no alimentarios.
1.4.3.2 Ensayo DETC con separación y cuantificación por HPLC

de aductos epoxi
Principio de ensayo : DETC reacciona con epóxidos en temperatura metanólica caliente (60 ° C).
soluciones a forma estable complejos de epóxido-LTED en dos formas ( Reactio n
(23)). Se requiere un exceso de DETC para asegurar la unión completa de los epóxidos. El ácido es
luego se agrega para descomponer el DETC sin reaccionar en la solución ( Reacción (24) ),
y los complejos de epóxido se separan mediante HPLC de fase inversa con detección
a 278 nm ( Dupard-Julien et al., 2007 ). El ácido fosfórico se empleó originalmente
procedimientos finales, pero el ácido acético reduce la tensión en las columnas de HPLC. Los epóxidos son
cuantificado mediante la comparación de las alturas de los picos con las curvas estándar construidas a partir de
auténticos epóxidos. Los aductos individuales pueden identificarse comparándolos con
aductos auténticos o mediante la interfaz de HPLC con detección de MS.
S
S- OH
pH 7
norte norte S
+
60 ° C
S O
Producto principal
(23)
DETC epóxido
S HO
norte
S
Producto menor
S- SH
H+
norte norte NUEVA+HAMPSHIRE
CS 2 (24)
pH ~ 2
S S
Ventajas . La reacción es muy sensible (2.5 μmol / L a 0.01 mol / L), espe-
específico para epóxidosLiao, 2013) y fácil de ejecutar. El complejo DETC, una vez
formado, es estable durante varios días si se protege de la luz y el aire. Separación por
La HPLC proporciona no solo cuantificación, sino también en combinación con la detección de EM
también puede identificar los epóxidos generados. Esta información puede ser muy útil.
útil al intentar dilucidar el origen de algunos productos de oxidación. La reacción
muestra poca influencia de la estructura del epóxido por encima de la longitud de la cadena de seis carbonos, por lo que un
epóxido puro de cadena moderadamente larga (p. ej., epóxido C10) se puede utilizar para preparar
curvas estándar y el ensayo es adecuado para la cuantificación de epóxidos mixtos
de estructuras desconocidas ( Liao, 2013). Aunque los procedimientos de ensayo originales fueron
desarrollado para epóxidos monoméricos, ajuste de disolventes de extracción y
Página 40
Los gradientes de elución permiten distinguir el monómero de los epóxidos del núcleo
sobre fosfolípidos y triacilgliceroles y para cuantificar cada fracción en una sola
run (Shallcross, J. y Schaich, KM, datos no publicados).
Desventajas y precauciones . DETC es un quelato metálico razonablemente fuerte.
torVan Damme y Oomens, 1995) por lo que los contaminantes metálicos en grasas, aceites o
Los extractos de alimentos pueden interferir con el ensayo DETC, alterando la eficiencia y
estequiometría de la reacción. La respuesta de reacción no es lineal con epóxido.
concentración, pero bifásica con un punto de ruptura de aproximadamente 1 mmol / L. Las pendientes son
empinado en el rango de concentración baja, luego disminuya a concentraciones más altas
( Liao, 2013 ). Además, altas concentraciones de complejos DETC-epóxido
precipitar en la columna de HPLC. Por tanto, los análisis cuantitativos son los más precisos
a bajas concentraciones, y es posible que las muestras deban diluirse en serie para determinar
concentraciones óptimas para los cálculos.
Incluso los análisis de epóxidos monoméricos requieren gradientes de solvente para eluir la cadena.
longitudes superiores a unos seis carbonos en tiempos razonables. Cuando los aceites o extractos
se analizan, se requieren gradientes más complejos, y estos deben modificarse
y optimizado para las clases de lípidos y las longitudes de cadena de ácidos grasos presentes.
Aplicaciones . Este ensayo ha existido durante mucho tiempo pero ha visto poco
aplicación en análisis de alimentos. Usamos DETC con regularidad para monitorear epóxidos.
en la oxidación de linoleato de metilo y aceites alimentarios ( Xie, 2015) y siente que tiene el potencial
tial para convertirse en el principal ensayo de epóxidos lipídicos en los alimentos. Aplicación completa del
El ensayo DETC en alimentos requerirá una evaluación de la estabilidad del epóxido a la extracción.
procedimientos y ajuste de los gradientes de elución para adaptarse a los
componentes lipídicos complejos de extractos individuales.
1.4.4 Ensayos de carbonilo
Los carbonilos son productos secundarios de la oxidación de lípidos y, como tales, a menudo tienen
han sido tratados como si fueran también de importancia secundaria, siendo sólo indicadores
esa oxidación había progresado sustancialmente en etapas posteriores. Concedido, bajo ambi-
condiciones existentes, los carbonilos pueden parecer irrelevantes porque se forman sólo en
niveles muy bajos durante mucho tiempo, incluso durante la formación de hidroperóxido y epóxido
son muy activos. Sin embargo, los análisis de carbonilo deben considerarse componentes críticos.
nents de cualquier protocolo para analizar la oxidación de lípidos porque son indicadores únicos
de cambios en la dirección de oxidación. Cuando los niveles de hidroperóxido son bajos,
los bonyls pueden distinguir la oxidación inhibida de la descomposición del hidroperóxido.
Concentraciones inusualmente altas de carbonilos, especialmente al comienzo de la oxidación, señalan
activación de vías distintas del radical peroxilo → hidroperóxido → descomposición
ción a radicales alcoxilo → escisión a carbonilos. Más allá de las concentraciones totales de
carbonilos, análisis de productos carbonílicos individuales, tanto volátiles como no volátiles,
puede proporcionar información crucial para dilucidar las vías de oxidación, que a su vez
puede orientar el desarrollo de un control más eficaz de la oxidación.
Fomentar un mayor análisis de los productos de oxidación de carbonil-lípidos y
proporcionar algunas perspectivas sobre las limitaciones de los análisis actuales, esta sección proporciona
una descripción general de tres ensayos para carbonilos no volátiles: dinitrofenilhidrazina,
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p -anisidina y ácido tiobarbitúrico (TBA). El análisis de carbonilos volátiles
ser considerado en Sección 1.5.2 sobre análisis cromatográficos de gases.
1.4.4.1 Complejamiento de carbonilos con

2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH)
Principio del ensayo . Los carbonilos (tanto cetonas como aldehídos) reaccionan con
DNPH en alcohol ácido para formar dinitrofenilhidrazonas, que en la
la presencia de la base se convierte en iones quinoidales de color vino tinto (Reacción (25) )
( Lappin y Clark, 1951 ).
R R
N=C
HNNH 2 HN HNN = C R'
R'
O NO 2 NO 2 NO 2
+ H+ OH -
(25)
R R'
+
NO 2 NO 2 NO 2 2 -
La longitud de onda para la detección varía según el disolvente y los tipos de carbonilos.
La primera aplicación del ensayo DNPH a los carbonilos de lípidos utilizó metanol / benceno
( Henick et al., 1954 ), en el que la absorción máxima fue a 432 nm para saturados
aldehídos y 458 nm para aldehídos insaturados. Desde entonces, el ensayo ha sido modificado
Está autorizado a utilizar disolventes menos tóxicos, incluido el etanol (Yukawa y col., 1993), isopro-
panolEndo et al., 2001 ), butanol (Schulte, 2002; Endo et al., 2003; Usuki y col. ,
2009 ) e isopropanol: acetonitrilo 1: 1 (Yao, 2015). En la mayoría de los alcoholes, las reacciones
de carbonilos α, β-insaturados está completo, mientras que los aldehídos saturados reaccionan solo
alrededor del 70% (Yukawa et al., 1993 ) y los máximos de absorción son correspondientemente diferentes.
diferente. En etanol, los máximos son ∼435 nm (aldehídos saturados), ∼460 nm (enals),
y ∼480 nm (dienals) y respuesta igual (pero no máxima) para todas las estructuras
ocurre a 425 nm (Yukawa y col., 1993). En propanol ( Endo et al., 2001) y buta-
nolEndo et al., 2003 ), los máximos correspondientes son 430, 450 y 457 nm con
respuesta aproximadamente igual a 420 nm.
Los primeros métodos usaban calentamiento para impulsar la reacción, pero estos procedimientos han
ha sido reemplazado en gran parte por versiones a temperatura ambiente que evitan artefactos
desarrollo o pérdida de carbonilos durante la reacción con DNPH.
La reacción de DNPH se ha considerado durante mucho tiempo el ensayo clásico para carbonilos,
y actualmente se está aplicando para medir la contaminación del aire (Lodge, 1988; Workma n
y Steger, 1996; Brombacher et al., 2002 ) y cuantificar carbonilos en proteínas
( Levine y col., 1990, 1994; Evans y col., 1999; Fagan y col., 1999; Shacter, 2000a, b ;
Armenteros et al., 2009; Luo y Wehr, 2009; Estévez, 2011 ). Es algo
Sorprende, entonces, que el método no sea también un análisis de rutina para lípidos oxidados.
Una razón puede ser que las reacciones de solución tradicionales eran tediosas y difíciles de
resolver. El exceso de DNPH requerido para la reacción, así como los contaminantes en el reactivo.
DNPH provocó inestabilidad e interferencia en el análisis. Recristalización en tres ocasiones
de DNPH y eliminación del exceso de DNPH después de la reacción, como por intercambio iónico
cromatografíaYu et al., 1961 ), consumían mucho tiempo y no eran susceptibles de
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análisis de rutina de muchas muestras. Los disolventes de reacción debían cambiarse dependiendo
sobre los requisitos de solubilidad del material que se analiza.
Las reacciones de DNPH se volvieron técnicamente factibles y mucho más atractivas para el monitoreo.
Oxidación de lípidos cuando la necesidad de cuantificar los contaminantes del aire está ligada al DNPH.
Reacciones en solución con separación de productos por HPLC (Tejada, 1986; Brombache r
et al., 2002; van Leeuwen y col., 2004; EPA, 2006; de M. Ochs et al., 2010). Inte-
gración de reacción y cromatografía cumple el doble papel de aislar sin reaccionar
DNPH mientras separa y permite la identificación de hidrazonas individuales, un
importante avance técnico que ha abierto las puertas a nuevas aplicaciones en análisis
yses de carbonilos en la oxidación de lípidos. La cuantificación de carbonilos totales se obtiene de
áreas de picos totales menos los picos de DNPH; La cuantificación de carbonilos individuales es
obtenido por comparación con las curvas de regresión de estándares auténticos.
Ventajas . Los análisis DNPH-HPLC proporcionan una forma sencilla de determinar
si los niveles bajos de hidroperóxido se deben a una baja oxidación o una alta hidroperóxido
descomposición de óxido, para identificar productos específicos de carbonilo que pueden
tributo a los sabores desagradables y para diferenciar carbonilos en monómeros no volátiles
versus estructuras centrales de fosfolípidos y acilgliceroles - información que
no ha estado disponible previamente (Sjövall y col., 2002; Yao, 2015). El DNPH
La reacción es específica para carbonilos (no reacciona con hidroperóxidos, epoxi
ides, o alcoholes) y las hidrazonas resultantes son suficientemente estables para grupos de
muestras para analizar en muestreadores automáticos ( Yao, 2015 ). El método es muy sensible
tiva, con límites de detección del orden de 5 a 50 μg / L y una cuantificación más baja
límites de 18-166 μg / L, con una relación inversa al número de carbonos. Carbonilos
se distinguen fácilmente de las cetonas por la EM: tanto los aldehídos como las cetonas tienen
un fragmento fuerte en m / z 152 pero los aldehídos también tienen un fragmento adicional
en m / z 163 ( Yao, 2015). Aldehídos de cadena corta (formaldehído, acetaldehído,
propionaldehyde) que requieren criotrapeo especial en GC son fáciles de detectar por
HPLC con gradientes apropiados.
Capacidad de identificación y cuantificación de carbonilos individuales mediante
La comparación con los estándares puede contribuir significativamente a dilucidar la oxidación.
vías mientras que también rastrea el progreso de la oxidación. Conexión de HPLC a
La detección de EM brinda oportunidades para identificar productos en detalle que no antes
disponible. El control de calidad industrial puede no considerar esto útil de inmediato,
pero la información obtenida mejorará nuestra comprensión de la oxidación de lípidos,
rastrear las fuentes potenciales de cambios de sabor y eventualmente conducir a más efectivos
protocolos y enfoques analíticos para estabilizar la oxidación de lípidos en los alimentos.
Desventajas y precauciones . Todo el reactivo DPNH debe recristalizarse
tres veces de disolventes como butanol o acetonitrilo para eliminar reactivos y
impurezas que interfieren ópticamente. Sin embargo, esto es solo un pequeño inconveniente, ya que un solo
La corrida de purificación puede proporcionar suficiente material para meses de análisis si el DNPH
se almacena seco en un recipiente oscuro. Quizás la mayor limitación en la actualidad es la falta
de experiencia y estandarización de métodos DNPH-HPLC para carbonilos de lípidos.
Los métodos se han desarrollado de forma independiente. Tiempos de reacción DNPH, disolventes y
Los gradientes varían según la fuente y el tratamiento de los lípidos que se analizan, así como
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objetivos analíticos: solo monómeros, clases específicas o todas las clases. Un considerable
Todavía se necesita una gran cantidad de investigación para desarrollar gradientes que proporcionen un buen pico
forma y resolución de línea base de todos los componentes carbonilo, particularmente
bonyls, pero con los avances en las columnas de HPLC, se puede lograr.
La cuantificación de carbonilos no es sencilla porque cada compuesto de carbonilo
libra tiene una curva de concentración-respuesta diferente. Incluso cuantificación relativa
las comparaciones no son exactas a menos que coincidan los componentes de carbonilo. Sin emabargo,
Yao (2015) ha demostrado que el uso de tiempos de retención para clasificar componentes por
longitud de la cadena, luego aplicando curvas de regresión promedio para diferentes longitudes de cadena
rangos (<6 carbonos, 7-10 carbonos,> 10 carbonos) pueden dar buenas aproximaciones
de concentraciones de carbonilo total e individual en mezclas.
Aplicaciones . ¡Prácticamente ilimitado con el desarrollo y el refinamiento adecuados!
La versión DNPH-HPLC de la reacción se ha aplicado a los análisis de lípidos.
carbonilos en triacilgliceroles oxidados de aceites de maíz y girasol (Sjövall y col. ,
2002 ), en aceites vegetales ( Seppanen y Csallany, 2001), aceites para freír ( Endo
et al., 2001; Schulte, 2002) y manteca de cerdo calentada ( Jeong et al., 2013 ), productos cárnicos
( Armenteros et al., 2009 ), y productos tostados y secos (Usuki et al., 2009 ).
También se ha utilizado para determinar los niveles de acroleína en una amplia gama de aceites y
extractos de alimentos ( Shibamoto, 2006). Actualmente, las principales limitaciones son solo la falta
de experiencia con la versión HPLC y necesidad de refinamientos en gradientes para
detectar carbonilos del núcleo.
Se han identificado varias reacciones secundarias y degradaciones en el medio ambiente.
Aplicaciones ambientales de los ensayos DNPH-HPLC (Uchiyama et al., 2011). Esto
La química debe considerarse ya que los métodos de DNPH-HPLC son cada vez más
aplicado a los análisis de lípidos, especialmente cuando los resultados se utilizan para dilucidar la oxidación
Procesos.
Las aplicaciones de la reacción DNPH al análisis de carbonilos de proteínas serán
discutido en la Sección 1.7.5.3.
1.4.4.2 Valor de p -Anisidina

Principio de ensayo . Aldehídos insaturados (principalmente 2-alquenales y
2,4-alcadienales) en grasas animales y aceites vegetales reaccionan con p -anisidina
en ácido acético glacial para formar un producto amarillento que se absorbe a 350 nm
( Reacción (26) ) ( IUPAC, 1987; AOCS, 2011 ).
O NH 2 norte R
+
R CH 3 O CH 3 O NH 2
2-enal p -Anisidina
CH 3 O
(26)
NUEVA HAMPSHIRE
norte
Cromóforo
CH 3 O OCH 3
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Por convención, el valor de p -anisidina se define como 100 veces el cambio en

absorbancia a 350 nm (medida en una celda de 1,0 cm) antes y después de la reacción de
una solución que contiene 1.0 g de aceite en 100 mL de reactivo de anisidina. Combinatorio
el valor de anisidina (AV) con PV da el valor TOTOX, una medida de ambos
oxidación temprana y secundaria ( Reacción (27)):
Valor TOTOX = AV + 2PV (27)
Ventajas . Los procedimientos estandarizados están disponibles tanto para AV (AOCS Cd

18-90, ISO 6885) y valor TOTOX (AOCS Cg 3-91) ( IUPAC, 1987; AOCS ,
2011 ).
Desventajas y precauciones . ¡Toxicidad! Aunque no es cancerígeno,
p -anisidina es altamente tóxica y en los Institutos Nacionales de Ocupación de EE. UU.
Lista de seguridad y salud de compuestos que son inmediatamente peligrosos para la vida o
Concentraciones de salud (IDLH) ( NIOSH, 2015). p -Anisidina causa daños en la sangre
edad por ingestión oral, inhalación o contacto con la piel y, si se calienta fuertemente, puede
liberan humos muy tóxicos de óxido de nitrógeno. Considerando el impulso para eliminar
uso de hidrocarburos clorados en análisis de lípidos, este reactivo también debe ser
en la lista de descarte.
La reacción de la anisidina no es cuantitativa ni específica. Todos los aldehídos
reaccionan, pero los aldehídos insaturados tienen una respuesta de color más alta que los saturados, por lo que
los resultados sólo pueden dar concentraciones de aldehído relativas, no absolutas. Anisidina
también reacciona lentamente con hidroperóxidos, por lo que no distingue claramente los
de productos secundarios y no debe utilizarse para analizar aceites con PV> 5
(aunque esto parece ser una práctica común). El método no se puede utilizar
con aceites muy coloreados, particularmente con carotenoides, que también absorben en el
Rango de longitud de onda de 350 nm. Para eliminar interferencias, ensayos sobre extractos lipídicos
requieren la resta de un blanco para la absorbancia del extracto solo para obtener resultados precisos
valores. El método también requiere sin agua (las reacciones no se completan por completo
en presencia de agua) y disolventes libres de carbonilo para evitar interferencias generales
( White, 1995 ).
Aplicaciones . Los valores AV y TOTOX se han utilizado para distinguir ampliamente
fresco de aceites oxidados, es decir, aceite fresco AV <2.0 y TOTOX <4, y para
rastrear la degradación en casi todos los tipos de aceite y alimentos con alto contenido de lípidos. La tendencia
para producir productos reactivos con anisidina aumenta con la insaturación de ácidos grasos
por lo que el ensayo es más sensible con aceites de soja, colza, linaza y pescado.
Dos aplicaciones principales han sido monitorear el daño térmico en aceites para freír.
( Tompkins y Perkins, 1999) donde los hidroperóxidos se han descompuesto y
Evaluar aceites refinados donde se han descompuesto altos hidroperóxidos en aceites dañados.
planteado a los aldehídos durante la desodorización.
A pesar de las extensas aplicaciones pasadas de este ensayo, debido a la toxicidad y la inexactitud
picante, este ensayo ahora debe ser reemplazado por ensayos más sensibles y precisos
para carbonilos de lípidos, como el ensayo de DNPH-HPLC discutido en la sección anterior
sección.
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1.4.4.3 Sustancias reactivas de TBA o ácido tiobarbitúrico (TBARS)

Principio del ensayo . Nominalmente, el ensayo TBA mide el contenido de la
producto de degradación secundario, malonaldehído, que reacciona con tiobarbitúrico
ácido cuando se calienta en soluciones ácidas para formar un aducto de base de Schiff que es rosa
coloreado (absorbe a 532–535 nm) y fluorescente (excitación 515 nm, emisión
553 nm) (Reacción (28) ) (Bernheim y col., 1948; Sinnhuber y col., 1958).
O
S norte OH HO norte S
O O norte
+2 +H2O
norte norte (28)
O norte S
CH – CH = CH
HO O
En realidad, la reacción es mucho más nebulosa e inespecífica que esto,

que involucran alcanales, alquenales, alcadienales y quizás otros productos de oxidación
ucts así como malonaldehído. Las reacciones de estos productos alternativos pueden ser
se distingue por cambios en los máximos de absorción, en lugar o además de
el pico de malonaldehído. Los alcanales reaccionan con TBA en una sola condensación;
los complejos son amarillos y se absorben a 450–455 nm ( Tarladgis et al., 1962 ;
Marcuse y Johansson, 1973 ). Generación de acetaldehído y otros aldehídos
durante el calentamiento de mezclas de reacción con complejos de TBA en forma de ácido que son
naranja ( λ max = 496 nm) ( Kosugi et al., 1987). Los alquenos absorben principalmente a
452 nm (nivel bajo a 530 nm), mientras que los 2,4-alcalinos producen el rojo típico
cromóforo que absorbe a 530 nm ( Marcuse y Johansson, 1973). Allí
Hay poca coherencia en los informes de la literatura sobre cómo la absorción en múltiples
se tienen en cuenta las longitudes de onda, ambos picos, solo 530 nm, o solo 450 nm, pero
Parece que las variaciones espectrales de diferentes aldehídos podrían usarse para diag-
nósticamente para identificar al menos tentativamente clases de aldehídos en la muestra.
Tal aplicación, aunque intrigante, se ve obstaculizada por el intercambio que
ocurre en aldehídos y absorción máxima dependiendo del pH de reacción, temperatura
peratura y tiempo de calentamiento, y concentraciones relativas de TBA y aldehídos.
Como consecuencia, es difícil estar seguro del origen de los aldehídos detectados.
- endógeno o generado en reacción. Una revisión detallada de la complejidad de
La generación y reacción de aldehído en análisis de TBA está disponible para interesados
lectoresGuillén-Sans y Guzmán-Chozas, 1998 ).
Para la reacción, el malonaldehído y otros productos se recolectan con cuatro métodos.
ods: (1) destilación al vapor (Tarladgis y col., 1960; Pikul y col., 1989; Gomes y col. ,
2003), (2) reacción directa de la muestra intacta con TBA en solución ( Sinnhuber et al. ,
1958; Witte y col., 1970; Sinnhuber y Yu, 1977 ), (3) preextracción de lípidos antes
Reacción de TBA (Pikul et al., 1983, 1989 ), y (4) extracción con ácido acuoso de malo-
naldehído antes de la reacción de TBA (Raharjo y col., 1992). La destilación al vapor ha sido
ampliamente utilizado con homogeneizados de carne. Las digestiones directas de muestras de alimentos son
seleccionados por su facilidad y rapidez, pero también son menos específicos y más propensos
a reacciones secundarias con no lípidos (Sørensen y Jørgensen, 1996). Por ejemplo, en
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ensayos de oxidación de lípidos en cereales extruidos, se puede unir más TBA al alimento
matriz que reaccionan con los aldehídos lipídicos liberados en solución (Schaich, KM,
datos no publicados). El análisis de extractos de lípidos elimina la ventaja de tiempo.
del método, pero evita reacciones secundarias con reactivos no lipídicos y proporciona
información más detallada sobre la oxidación en el lípido. Con extractos lipídicos,
TBA puede ofrecer alguna ventaja sobre DNPH en estabilidad, pero la sensibilidad es
más bajo. Se han publicado numerosas comparaciones de los métodos por diferencias
alimentos enteros, pero sin una decisión clara en cuanto a la preferencia de método. Argumentos para
Se ha presentado la elección de un modo de reacción específico para análisis en carnes.
por Fernandez et al. (1997).
Para la cuantificación, la absorbancia de las muestras después de la reacción se compara con la
curvas de dard preparadas a partir de 1,1,3,3-tetraetoxipropano (TEP), que hidroliza
en ácido para dar malonaldehído (Pikul y col., 1989). Esto suena sencillo
pero, para obtener resultados precisos, se deben ejecutar blancos de recuperación de TEP en cada método para
determinar el porcentaje de analitos que sobrevive a las condiciones de reacción, y esto
El factor de recuperación se incluye en los cálculos del valor final de TBA ( Tarladgis et al. ,
1960; Pikul y col., 1989 ). No incluir factores de recuperación aumenta la variabilidad
de resultados, introduce error incluso en la comparación directa de absorbancia, y limita
capacidad para evaluar los niveles de oxidación relativos en diferentes materiales o diferentes
laboratorios. Los resultados de los análisis de TBA generalmente se expresan como μmol TBARS / g
muestra para cubrir todos los reactivos, o mg de malonaldehído / kg de muestra si el
se verifica el reactivo. No es infrecuente ver también la publicación de comparaciones de absorbancia.
Listed sin cálculo y normalización.
Las críticas por el tiempo de reacción prolongado, la baja sensibilidad y la falta de especificidad han
generó cambios en el manejo, detección final y cuantificación de productos.
Los aductos de TBA todavía se detectan con mayor frecuencia de forma óptica, pero cada vez son más
Los métodos muestran una mayor sensibilidad y especificidad, y también una mayor facilidad
en el manejo de detección y análisis de datos. Cálculo de terceras derivadas
de espectros ópticos agudiza los picos de absorción, proporciona absorciones más exactas,
y facilita la determinación de diferentes especies que contribuyen a la reacción
( Fenaille et al., 2001 ). El uso de puntos finales de fluorescencia aumenta la sensibilidad
y elimina algunos efectos secundarios ( Yagi, 1987; Williamson et al., 2003). Cuatro
tecnología de transformada de rier con espectroscopia infrarroja (FTIR) con mínimo parcial
La quimiometría de cuadrados se puede entrenar con muestras de aceite de valores TBARS conocidos.
y da resultados directos equivalentes con aceites en <5 min, pero la especie detectada
aún no está identificado ( Setiowaty y Che Man, 2003).
La obtención de especificidad en el análisis requiere la separación de los productos de reacción.
por HPLC ( Kakuda et al., 1981; Londero y Greco, 1996; Fenaille et al., 2001 ;
Mendes et al., 2009) o GC ( Fenaille et al., 2001 ) seguido de la identificación de
productos en comparación con los estándares o mediante la interfaz con un espectrómetro de masas
detectores.
La mayoría de los procedimientos contienen algún paso de calentamiento para aumentar los rendimientos de TBA
cromóforo, pero Kosugi et al. (1988) demostró la presencia de artefactos
del proceso de calentamiento. Cuando reacciona con TBA a baja temperatura (5 ° C),
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dienals formaron varios complejos que posteriormente se transformaron en el tipo

complejo cal malondiadehído cuando la solución se calentó a 100 ° C (Kosugi
et al., 1988 ). Por lo tanto, propusieron que los aldehídos reales presentes eran los más precisos.
detectado raramente sin calor, incluso si los tiempos de reacción fueron más largos. Licitador y
Spika (1989) recomendó igualmente incubaciones frías para detectar endógenos
aldehídos y eliminan la producción accidental en reacciones secundarias.
Se encuentran disponibles varias reseñas excelentes sobre la química y los procedimientos de las TBA
para lectores interesadosHoyland y Taylor, 1991; Fernández et al., 1997 ;
Guillén-Sans y Guzmán-Chozas, 1998).
Ventajas . La reacción de TBA se ha utilizado ampliamente en análisis de lípidos.
oxidación en los alimentos, en particular los alimentos para los músculos, porque se puede aplicar directamente
y no requiere extracción de lípidos. En general, los resultados de TBA se han correlacionado
bien con los análisis sensoriales, lo que respalda la participación de los reactivos TBA en
procesos que generan malos sabores y olores detectados por los consumidores.
Desventajas y precauciones . La prueba TBA es un análisis muy controvertido.
ysis, con el campo de la oxidación de lípidos dividido entre aquellos que aman
el ensayo TBA, o al menos lo encuentran útil si no perfecto, y aquellos que odian el
ensayo por su química difusa y aplicaciones inapropiadas. Aunque mucho
Se ha aprendido sobre las especies que contribuyen al desarrollo del color en el
reaccin, siguen siendo feroces argumentos sobre lo que realmente se mide en el
Ensayos TBA o TBARS en términos de identidad y origen de los reactivos. Para
Por ejemplo, el malonaldehído auténtico se produce principalmente durante la autoxidación.
ción de ácidos grasos con tres o más dobles enlaces (Pryor y Stanley, 1975 )
y se genera durante la etapa de digestión del ensayo; pequeñas cantidades también pueden
generarse en la oxidación posterior de productos de oxidación de lípidos secundarios
como 2-nonenal ( Sinnhuber y Yu, 1977). Por lo tanto, el auténtico malonaldehído de
De hecho, el origen endógeno puede detectarse en los alimentos musculares que tienen un alto contenido de
ácido araquidónico (carnes) y ácido eicosapentaenoico y docosahexaenoico (pescado),
pero los productos que se cree que son malonaldehído de aceites vegetales son más probables
generado durante la reacción de TBA. La discusión anterior sobre las muchas diferencias
Los diferentes productos coloreados observados en la reacción de TBA también dan fe de su
complejidad y opacidad.
Otro punto de vista de los oponentes de TBA es que la reacción de TBA es tan inespecífica
que su validez, excepto en aplicaciones especiales, es muy cuestionable. El largo
El paso de calentamiento y el hierro agregado en algunas versiones contribuyen a la descomposición de
hidroperóxidos y aumentos de artefactos en productos secundarios en lugar de medidos
compuestos emergentes ya presentes. La reacción de TBA con proteína amina.
grupos, almidón y azúcares y ácidos nucleicos conduce a una sobreestimación de la oxidación
cuando están presentes reactivos no lipídicos solubles y subestimación de la oxidación
cuando TBA se une a componentes poliméricos de alimentos como almidones y proteínas
( Tarladgis et al., 1962; Baumgartner et al., 1975; Frankel, 2005a). Aunque
Algunas de las reacciones secundarias pueden identificarse por la aparición de picos en diferentes
longitudes de onda, y estos picos se pueden restar, la cuantificación general aún
sigue siendo cuestionable a menos que el lípido se purifique antes del análisis. Haciendo el
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La detección más específica mediante análisis de HPLC niega las ventajas de tiempo de la
método de digestión / análisis óptico y todavía no da más o diferente información
mación que el ensayo HPLC-DNPH más específico.
Aplicaciones . Se pueden encontrar informes de investigación que citan el uso del ensayo TBA para
analizó la oxidación de lípidos en casi todos los tipos de sistemas alimentarios. Más apro-
Las aplicaciones primarias han sido alimentos para músculos que tienen un mayor contenido de araqui
ácido dónico. Si todas las demás aplicaciones son válidas es discutible, pero el método
proporciona algunos "valores" para la comparación, por lo que tal vez este ensayo tenga su propio nicho
entre los métodos.
Todavía, Frankel (2005a) ha declarado que la prueba TBA es "inadecuada para complejos
materiales alimenticios y sistemas biológicos que contienen materiales no lipídicos que contribuyen
a la reacción del color ”y este autor está de acuerdo debido a la química mal definida
prueba y alta sensibilidad de los resultados a las condiciones de reacción.
Se ha argumentado que los artefactos de oxidación causados por la extracción de
ids de matrices difíciles como los alimentos para el músculo y los productos lácteos y de cereales
ucts contrarrestan los artefactos inducidos por el paso de calentamiento TBARS, por lo tanto
justificando el uso de reacciones de TBA. Sin embargo, las extracciones con solvente presurizado pueden
ahora extrae lípidos de manera eficiente incluso de estas matrices difíciles con un mínimo
efecto sobre la oxidación, los métodos DNPH-HPLC pueden identificar y cuantificar la autenticidad
tic malonaldehído ( Kawai et al., 1990) y diferenciar otros productos carbonílicos
específicamente, y ambos métodos se pueden automatizar y manejar un gran número de
muestras. Por lo tanto, es hora de reemplazar los TBARS por otros más precisos y químicos.
análisis calmente definitivos. Al menos, si se usa TBA, el método debe ser limitado
a la digestión en frío para atrapar solo productos originales y detección solo por HPLC
para que se puedan identificar las especies individuales que reaccionan, con solo productos lipídicos
incluido en los cálculos.
1.5 ANÁLISIS FÍSICO / INSTRUMENTAL DE LA OXIDACIÓN

PRODUCTOS EN ACEITES Y ALIMENTOS INTACTOS
1.5.1 Consumo de oxígeno

En cierto sentido, el consumo de oxígeno es una medida ideal de oxidación de lípidos, ya que
no depende de ningún producto en particular y proporciona cinética de oxidación
directamente. La velocidad de adición de oxígeno a los radicales de carbono está controlada por difusión.
y casi instantáneo ( k > 10 9 unidades), por lo que el consumo de oxígeno es esencialmente
una medida de la tasa de iniciación. Sin embargo, el consumo de oxígeno en el espacio de cabeza
no reflejan las tasas absolutas de oxidación, excepto quizás con películas delgadas, porque
refleja tres procesos: oxidación de moléculas en la superficie de la muestra, difusión
sión de oxígeno en la muestra y oxidación de moléculas en la fase de volumen.
En cualquier análisis, la agitación reduce los efectos de difusión. Todas estas acciones deben ser
considerado al interpretar los datos de consumo de oxígeno.
El oxígeno del espacio de cabeza es más fácil de medir, por lo que se realiza con mayor frecuencia.
El oxígeno disuelto en fases lipídicas es más desafiante porque el electrodo
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debe poder funcionar en una fase aprótica hidrófoba o en una fase hidrófoba
interfaz y tampoco reacciona con los productos de oxidación. La sensibilidad es otra
problema ya que la oxidación de lípidos ocurre a una escala micro molecular - 20 mEq de oxígeno
(10 mEq LOOH) por kg de lípido en hidroperóxidos hace que la mayoría de los aceites sean inaceptables
en olor y sabor. No hemos encontrado sensores específicos de oxígeno que funcionen en
una fase lipídica y proporcionar la sensibilidad que necesitamos, incluida la sonda Foxy
(Ocean Optics) diseñado para lípidos. Por el contrario, los sistemas que se describen a continuación
realizar de forma coherente y proporcionar datos útiles para la mayoría de las investigaciones y los controles de calidad
aplicaciones de control.
1.5.1.1 Consumo de oxígeno en el espacio de cabeza con Oxipres ™

Bomba de oxígeno y Oxidograph ™
Principio de análisis . Oxipres ™ (Mikrolab, Aarhus, Dinamarca) es un oxi-
bomba gen (que no debe confundirse con un calorímetro de bomba de oxígeno) diseñada para
monitorear el consumo de oxígeno de los materiales calentados bajo atmósferas controladas.
Las muestras de aceites o alimentos se sellan en celdas de vidrio dentro de cámaras de acero inoxidable.
( Figura 1.3), presurizado con gas de prueba a presiones que varían de 1 a 7 bares,
se calienta a las temperaturas de prueba deseadas (30–199 ° C), luego se mantiene durante un tiempo y se deja
reaccionar. La presión en la celda se mide electrónicamente mediante una presión sensible
transductor y registrado continuamente por computadora mientras las muestras se incuban. Célula
la presión aumenta primero a medida que se equilibra la temperatura (siguiendo el gas universal
ley PV = nRT), luego disminuye a medida que se produce la reacción y el consumo de oxígeno aumenta.
gressesFigura 1.4).
OXIPRES OXIDOGRAFÍA
Presión
transductor
Desorción térmica
trampa
Respiradero
Celda de muestra
Presión
Cámara
FIGURA 1.3 Configuraciones de celda de muestra de la bomba de oxígeno Oxipres y modificaciones de Oxidograph
ción del aparato Fira-Astell. Imagen de oxidografía cortesía de MikroLab, Aarhus, Dinamarca.
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(A) 8
7 Tasa de consumo de O 2 (iniciación)
m = tasa inicial O 2 total consumido

6
(P máx. - P final )
) 5
rs Presión / temperatura
4 equilibrio
(licenciado en Letras
2
3
correos
2
1
Tiempo de calentamiento (min)
0
0 50 100 150 200
(B) 7.5 Periodo de inducción

100 C
7.0
) 120 C
6.5 150 C
160 C
6.0 170 C
180 C
5.5
)
5,0
Presión de (barras
bomba (bares
4.5
4.0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
Tiempo de calentamiento (min)
FIGURA 1.4 Curvas típicas de Oxipres que muestran información derivable de ellas. (A) Curva típica
de aceite en condiciones de modelo de fritura (5 bares de oxígeno, 180 ° C). (B) Curvas de aceite calentado a diferentes
diferentes temperaturas. La caída rápida de la presión de oxígeno indica el final del período de inducción. Se muestran curvas
se trazan desde el momento de la presión máxima en lugar del inicio del calentamiento, por lo que no se muestra el equilibrio inicial.
El gas y la presión deben coincidir con la información deseada. Presiones altas

(por ejemplo, 5 bares) de oxígeno puro se utilizan generalmente a temperaturas moderadas (por ejemplo,
60-80 ° C) cuando se miden los períodos de inducción para determinar la susceptibilidad de
materiales a la oxidación o para comparar la eficacia antioxidante. Sin embargo, bajo
estas condiciones, mecanismos y distribuciones de productos están muy sesgadas
relativa a la presión atmosférica (1 bar) mientras que a 1 bar de presión, la concentración de oxígeno
El sumo es demasiado bajo para una fácil visualización del cambio de presión ( Peng, 2010 ).
La están
Se presurización con 2 anismos
monitoreando bares de yaire purificado
productos funciona bien como un compromiso cuando se
específicos.
La información sobre la oxidación se obtiene a partir de patrones de consumo de oxígeno.
ción. Una marcada caída de presión después de una lenta disminución de oxígeno indica el final de la
periodo de inducción (Figura 1.4). Los períodos de inducción son bastante nebulosos químicamente.
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y se utilizan principalmente para comparaciones. Para análisis más definitivos, las tasas de
la oxidación se puede determinar a partir de las pendientes iniciales (m) de las curvas de oxidación, y
El consumo total de oxígeno durante un período de tiempo específico proporciona información sobre
estequiometría de reacción (oxígeno absorbido por gramo de aceite o muestra) ( Figura 1.4 ).
Cuando se utilizan aceites o materiales puros, la estequiometría se puede calcular en un
base molar y comparado con medidas de productos para rastrear la ruta de reacción
formas (Peng, 2010; Tian, 2013 ).
Por el contrario, el Oxidograph es un refinamiento del aparato de Fira-Astell para
medir el consumo de oxígeno. No es una bomba de oxígeno y solo maneja aceites.
o grasas derretidas. Las muestras de grasas / aceites en recipientes de reacción de vidrio sellados y agitados se
calentado a las temperaturas de prueba deseadas (rango 30–150 ° C) en un bloque de aluminio
luego expuesto a gases de prueba a presión atmosférica ( Figura 1.3 ). Como con el
Oxipres, la presión en la celda se mide electrónicamente mediante una presión sensible
transductor y registrado continuamente por computadora mientras las muestras se incuban.
Se pueden determinar tres valores:
● IP = período de inducción = tiempo desde el inicio hasta que aumenta la tasa de absorción de oxígeno
(relativo a la temperatura)
● PF = Factor de protección = IP con antioxidante / IP sin antioxidante
● LE = Extensión de vida = 100 × (PF - 1)%
Ventajas . Ambos instrumentos detectan los primeros cambios en la independencia de oxidación.

pendiente de las rutas reales del producto, así que dé respuestas sobre la oxidación más rápido que
OSI y Rancimat (véanse las Secciones 1.5.4.1 y 1.5.4.2 ) ( Nogala-Kalucka et al. ,
2005 ). El consumo de oxígeno refleja directamente la iniciación y la sensibilidad a la radiación.
formación cal, información que es difícil de obtener de otras formas. Muy preciso
El control de temperatura y presión hace que ambos sistemas sean muy útiles para controlar
incubaciones, así como para análisis de vida útil y determinación del período de inducción
ción. Los análisis se pueden realizar en muestras relativamente pequeñas: unos pocos gramos o
5 mL de aceite. El consumo de oxígeno puede relacionarse con otros cambios químicos por
extraer muestras en diferentes puntos del consumo de oxígeno y medir
hidroperóxidos, epóxidos, aldehídos, etc. El gas del espacio de cabeza en ambos sistemas puede
variar para probar los efectos de la atmósfera sobre la oxidación del aceite. Además, espacio de cabeza
en la celda Oxipres presurizada se puede ventilar a través de una trampa de desorción térmica para
recopilar productos volátiles para su análisis por GC (Figura 1.3) ( Repko Reader, 2013 ).
Se han abierto interesantes posibilidades de investigación al comparar la inducción
períodos determinados por el Oxipres / Oxidograph (que reflejan las reacciones iniciales)
versus por el Rancimat u OSI (medición de productos secundarios). Pruebas de aceites
estabilizados con varios antioxidantes mostraron períodos de inducción más cortos y mayores
diferencias entre aceites con Oxipres que con Rancimat ( Mikrolab, 2013 ).
Por el contrario, los Oxipres no pudieron detectar diferencias en invierno y verano nativos.
mantequilla, pero Rancimat pudo, y los Oxipres mostraron períodos de inducción más largos,
especialmente cuando se agregaron antioxidantes (Gramza-Michalowska et al., 2007 ).
El primer conjunto de resultados muestra que Oxipres es más sensible a las diferencias en
iniciación y oxidación temprana, y los aceites con diferente composición de ácidos grasos
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claramente tenía diferentes susceptibilidades al ataque radical. En contraste, el segundo set

de resultados refleja el predominio de los productos de descomposición secundaria en Rancimat
análisis. Las mantequillas eran básicamente la misma grasa pero con diferencias endógenas.
encesos en antioxidantes y otros factores. Por tanto, su iniciación fue la misma (no
cambio en los Oxipres) pero las mantequillas divergieron en reacciones secundarias.
La coordinación de los resultados de los métodos Oxipres y Rancimat / OSI puede ayudar a
izar puntos de varianza en la oxidación bajo diferentes condiciones.
Desventajas . Los transductores de presión generales no son específicos del oxígeno, pero
reflejan los cambios generales en la presión del espacio de cabeza. Los volátiles liberados por oxidación
Los lípidos ing contribuyen de manera insignificante a altas presiones de oxígeno, pero a menores
presiones y oxígeno más bajo (por ejemplo, 1 bar de aire), pueden aumentar la presión de la celda
y reducir el consumo aparente de oxígeno. Hemos encontrado que el vapor de agua de
Las muestras con mucha humedad también pueden interferir con el transductor de presión. Crítico
Es necesario determinar los límites de humedad-temperatura. Por ejemplo, la manu-
los fabricantes han monitoreado con éxito la oxidación de la mayonesa (15% de agua)
a 90 ° C, pero hemos tenido dificultades para analizar las margarinas (30-40% de agua) a
80 ° C y más. Los primeros modelos de Oxipres carecían de capacidad para agitar
aceites, lo que plantea interrogantes sobre la difusión del oxígeno en las muestras (Peng, 2010). Cómo-
Siempre, los modelos actuales tienen opciones de agitación disponibles. Presurizando con oxi puro
gen bajo altas presiones cambia la química de oxidación por lo que no refleja
reacciones en condiciones ambientales. Para la determinación del período de inducción y
comparación de formulaciones de ácidos grasos o antioxidantes, el fabricante recomienda
repara el funcionamiento de Oxipres a 5 bar O 2 a 80-100 ° C para una mayor sensibilidad y
para reducir el tiempo de oxidación. En estas condiciones, las reacciones son rápidas, lo que hace que
muy fácil de determinar la sensibilidad de un sistema o formulación a la oxidación, pero
Los procesos de oxidación son diferentes de los que ocurren cerca de la temperatura ambiente.
condiciones.
Aplicaciones . Determinación de períodos de inducción, tasas de oxidación y
Se ha aplicado el consumo total de oxígeno por Oxipres y Oxidograph.
evaluar las diferencias en la susceptibilidad innata de los aceites con diferente composición
o aditivos a la oxidación (Gramza-Michalowska et al., 2007), para probar y comparar
reducir la eficacia antioxidanteTrojakova y col., 1999; Nogala-Kalucka y col. ,
2005; Bragadottir, 2007 ) y estudiar la estabilidad térmica y las reacciones de los aceites.
( Peng, 2010; Repko Reader, 2013; Tian, 2013 ) Tanto Oxipres como Oxidograph
Los sistemas mantienen un control ambiental muy preciso para investigar la reacción.
mecanismos y efectos de las condiciones de reacción en la distribución del producto y para
coordinando el consumo de oxígeno con los productos (cinética y tipos) en los aceites.
Oxipres también proporciona información de oxidación útil sobre el estado oxidativo.
bilidad y, cuando se combina con otros ensayos de productos, los procesos de oxidación de
materiales alimenticios sólidos dentro de las limitaciones de humedad-temperatura indicadas anteriormente.
Los ejemplos incluyen arenilla de maíz extruida con diferentes niveles de aceite de girasol ( Ying
et al., 2015), maní y mantequilla de maní, papas fritas y otros bocadillos, galletas,
harinas de pescado y carne, galletas, bizcocho, alimentos secos para mascotas, leche en polvo y
queso curado (Schaich, KM, datos no publicados; Mikrolabs, Aarhus, Dinamarca).
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Agua
Acceso
Baño
espacio
Émbolo
Monitor de oxigeno
Baño cubrir
Incubadora
Muestra
cámara
2
Nivel fluído
Investigacion Pendiente = tasa rx
inclinar
Barra de agitación
Electrodo de O 2
% aire u O
Tiempo de prescripción (min)
FIGURA 1.5 Diagrama del sistema de electrodos de oxígeno YSI para registrar el consumo de oxígeno disuelto
ción en muestras de fluidos. Yellow Springs Instruments, Yellow Spring, OH, Estados Unidos.
Incluso hemos utilizado Oxipres para probar la estabilidad de los márgenes óseos amarillos frente a los rojos.
fila de diferentes especies animales (datos no publicados).
Debido a que el consumo de oxígeno refleja los procesos de iniciación y es independiente
Debido a las rutas de productos específicos, estos métodos merecen mucha más atención en
análisis de rutina. Integración del consumo de oxígeno con análisis de Rancimat
en la evaluación de la "estabilidad", en particular, puede ofrecer un medio interesante de distinción
determinar si un factor actúa sobre las reacciones de iniciación o de oxidación secundaria.
1.5.1.2 Oxígeno disuelto con electrodo de oxígeno YSI

Principio de análisis . A veces es importante determinar el consumo.
de oxígeno disuelto en una fase oleosa o emulsión en lugar de en el espacio de cabeza.
Aunque es un sistema más antiguo, el electrodo de oxígeno YSI (Yellow Springs Instru-
ments, Yellow Springs, OH) sigue siendo muy útil para seguir los cambios en
Oxígeno disuelto en soluciones y emulsiones. El sistema consta de un termo-
baño de agua sellado estacionado que contiene recipientes de vidrio para muestras con barras de agitación en el
parte inferior, y electrodos encerrados en mangas de epoxi (los hemos reemplazado con
Mangas de teflón para mayor inercia). Las muestras (unos mililitros) se colocan en
los vasos y los electrodos se insertan en la parte superior de la muestra. Una hendidura estrecha
en el lado del electrodo permite la ventilación de todo el espacio de cabeza y también proporciona un
conducto para la adición de catalizadores o antioxidantes para ensayos de efectos sobre la oxidación.
El sistema ahora ha sido informatizado y está disponible con software para controlar
registro y análisis de datos (Figura 1.5 ).
El corazón del sistema es el electrodo de Clark que determina el oxígeno.
consumo polarográfico en contacto con la emulsión oxidante.
La sonda tiene su propio microambiente de cloruro de potasio encerrado en
una fina membrana de teflón permeable al gas estirada sobre el extremo de la sonda.
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El oxígeno se difunde desde la muestra a través de la membrana hacia el KCl, donde

reacciona en el cátodo cuando se aplica voltaje:
O 2 + 2 H 2 O + 4 e - → 4 OH -
Esta es una reacción específica de oxígeno, y la corriente generada es proporcional

a la cantidad de oxígeno que penetra en la membrana. Difusión de oxígeno desde
La emulsión o solución a través de la membrana del electrodo es impulsada por presión.
diferencial. La relación entre la corriente del electrodo y la presión de oxígeno.
en solución / emulsión es lineal y estequiométrica. Una corriente de sonda de 1 μΩ es
equivalente al consumo de 8,3 × 10 −11 g de oxígeno por segundo por la sonda.
Así, un análisis típico consiste en establecer una línea de base para la muestra y luego
iniciar la grabación con o sin adición de un modificador. La corriente luego cae en
una tasa proporcional a su consumo de oxígeno. Los resultados se pueden informar como tasas
del consumo de oxígeno (p. ej., mol O 2 / min) o estequiometría (O 2 ) consumido / mol
lípido en un tiempo especificado.
Ventajas . Este sistema es mecánicamente simple y fácil de usar. Es espe-
específico al oxígeno y no responde a los productos de oxidación, por lo que proporciona información
no se puede obtener fácilmente por otros métodos. Tiempos de análisis relativamente cortos (típicamente
cally <30 min) son necesarios para obtener las curvas de consumo. Los electrodos son
sensible (3–250 μL O 2 / h en soluciones saturadas de aire; 15–250 μL O 2 / h en oxígeno
soluciones saturadas)
continuas, por y solo
lo que se se necesitan
pueden pequeñas
calcular las tasas demuestras (1-3
oxidación mL). El seguimiento es
tempranas.
Desventajas y precauciones . El sistema solo se puede utilizar con líquidos
y emulsiones con viscosidad lo suficientemente baja como para permitir el movimiento del
barra de agitación y para no impedir la difusión de oxígeno al electrodo. Los electrodos requieren
calibración cada día con soluciones saturadas de oxígeno o aire, y se debe tener cuidado
dado durante la instalación para eliminar todas las burbujas. El ensamblaje actual no es automático.
acoplable y solo puede ejecutar tres muestras a la vez, pero esto al menos permite disparar
licate muestras o un control y dos muestras de prueba del mismo material para ser
analizados simultáneamente. Debido a que la preoxidación influye en las tasas de oxidación, a
Los hidroperóxidos mínimos en los aceites o emulsiones de prueba deben medirse por separado para
establecer el grado inicial de oxidación. La temperatura debe ser constante durante
análisis (controlados por el baño de agua) y al comparar diferentes ejecuciones. A
Un cambio de temperatura de 1 ° C puede provocar un cambio del 4% en la calibración y el potencial.
tialmente más en el consumo de oxígeno durante la reacción.
Aplicaciones . Esta técnica se puede utilizar para probar la oxidabilidad de cualquier material.
rial en solución, suspensión o dispersión acuosa. Emulsiones y soluciones
son fáciles de analizar; También hemos analizado los aceites puros, pero las respuestas son más lentas.
porque la difusión de oxígeno se ve obstaculizada por la alta viscosidad. Aplicaciones
incluir la comparación del material de origen, la formulación, el catalizador y el antioxidante
efectos sobre las tasas de oxidación. La oxidación puede ser endógena, iniciada (p. Ej., Con
azidas o reacciones de Fenton), o inhibidas (p. ej., recoger la oxidación de la línea de base y luego
agregar antioxidante).
Página 55
1.5.2 GC de productos secundarios volátiles de la oxidación de lípidos
El análisis de productos volátiles por GC ha sido un pilar en la oxidación de lípidos

análisis, y de hecho es responsable de la mayor parte de nuestra comprensión actual de
Vías de oxidación de lípidos. La investigación de Frankel et al. (1977a, b, 1979, 1982 ,
1984, 1988), Frankel (1982, 1984, 1987, 1991), Grosch y Megele (1984) , y
Grosch (1987) en particular, identificó productos y su secuencia de generación.
esquemas de reacción y reacción para la descomposición de oleico, linoleico y linolénico
Los ácidos se han derivado de esta información.
Los productos de reacción volátiles siguen siendo un componente crítico de todos los protocolos para
análisis de oxidación de lípidos porque son lo que los consumidores huelen y asocian
con rancidez, y porque los productos específicos detectados muestran dónde las escisiones
y se han producido otras reacciones secundarias. Sin embargo, hay varios
salvedades importantes: los volátiles no deben ser el único análisis realizado; todos
los volátiles deben recolectarse, identificarse y cuantificarse (en lugar de descartar
todos menos unos pocos) para rastrear las vías activas y asegurar que las vías activas sean monitoreadas
tored; y los análisis de volátiles deben combinarse con ensayos para otros productos.
ayuda a comprender mejor cómo se oxidan los lípidos. Por ejemplo, integración
de hidroperóxidos, epóxido, carbonilo y análisis detallados de volátiles revelaron
contribuciones críticas de las adiciones de radicales peroxilo a los dobles enlaces, sin pasar por
generación de hidroperóxidoBogusz, 2015; Xie, 2015).
Dicho esto, la información sobre los volátiles obtenidos de GC varía
tremendamente, tanto cuantitativa como cualitativamente, con el método de muestreo
empleado: espacio de cabeza estático, microextracción en fase sólida (SPME) o dinámica
espacio de cabezaBogusz, 2015). Por lo tanto, los enfoques analíticos deben adaptarse a
instrumentación disponible, niveles y tipos de productos esperados y precisión
requerido. Ningún método es perfecto y, en general, se obtiene la mayor parte de la información
mediante la integración de múltiples enfoques.
1.5.2.1 Análisis de espacio de cabeza estático

Principio del análisis : Las muestras no oxidadas se sellan en un vial y se dejan
oxidar con volátiles que se generan in situ, o las muestras oxidadas se sellan en
un vial y se calienta suavemente para volatilizar los productos ya presentes. Volumen del espacio de cabeza
Los humos suelen
sis depende ser pequeños,de
del establecimiento típicamente de 5entre
un equilibrio a 20elml, parayconcentrar
vapor el líquido los
/ volátiles. El analisis
fases sólidas: los compuestos escapan al espacio de cabeza impulsados por su volatilidad innata
tilidad, pero limitado por la unión por la matriz y por el grado de saturación en el
fase de vapor. Las muestras de gas se extraen y se inyectan en un cromatógrafo de gases.
para analizar. Los detectores de ionización de llama y los estándares internos proporcionan
detectores de espectrómetro de masas y de ionización proporcionan identificación de volátiles separados
componentes (Wampler, 2004).
Ventajas : el análisis de espacio de cabeza estático ha sido el más simple y rápido
ensayo disponible para productos volátiles de oxidación de lípidos. Cromato de gases básico
Los gráficos están disponibles tanto en los laboratorios de control de calidad como en los de investigación.
Página 56
Las muestras se pueden analizar directamente sin preparación especial de muestras o sol-
extracción de ventilación, y se puede obtener una enorme cantidad de información de
muestras simplemente mediante la comparación de los tiempos de retención máximos con los estándares. El proceso
no es destructivo, por lo que los productos no volátiles se pueden medir en las mismas muestras
inmediatamente después de los análisis del espacio de cabeza para facilitar el seguimiento de múltiples vías.
Desventajas y precauciones : La sensibilidad general es baja porque lo
detectado depende de la dinámica del espacio de cabeza, así como de la volatilidad de los analitos. Cabeza-
Los equilibrios espaciales limitan las concentraciones y los tipos de compuestos que se acumulan.
en el espacio de cabeza, sesgando la vista de oxidación que se presenta para un número
de razones. Primero, la saturación del espacio de cabeza por componentes muy volátiles impide
evaporación de componentes menos volátiles. Por ejemplo, la generación rápida de pen-
tano u otros alcanos cortos de la escisión β de radicales alcoxilo en el último doble
Bond llena el espacio de cabeza y reprime la liberación de productos de cadena más larga de
α-escisión en la misma posición o desde otras posiciones en el ácido graso ( Bogusz
y Schaich, 2013). La sensibilidad también se reduce porque solo una pequeña porción
del espacio de cabeza, en el que los analitos ya están diluidos, se muestrea realmente.
La baja sensibilidad de detección en el espacio de cabeza estático subyace al aumento de la corriente
interés en SPME y purga y trampa / desorción térmica como muestreo alternativo
técnicas.
Una segunda limitación es que las temperaturas requeridas para forzar a los productos a salir
matrices en el espacio de cabeza (típicamente 60–120 ° C) pueden descomponerse o modificar
productos, por lo que los compuestos detectados pueden ser o no
ent en la muestra. Aunque calentar las muestras a cualquier temperatura superior a 40 ° C
aumenta los volátiles totales recolectados, también cambia los patrones de productos. En metilo
linoleato, por ejemplo, productos de oxidación volátiles C9 y C10 apenas presentes
a 25 y 40 ° C aumentan a temperaturas más altas porque las escisiones en esas posiciones
ciones ocurren más fácilmente con mayor energía disponible, no porque sean
más volátilBogusz, 2015; Xie, 2015).
La inyección directa de la muestra de espacio de cabeza pierde productos de cadena corta debido a
escapar, dando una vez más una imagen incorrecta de las vías de oxidación. Cryo-
Enfriamiento genico, ya sea con una criotrapa de nitrógeno líquido o hielo seco en el horno GC
Se requiere durante la inyección para atrapar productos de bajo peso molecular de cinco y
menos carbonos. El enfriamiento criogénico también enfoca los analitos en la columna inicial
sección y mejora la resolución y la cuantificación.
La cuantificación es principalmente relativa, basada en áreas de picos. Presunta identificación
y las concentraciones aproximadas de los principales volátiles se pueden determinar a partir de
curvas estándar preparadas a partir de compuestos auténticos. Sin embargo, los estándares son
no disponible para todos los productos de oxidación de lípidos que se pueden anticipar. Masa
Luego se requiere espectrometría para identificar productos desconocidos. Cuantificación absoluta
La relación con los estándares no es sencilla porque cualquier estándar agregado al
La muestra puede alterar la oxidación y ciertamente interviene en los equilibrios del espacio de cabeza.
Aplicaciones . Los análisis de espacio de cabeza estático son ampliamente aplicables a los análisis
de la mayoría de los tipos de alimentos o sistemas modelo, excepto aquellos con alto contenido de solvente o agua
contenidos que saturan tanto el espacio de cabeza como el detector de cromatografía, o
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donde los altos niveles de ingredientes muy volátiles (p. ej., sabores o aromas) enmascaran
productos de oxidación de lípidos. De hecho, los análisis de espacio de cabeza estático han sido uno de los
Los métodos más ampliamente aplicados para monitorear la oxidación de lípidos en todo tipo de
alimentos, con muchos miles de informes publicados.
1.5.2.2 SPME
Principio del análisis : SPME (no confundir con extracción en fase sólida
utilizado para la limpieza de muestras) busca mejorar la sensibilidad de los análisis de espacio de cabeza
adsorbiendo y concentrando selectivamente los volátiles en una sílice fundida recubierta
fibra unida al extremo de un émbolo de microjeringa con una funda protectora. La
La fibra se inserta en el vial del espacio de cabeza a través del tabique y se le da tiempo para
adsorber analitos ya sea del espacio de cabeza sobre la muestra o de la muestra
sí mismo, si es líquidoFigura 1.6 ). Luego, la fibra se retira de nuevo a su funda y
transferido a un cromatógrafo de gases, donde se inserta en la inyección caliente
puerto y desorbido en el cromatógrafo ( Arthur y Pawliszyn, 1990; Zhan g
y Pawliszyn, 1993 ). Una excelente introducción a SPME, sus controles y sus
aplicaciones ha sido presentado por Vas y Vékey (2004).
La sensibilidad y la selectividad están controladas por el carácter y el grosor de
la fibra, el tiempo y temperatura de adsorción, y el tiempo y temperatura de desorción
peratura, todo lo cual se puede variar para maximizar la detección de compuestos de
interés ( Pawliszyn, 2006). La fibra de vidrio, generalmente de 1 a 2 cm de longitud, está recubierta
con fases sólidas aplicadas solas o en combinación para proporcionar selectividad en
adsorción de analitos. Retención de analito SPME en función de la polaridad de la fibra
y la reticulación se muestra gráficamente en la Figura 1.7 . El espesor del revestimiento
rige en gran medida la retención cuantitativa.
Retraer la fibra, Retraer la fibra,

retirar atravesar retirar
atravesar Exponer fibra, aguja tabique en Exponer fibra, aguja
pulpa adsorber Entrada de GC desorber
analitos analitos
EXTRACCIÓN DESORCIÓN
FIGURA 1.6 Diagrama de flujo simplificado del proceso de extracción de SPME. Adaptado y rediseñado
de Supelco (2003); utilizado con permiso.
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PDMS PDMS PDMS

(7 μ m) (30 μ m) (100 μ m)
COCHE / PDMS
(75 μ m)
bajo
DVB / COCHE / PDMS
(50/30 μ m)
Pensilvania
(85 μ m) PDMS / DVB
(65 μ m)
POLARIDAD
CW / DVB
(65 μ m)
CW / TPR
elevado
(50 μ m)
FIBRA
PROPIEDADES RETENCIÓN débil s trong
Garantizado No adherido Parcialmente reticulado Altamente reticulado
FIGURA 1.7 Relación entre propiedades moleculares, polaridad y retención en fibras SPME.
PDMS, polidimetilsiloxano; COCHE, carboxen; DVB, divinilbenceno; PA, poliacrilato; CW, coche
bowax; TPR, resina con plantilla. Redibujado deKataoka y col. (2000); utilizado con permiso.
El polidimetilsiloxano (PDMS) es el caballo de batalla del método y tiene la

aplicaciones más amplias. Es una fase líquida apolar muy resistente que resiste
altas temperaturas del inyector (hasta 300 ° C) y funciona bien con mate-
riales. Sin embargo, solo es demasiado no polar para los productos de oxidación de lípidos. Añadiendo
divinilbenceno (DVB) a PDMS aumenta la polaridad y la retención, lo que lo convierte en un
buena elección para análisis de trazas de compuestos C6-C15. Aumenta la reticulación
su durabilidad.
Carboxen (CAR) es un recubrimiento de partículas polares con microporos que se
completamente a través de las partículas, facilitando la unión y desorción de pequeños mol-
eculas como los aldehidos de cadena corta (Kataoka y col., 2000). Por sí mismo, CAR es
no muy estable a condiciones oxidantes (degradación evidenciada por oscurecimiento o
pulverización de la fibra). Sin embargo, cuando se mezcla con otros recubrimientos, tremen-
aumenta enormemente la extracción de compuestos polares de matrices no polares, y
aumenta la retención de alcanos cortos (etano a hexano, productos de
β-escisión de radicales alcoxilo formados en el último doble enlace de ácidos grasos) por
órdenes de magnitud. El rango de retención es de C2 a C12 ( Mani, 1999; Shirey, 2012 ).
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Una fibra trifásica única (DVB / CAR / PDMS) ha sido desarrollada por
mezcla de carboxeno con PDMS en una capa interior de 30 μm sobre una fibra reforzada
núcleo, luego recubriendo esto con una capa exterior de 50 μm de DVB. Esta capa DVB extrae
cadena más larga y semivolátiles, mientras que la capa interior de CAR adsorbe los más pequeños
moléculas más volátiles ( Page y Lacroix, 2000 ). Es esta mezcla de cualidades
que hace que la fibra DVB / CAR / PDMS sea la fibra más preferida para muestras que
tienen una amplia gama de polaridades de analito y longitudes de cadena. Esta fibra es especifi-
calmente selectivo para compuestos en el rango C2 a C20 ( Wardencki et al., 2007 ) y
ha resultado ser particularmente útil para productos de oxidación de lípidos.
El muestreo de SPME es mucho más complejo que simplemente seleccionar una fibra, pegarla
en un vial durante unos minutos, luego analizando los compuestos recolectados. Película gruesa
ness, constante de distribución (atracción de unión relativa a la matriz de la muestra),
y el tiempo de unión interactúan con las propiedades de la fibra para controlar lo que SPME
detectaMani, 1999 ). Las fibras contienen solo una pequeña cantidad de adsorbente (∼0,5 μL
en una fibra de 100 μm) por lo que su capacidad de unión es limitada. En una mezcla de analitos
como los productos de oxidación de lípidos, existe una dinámica interesante en la unión de
los diversos compuestos. Los productos no se unen todos a la vez o al mismo ritmo,
especialmente cuando se usa una fibra mixta. A diferencia del análisis de espacio de cabeza estático donde
la mayoría de los compuestos volátiles aparecen primero y en concentraciones más altas, en SPME
Los volátiles con un enlace fuerte se adsorben primero y los compuestos con un enlace más débil.
ing adsorber más tarde y menos, en competición. Si la recolección máxima de productos es
deseado, se necesitan, por tanto, tiempos más largos para recoger todos los compuestos. En el
Al mismo tiempo, si la película es demasiado delgada y la capacidad demasiado pequeña, con una adsorción más prolongada
veces, paradójicamente, algunos compuestos de menor unión pueden desplazar compuestos
originalmente adsorbido en la superficie de la fibra, generando así una dis-
contribución. Para evitar esto, se debe aumentar la capacidad con una capa más gruesa. Si, en
Por otro lado, el análisis busca cuantificar solo uno o un número limitado de
compuestos (por ejemplo, hexanal), recubrimientos más delgados y el tiempo suficiente para maximizar
La adsorción hexanal debe usarse para eliminar la interferencia potencial de otros
compuestos. Desafortunadamente, SPME no es un proceso susceptible de estandarización
porque los volátiles y la dinámica de liberación varían con la matriz alimentaria. Por lo tanto, opti-
El tiempo de adsorción de la madre debe determinarse de forma independiente para cada alimento, fibra,
y particularmente el (los) objetivo (s) volátiles. Los tiempos de adsorción típicos son de 10 a 30 min.
pero puede extenderse hasta varias horas ( McNair y Miller, 2009 ).
El tiempo y la temperatura de desorción en el inyector del GC también deben optimizarse para
cada conjunto de condiciones. Los tiempos de desorción varían con las características del analito.
pero normalmente un promedio de 5 a 20 min.
Ventajas . SPME proporciona una colección de preparación de muestras rápida y sencilla de
volátiles con la opción de maximizar el rendimiento o la selectividad según la fibra
y espesor de revestimiento seleccionado. Se obtienen órdenes de magnitud en sensibilidad
sobre el análisis de espacio de cabeza estático porque los volátiles se concentran desde el
espacio de cabeza, no sólo un volumen limitado, y porque la eliminación continua de vola-
Las baldosas por adsorción a la fibra proporcionan una fuerza impulsora que mueve las moléculas de
la muestra al espacio de cabeza. Por lo tanto, SPME aumenta la detección de semivolátiles,
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particularmente los aldehídos C8 a C10 que se detectan mal en el espacio de cabeza estático
análisis. Además, las fibras SPME se pueden utilizar con casi todo tipo de sistemas alimentarios.
Todos estos factores han contribuido a un gran aumento en la utilización de SPME en
análisis de oxidación de lípidos.
Desventajas y precauciones . Mientras SPME detecta más compuestos,
su selectividad también presenta claras dificultades para los análisis de oxidación de lípidos en
que los productos se detectan y cuantifican en función de la preferencia de fibra más que
niveles reales generados en reacción. Por lo tanto, las distribuciones de productos están sesgadas
relativo al espacio de cabeza estático y puede o no ser representativo de la
oxidación de lípidos. Además, siempre existe una competencia entre productos por
unión independientemente de las características de la fibra. Por ejemplo, la competencia vinculante
La relación entre alcanos y aldehídos cambia con el tiempo de adsorción y el grado de
oxidaciónBogusz, 2015 ), y en análisis de fosfolípidos marinos, Strecker
Los aldehídos de las reacciones de Maillard se adsorben más fácilmente que los alcalinos y
alkenals (C. Jacobsen, comunicación personal). En estas condiciones, ya sea
buscando productos específicos que hayan sido desplazados (en lugar de no formados)
o cuantificar los productos por áreas de pico totales dará una imagen totalmente incorrecta de
oxidación.
Los productos de oxidación de lípidos siempre tienen el potencial de causar problemas con
SPME por su potencial reactivo. La adsorción a la fibra puede descomponer
plantear algunos productos de oxidación o formar otros nuevos, como el aumento de reordenamientos
niveles de furano con tiempos de extracción más largos y temperatura más alta ( Adams et al. ,
2012 ). Los productos de oxidación también pueden degradar los revestimientos de fibras. Carboxen es
sensible a la oxidación a temperaturas elevadas, volviéndose oscuro y / o polvoriento.
También se hincha en agua. Hemos observado al menos un caso de fibras con carboxeno.
ensuciamiento durante los análisis de margarinas oxidantes. Por la misma razón, alto
Los gases portadores de pureza son obligatorios para SPME.
La degradación y la fragilidad de las fibras plantean otro problema: a menudo
debe ser reemplazado varias veces durante un estudio con muchas muestras y ampliado
veces. Por lo tanto, debido a que existe una variación significativa de lote a lote entre
fibras, las fibras suficientes para un estudio completo deben obtenerse del mismo lote
para garantizar la coherencia del análisis.
Es fácil exceder el rango de capacidad de fibra cuando se usa solo una
tiempo de extracción / adsorción, en cuyo caso la correlación entre los volátiles gene-
los compuestos volátiles se eliminan y se pierden. Para evitar esto, cada sistema analizado debe
ser probado para determinar la cinética de unión y el tiempo para la unión máxima ( Jung
y Ebeler, 2003; Pawliszyn, 2006; Ma et al., 2014). Cuando ocurre la saturación,
como en un alimento altamente oxidante, muestras más pequeñas, tiempos de adsorción más cortos,
o recubrimientos de fibra más gruesos pueden resolver el problema. Dilución de la muestra en agua o
solución salina, como se recomienda para reducir la volatilización en volátiles generales
análisis, no es apropiado con la oxidación de lípidos porque estos tratamientos
alterar los productos de oxidación.
Al igual que con el espacio de cabeza estático, la cuantificación en SPME no es sencilla
porque es difícil encontrar un estándar que cuando se agrega a alimentos con oxidantes
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los lípidos (1) no modificarán la oxidación de los lípidos, (2) no se modificarán por sí mismos por
radicales lipídicos o productos secundarios, (3) no se unirán a las moléculas de los alimentos,
y (4) se liberará completamente y se unirá completamente a la fibra.
Aplicaciones . SPME está viendo un uso cada vez mayor en una amplia gama de óxidos lipídicos
análisis de dación en alimentos y sistemas modelo. Para proporcionar solo algunos ejemplos,
Las fibras CAR / PDMS se han utilizado para analizar la oxidación de lípidos inducida por la luz en
leche (recubrimiento de 30 μm) ( Correddu et al., 2015 ), oxidación de ácidos de aceite de linaza
agregado a las bebidas lácteas ( Giroux et al., 2008 ), el efecto de los antioxidantes sobre la oxidación
ción de emulsiones de pescadoIglesias et al., 2010 ) y músculo de pescado (75 mμ) (Pazos
et al., 2010), y hexanal de la catálisis de hemo de oxidación de ácidos grasos (75 mμ)
( Lorrain et al., 2010 ). Las fibras PDMS / DVB se utilizan ampliamente para determinar el hexanal.
Se han aplicado fibras DVB / CAR / PDMS para determinar los efectos de la frambuesa.
extractos sobre la estabilidad del muesli (Klensporf y Jeleń, 2008 ), volátiles en aceituna
aceite ( Zhu et al., 2013); oxidación de lípidos en productos porcinos ( Estévez et al., 2003 ),
las empanadas de polloMariutti et al., 2009) y alimentos extruidos para mascotas (B. Bogusz y
KM Schaich, datos no publicados); así como los mecanismos de oxidación en metil
linoleatoBogusz, 2015).
1.5.2.3 Purga y Trampa / Desorción Térmica

Principio del análisis : como se indica enSección 1.5.2.1 , análisis del espacio de cabeza estático
están limitados por equilibrios de espacio de cabeza desventajosos en los que la alta volatilidad de
algunos productos impiden la volatilización de otros productos. Espacio de cabeza dinámico
El análisis se introdujo a principios de la década de 1960 para superar este problema mediante
eliminar continuamente los volátiles de muestras líquidas o sólidas (Swinnerton y col. ,
1962 ). Desde entonces, la técnica se ha desarrollado en varias direcciones para manejar
diferentes tipos de muestras. El proceso total consta de dos etapas: purga y
trampa, seguida de desorción térmica. En la etapa de purga y trampa, la muestra se
calentado para facilitar la liberación de volátiles. Durante el proceso, el gas inerte es continuo
pasado sobre sólidos o líquidos en tubos o aceites en matraces para llevar
libera los volátiles de la muestra y los deposita en un tubo empacado
con material absorbente donde quedan atrapados y concentrados ( Figura 1.8). La
La trampa se conecta a un cromatógrafo de gases a través de una unidad especial colocada en
entrada, y los volátiles se desorben del tubo a la columna por calor bajo
un flujo de gas inerteGrimm y col., 2002) en un proceso llamado térmico de trayectoria corta
desorción ( Manura y Hartman, 1992 ). Los volátiles se separan y analizan
por GC apropiado con detección por ionización de llama, MS o ambos.
Al igual que con SPME, las resinas absorbentes empaquetadas en la trampa son el corazón del método.
porque determinan lo que se retiene de la fase gaseosa y se libera a la
GC parason
ductos análisis.
Tenax Los dos
® (un tipos deporoso
polímero adsorbentes
de polimás útiles parap los
(2,6-difenil- productos
fenileno de yoxidación de lípidos
óxido))
CAR (un tamiz molecular de carbono) (Jochman y col., 2014). Tenax ® hidrofóbico
(Buchem BV, Apeldoorn, Países Bajos), diseñado específicamente para atrapar vola-
baldosas y semivolátiles de matrices líquidas o sólidas, es la resina más utilizada
para adsorción térmica. Une una amplia gama de clases de compuestos con cadenas
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Prueba de comida
Óleo sobre lana de vidrio Tubo de desorción

o soporte sólido Volátiles
con trampa de resina
gas de purga
Seco
Gas burbujeante
Adaptador de aguja Desorción

tubo
Gas de purga seco
Tapa de resina atrapada

TD
Térmico
control
Burbujeo Desorción
software
aguja Unidad
Electrónica
Prueba de aceite controlador
Espectrometría de masas Puerto de inyección de GC
Cryotrap
SRA
Interfaz Capilar
columna
Horno GC
FIGURA 1.8 Configuraciones típicas de purga y trampa / desorción térmica para aceites y aceites que contienen
alimentos.
longitud superior a cinco carbonos, y cubre el rango de longitud de cadena esperado para
la mayoría de los productos de oxidación de lípidos volátiles (hasta aproximadamente C11). No le afecta el agua,
lo que significa que se puede utilizar para atrapar lípidos volátiles de todo tipo de productos alimenticios,
incluidas las emulsiones. El Tenax original tenía problemas de sangrado e imputación.
ridades. Esto ahora ha sido modificado, y una nueva versión de alta pureza, Tenax ® -TA,
es el mejor sorbente general para productos de oxidación de lípidos debido a su bajo respaldo
suelo. Tenax ® GR, un compuesto de Tenax TA con 23-30% de grafito agregado a
aumentar las propiedades de retención, se ha informado que extiende el rango de análisis a
compuestos de punto de ebullición más bajo, limitan la absorción de agua y aumentan la unión de aro-
compuestos matemáticos ( Cao y Nicholas Hewitt, 1993). Con lípidos, su comportamiento es
comparable a Tenax-TA, pero el rendimiento depende en gran medida de la calidad
de grafito agregado porque los metales y otros contaminantes causan fondos altos
y degradación de analitos (TG Hartman, Rutgers University Mass Spectrom-
etry Facility, comunicación personal). Las variaciones en el componente de grafito pueden
contribuir a diferentes resultados (no útiles / útiles) informados cuando Tenax GR fue
utilizado con productos de oxidación de lípidos (Jochman y col., 2014; Alemán et al., 2015).
Carboxen (Supelco, Bellafonte, PA) es un tamiz molecular con microporos
que unen pequeños volátiles (C2 a C5) por interacciones de van der Waals y agua por
condensación. Este patrón de unión complementa el de Tenax, por lo que las dos resinas
se combinan con frecuencia en trampas de lecho mixto. En lugar de estar mezclados,
las resinas se empaquetan en secuencia con el CAR colocado detrás del Tenax para
evitar la penetración de compuestos más grandes durante la unión y permitir la primera liberación
de los pequeños volátiles a temperaturas más bajas durante la desorción ( Figura 1.9 ).
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Volátiles Tenax Carboxen GC
Cmpds más grandes, C2-C5 y H 2 O unido,

Paso C2-C5 y H 2 O lanzado primero durante
mediante desorción
FIGURA 1.9 Configuración de trampas de lecho mixto empacadas con Carboxen y Tenax.
Debido a que los compuestos atrapados por CAR son tan volátiles, el criotrapeo durante
la desorción es obligatoria cuando se utiliza esta resina.
Las aplicaciones exitosas de desorción térmica requieren adaptar la combinación
ción de las características de adsorción y las temperaturas de desorción a los analitos de
interés en mejorar la captura y la resolución (Manura, 1999 ). Por ejemplo, como
mostrado en la Figura 1.10 , Tenax libera aldehídos y alcoholes de cadena corta a media
Hols con casi el mismo perfil de temperatura que los hidrocarburos hasta cadena larga
longitudes (20). Esto significa que todos los productos se mezclarán en el cromatograma, haciendo
ing resolución e identificación más difícil. Carboxen, por otro lado,
libera productos oxigenados a temperaturas más altas que los hidrocarburos en
Tenax. Los dos sorbentes juntos, entonces, facilitan la separación de clases de productos.
en desorción y GC - los hidrocarburos se desorben y eluyen a temperaturas más bajas
mientras que los productos de oxidación se mueven solo después de que se aumenta la temperatura.
Ventajas : a menudo, compuestos que apenas o no son detectados por la estática
espacio de cabeza y SPME pueden quedar atrapados por desorción térmica y con menos
sesgos. Eliminación constante de compuestos volatilizados del pro-
representa una fuerza impulsora fuerte para mantener un flujo continuo de sustancias potencialmente volátiles
compuestos a la superficie de la muestra donde pueden evaporarse, por lo que la recolección de
volátiles es mucho más completo que con espacio de cabeza estático o método SPME
ods. La concentración de volátiles en la trampa aumenta la sensibilidad a partes por mil millones
(ppb) detección (Wampler, 2004 ) y falta de limitaciones de equilibrio del espacio de cabeza.
y un menor sesgo de enlace mejora la precisión del análisis. Los métodos pueden ser
utilizado con materiales alimenticios sólidos y semisólidos que tienen un rango más amplio de humedad
porque Tenax no se envenena con agua como algunas fibras SPME, mientras que CAR
retiene la humedad que de otro modo crearía problemas en el análisis del espacio de cabeza estático
ses y en el GC.
La cuantificación absoluta de volátiles como μg / trampa se puede lograr mediante la inyección de
patrones internos deuterados en trampas después de la adsorción de la muestra ( Ames et al. ,
2001 ). Un cóctel de patrón interno que consta de 1 μL cada uno de 10 mg / ml de ben-
zene-d6, tolueno-d8 y naftaleno-d8 en metanol pueden proporcionar normalización
ción de los tiempos de retención de una ejecución a otra, así como la cuantificación mediante la comparación de
analice las áreas de pico a las de los estándares.
Desventajas y precauciones : aunque simple en concepto, térmico
La desorción debe manejarse con cuidado en cada paso para garantizar buenos resultados.
( Grimm et al., 2002). Los tiempos de sorbente, purga y los caudales de purga deben ser
coincidir con los compuestos que se están analizando o algunos compuestos pueden no ser
atrapados mientras que otros pueden no ser liberados. Pérdida de volátiles en fugas debido a la
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Cadena de carbono 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
100 200 300 400
100 200
100 200
º
Punto de ebullición C -100 30 100 200 300 400
Cadena de carbono 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 15
200 300
100 200 300 400
100 200 300 400
100 200 300 400
100 200 300
100 200 300
100 200
º
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 16 20 24
400
100 400
200 300 400
200 300 400
100 200 300
100 200 300
100 200
º
FIGURA 1.10 Propiedades de los sorbentes de trampa de desorción térmica utilizados para recolectar volatilidad de oxidación de lípidos.
losas. Los números en la parte superior de cada gráfico indican la cantidad de carbonos en compuestos de cadena lineal.
de cada clase. Los números en la parte inferior de cada cuadro indican los puntos de ebullición correspondientes a la
longitudes de cadena. Las barras del gráfico muestran la gama útil de compuestos que se pueden analizar.
por cada resina, y dan la temperatura requerida para desorber compuestos de varias longitudes de cadena.
Adaptado de la información del sitio web de Scientific Instrument Services ( http://www.sisweb.com/
index / referenc / bv-alc.htm; http://www.sisweb.com/index/referenc/bv-hyd.htm; http: //www.sisweb.
com / index / referenc / bv-aldeh.htm). Usado con permiso.
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muchas conexiones mecánicas y reconexiones necesarias, así como durante

La inyección es una amenaza constante. La temperatura de desorción y el flujo de gas deben
controlados con cuidado para evitar el sobrecalentamiento o los puntos fríos, así como para asegurar
desorción completa ( Wampler, 2004). Las trampas deben reacondicionarse mediante descarga de gas y
"Horneado" entre muestras para evitar el arrastre de analitos. Las trampas, resinas y
La instrumentación especializada hace que la desorción térmica sea sustancialmente más costosa.
sive que el espacio de cabeza estático y SPME, aunque el costo es contrarrestado por
información obtenida.
Al igual que con el espacio de cabeza estático y el análisis SPME, la inestabilidad de los lípidos
Los productos de oxidación limitan parte de la flexibilidad de los análisis de desorción térmica.
Ambas temperaturas de purga y desorción deben restringirse a la temperatura más baja.
peraturas suficientes para la volatilización de las muestras y el avance de las trampas
para evitar la descomposición y transformación de los productos de oxidación existentes, así como
formando productos de artefactos ( Uhde, 2009 ). La combinación de humedad y calor.
es particularmente dañino para los lípidos, por lo que es posible que las muestras deban secarse para oxidación.
análisis de las operaciones.
Aplicaciones . La desorción térmica ofrece un enorme potencial para seguir
oxidación de lípidos en sistemas modelo en investigación y vida útil acelerada (ASL)
estudios de una amplia gama de alimentos en control de calidad, así como niveles de medición
y distribución de productos de oxidación de lípidos en los alimentos almacenados (p. ej., edad y calidad
seguimiento de alimentos procesados en almacenes). Actualmente, el principal impedimento
son disponibilidad de instrumentación, sesgo y miedo debido a la falta de familiaridad,
y falta de desarrollo de métodos para aplicaciones específicas. Con suerte, estos
los obstáculos se superarán en un futuro próximo.
En el pasado, los volátiles de oxidación de lípidos de cadena corta se han ignorado en gran medida como
sin importancia en la calidad de los alimentos. Sin embargo, de acuerdo con el nuevo paradigma de
análisis de oxidación de lípidos que analiza tantos productos como sea posible para identificar
la presencia de vías alternativas, la capacidad de detectar estos productos en
Las trampas CAR / Tenax proporcionan información crítica para una comprensión completa de los lípidos.
reacciones de oxidación. Incluir alcanos inodoros de cadena corta en los análisis (n-3
ácidos grasos y pentano de ácidos grasos n-6) pueden identificar condiciones que favorecen
β-escisiones de radicales alcoxilo en el último doble enlace frente a los que facilitan
α-escisión para generar aldehídos que los consumidores definitivamente huelen. Formalde
Descomposición de señales de hidróxido, acetaldehído y butanal de productos secundarios,
contribuyen a sabores extraños y condensaciones con proteínas, y pueden explicar por qué
pueden faltar los productos esperados (especialmente epóxidos).
1.5.3 Espectroscopía FTIR

La espectroscopia IR mide la absorción de radiación electromagnética en rangos
que proporcionan energía suficiente para inducir transiciones entre estados vibracionales
de enlaces dentro de moléculas. Están involucrados tres rangos de frecuencia (longitud de onda):
IR lejano, medio y cercano, cada uno de los cuales afecta a un tipo diferente de vibraciones ( Tabla 1.5 ).
Para proporcionar un marco de referencia, la energía absorbida por las moléculas en el IR medio
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TABLA 1.5 Rangos de frecuencia y vibraciones moleculares afectadas

en espectroscopia infrarroja
Rango de frecuencia
Longitud de onda Número de onda

Región (μm) (cm −1 ) Vibraciones excitado
Cerca 0,75-2,5 12.500–4.000 Vibraciones fundamentales
Medio 2,5–50 4000–400 Armónicos y

combinaciones
Lejos 50–1000 400–5 Vibraciones de la columna vertebral

de moléculas grandes
De Chong (2015); utilizado con permiso.
está entre 15 kcal / mol y 1 kcal / mol (Wade, 1991 ). A diferencia del químico y
análisis cromatográficos descritos anteriormente que detectan moléculas enteras intactas,
La espectroscopia IR detecta y distingue grupos funcionales individuales por su
varios modos de vibración: estiramiento, flexión, balanceo, meneo, tijera,
retortijón. Cada grupo funcional absorbe energía a frecuencias independientes, pro-
Vide un medio de identificación. Para detectar todos los grupos funcionales en una molécula
cule o muestra, los espectrómetros IR escanean el rango completo de frecuencia y energía, luego
trazar la intensidad de absorción en función de la frecuencia (números de onda / cm) en un
espectro. Los picos aparecen en frecuencias en las que los grupos están presentes en la (s) molécula (s)
absorber energía, con intensidades máximas proporcionales al número de grupos presen-
ent. Las frecuencias e intensidades máximas proporcionan una base para la identificación de
estructura en moléculas puras (la aplicación tradicional) o para seguir cambios
en materiales durante reacciones químicas o tratamientos, como se usa con mayor frecuencia con
oxidación de lípidos.
La aplicación de IR al análisis de oxidación de lípidos se retrasó durante décadas debido a
limitaciones instrumentales. Los espectrómetros de infrarrojos originales eran de rejilla o dispersivos
instrumentos en los que las rendijas controlaban la sensibilidad y la resolución espectral.
La apertura de las rendijas aumentó la luz que incide en la muestra, por lo tanto, aumentó
intensidad de la señal, pero esto también propaga la señal y aumenta la superposición entre
cerrar picos. Cerrar las rendijas mejoró la resolución pero también disminuyó la sensibilidad.
Además, las rendijas enfocaron la fuente de luz en la muestra una longitud de onda en un
tiempo, por lo que tomó muchos minutos escanear un espectro completo. Análisis de oxidación de lípidos
se realizaron con estos instrumentos, pero la poca sensibilidad y superposición
sición de picos de varios grupos funcionales en productos impidió a gran escala
aplicación del método.
Integración de FTIR a principios de la década de 1970, junto con el desarrollo y
la creciente sofisticación de las computadoras personales, proporcionó un salto cuántico en el sentido
Sitividad, resolución, velocidad y procesamiento de datos mejorado que ahora hace que FTIR
Página 67
una metodología analítica muy atractiva para detectar y cuantificar múltiples

productos en aceites, extractos y materiales alimenticios intactos ( Dufour, 2009 ). Existen
Varias diferencias clave en IR introducidas por la transformada de Fourier ( Subramanian
y Rodriguez-Saona, 2009). Primero, en lugar de separar el haz de luz IR en
longitudes de onda individuales, un interferómetro de Michelson alrededor de la cámara de muestra
intercepta el haz incidente y lo divide en dos, cada uno con una frecuencia completa
distancia. Una mitad está dirigida hacia un espejo fijo y la otra hacia un
espejo que se mueve continuamente a una distancia de aproximadamente 2,5 μm. El haz
del espejo estacionario se refleja directamente de regreso al detector mientras que el
haz del espejo móvil que proporciona los pases de variación de longitud de onda
a través de la muestra en el camino. Los dos haces se recombinan en el detector,
induciendo un patrón de interferencia establecido por la absorción de energías discretas por
la muestra. Dado que todas las frecuencias están presentes y monitoreadas simultáneamente
a medida que el haz pasa a través de la muestra, todo el espectro requiere menos de un
unos segundos para grabar. En este punto, los datos están en forma de tiempo de movimiento del espejo.
ment. Este valor luego se somete a la transformada de Fourier, una serie de matemáticas complejas.
cálculos matemáticos para convertirlo de vez en cuando en frecuencia, utilizando la constante
velocidad del espejo. Para reducir en gran medida la señal a ruido, se utiliza un láser de helio-neón
dirigido simultáneamente a través del interferómetro de Michelson como una frecuencia
referencia para alinear los escaneos repetidos exactamente y permitir el promedio de la señal digital. Esto
no fue posible en instrumentos dispersivos. Entre ópticas mejoradas y complementos
ción del promedio de la señal, la relación señal-ruido aumenta en más de 10 veces
en instrumentos FT. Finalmente, las computadoras proporcionan un control preciso sobre el movimiento del espejo.
que aumenta drásticamente la resolución espectral, digitalizan y almacenan datos,
y abrir vastas capacidades nuevas para la manipulación matemática y el análisis de
espectros. La mayoría de los sistemas ahora vienen con software para quimiometría, un potente
Análisis estadísticos para identificar y relacionar patrones en datos complejos. Los datos
La minería hecha posible por la quimiometría ha revolucionado los análisis de infrarrojos, seleccionando
características clave asociadas con los cambios oxidativos en lugar de cuantificar los indicadores
picos de productos individuales y una precisión cada vez mayor de los análisis cuantitativos.
El uso de quimiometría se describirá con más detalle más adelante.
Tanto el IR medio como el cercano tienen dos modos de muestreo dependiendo de cómo
Se presenta un haz de luz al material de muestra. En modo de transmisión, muestras
se presentan en capas delgadas (<10 μm) y el haz de infrarrojos pasa directamente a través,
interactuando con las moléculas en el camino. Este es el modo principal para puros
compuestos y lo que la mayoría de la gente asocia con el muestreo IR, pero la mayoría de los alimentos
los materiales no se acomodan fácilmente, incluso si están deshidratados. Total atenuado
El modo de reflectancia (ATR) se desarrolló para superar las limitaciones de manipulación de películas delgadas.
ciones y proporcionan una alternativa para analizar materiales mezclados intactos directamente
( Sedman et al., 1999; Glassford et al., 2013 ). De manera simplista, en reflectancia
modo, la radiación se refleja en la superficie de una muestra en lugar de ser trans-
mitted a través de él. La muestra se pone en contacto con un cristal de alta refracción.
índice tivo ( η ), como diamante, germanio, seleniuro de zinc. Cuando el rayo de infrarrojos
pasa a través del cristal, una parte se refleja y otra se transmite, diluyéndose
Página 68
n cristal > n muestra Muestra

Región evanescente, ~ 1 m μ
Cristal ATR
Haz de infrarrojos incidente Haz de infrarrojos atenuado al detector
FIGURA 1.11 Representación esquemática de reflectancia total atenuada (ATR) en análisis IR.
Infrarrojo medio Infrarrojo cercano

100 1.2
95
1.0
90
mi85 0,8
80
75 0,6
70
sesenta y cinco Reflectancia

0.4
Transmittanc
60
0,2
55
50 0
100000 9000 8000 7000 6000 5000 4000
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Número de onda (cm) cm -1
FIGURA 1.12 Comparación de espectros infrarrojos de diferentes rangos de frecuencia. Espectros de infrarrojos medios
tienen bandas fuertes y nítidas, mientras que los espectros del infrarrojo cercano son amplios y difusos. IR medio, a base de aceite de coco
margarina; aceite de girasol con alto contenido de ácido oleico casi IR mezclado 15:85 con harina de arroz.
el haz de luz. Sin embargo, si el haz de infrarrojos incide sobre el cristal en un ángulo
llamado ángulo crítico = sin −1 ( η 2 / η 1 )3, toda la luz se refleja en el cristal
y no se transmite ninguno. Esto crea una onda evanescente que se proyecta en el
muestra y transporta energía ( Figura 1.11 ). A medida que la muestra absorbe energía de
la evanescencia, también extrae energía del haz reflejado internamente y
atenúa la respuesta en el detector en longitudes de onda correspondientes a la absorción
frecuencias de la muestra. Comparación de vigas con y sin muestras
en su lugar produce espectros típicos por diferencia (Sedman y col., 1999; Vidrio para d
et al., 2013 ). Debido a su facilidad de manejo y adaptabilidad a una amplia gama de
muestras, la reflectancia total atenuada se ha convertido en la muestra de infrarrojos más utilizada
método pling para la mayoría de los materiales de hoy. Ciertamente, esto es cierto con los análisis de alimentos.
Diferencia en IR medio y cercano . Los mismos conceptos básicos de espectroscopia
y los componentes del instrumento se aplican tanto al infrarrojo medio como al infrarrojo cercano. Sin embargo, los espectros
del IR medio son nítidos y claros con muchas bandas, mientras que los espectros del IR cercano son
amplio, errante y en gran parte sin rasgos a simple vista (Figura 1.12 ). La
Los espectros definidos de IR medio surgen de fuertes vibraciones fundamentales de todo tipo.
de enlaces, y cada grupo tiene una frecuencia de identificación principal y tal vez algunos
bandas más débiles en otras frecuencias. Por el contrario, los espectros de infrarrojos cercanos surgen solo de
vibraciones de H vinculadas a átomos de C, O o N ( Stuart, 2004). Absorciones en casi
IR resulta de armónicos o combinaciones de las vibraciones fundamentales de estos
3. η 2 = índice de refracción de la muestra; η 1 = índice de refracción del cristal.
Página 69

FIGURA 1.13 Relación de las bandas del infrarrojo medio y cercano en cuanto a nitidez e intensidad. Adaptado y
redibujado de Matejka (2015) .
enlaces detectados en IR medio, y cada uno puede tener hasta tres frecuencias armónicas.
Las frecuencias vibratorias de armónicos en IR cercano son múltiplos aproximados de
vibraciones fundamentales en IR medio, mientras que las de combinaciones son la suma de
fundamentales ( Figura 1.13 ). Los espectros de infrarrojos cercanos son amplios y difusos por dos razones.
hijos: (1) las absorciones de armónicos son más débiles, y (2) cada tipo de enlace tiene
frecuencias de absorción separadas para combinaciones y cada uno de los tres armónicos,
y con muchos tipos de enlaces HR presentes en lípidos o alimentos, una superposición sustancial
resultados de ping.
Hay compensaciones en la información obtenida por las dos espectroscopias, pero
deben considerarse complementarios en lugar de competitivos como analíticos
métodos.
1.5.3.1 Análisis de oxidación de lípidos en IR medio

Aspectos prácticos . Modo de muestra - transmisión. Penetración de radiación de infrarrojos medios
en materiales es muy limitado, por lo que las muestras deben analizarse en películas delgadas de líquido
líquidos en células especiales, en líquidos viscosos o semisólidos esparcidos entre el potasio
placas de bromuro (KBr), o en sólidos molidos con KBr y prensados en obleas
gránulos finos. En este último, el tamaño de las partículas es fundamental, por lo que pulverizar la muestra: KBr
Se requiere una mezcla (1-3 mg de muestra / 250-300 mg de KBr) a una dispersión muy fina
para espectros nítidos ( Stuart, 2004 ). El agua es el peor enemigo de los infrarrojos: domina
la región 3200-3600 cm −1 del espectro, oscureciendo las contribuciones de dOH
grupos de otras moléculas en la muestra, y erosiona las placas de haluro.
Por lo tanto, es costumbre secar las muestras con cuidado, como debajo de una lámpara de infrarrojos,
antes de los análisis de IR.
Modo de muestra: reflectancia atenuada . Se han utilizado cubetas de muestra especiales
desarrollado por la mayoría de los fabricantes de espectrómetros IR para reemplazar el estándar
unidad de muestreo en el compartimento de la muestra. Los diseños varían pero comparten en común
Página 70
elementos de una pequeña abertura sobre el cristal para la deposición de la muestra y

un tornillo de presión para comprimir la muestra firmemente contra el cristal para un máximo
contacto de mamá. El tamaño de las partículas, el empaque y el contacto con el cristal tienen fuertes
impactos en los niveles de detección, la nitidez de los espectros y la reproducibilidad, por lo que
A menudo se recomienda que las muestras se muelen bien justo antes del análisis. Esto
es una buena práctica en general, pero cuando se analizan muestras con oxidantes activos
La molienda de lípidos puede causar más problemas de los que resuelve. Muchas exploraciones (a menudo
50-150) normalmente se ejecutan y se promedia la señal. Sin embargo, con la oxidación de lípidos
análisis, es mejor pulverizar las muestras solo en el último minuto, recopilar escaneos
en lotes pequeños (p. ej., 5 a 10 exploraciones), luego examine la progresión de la oxidación
en lotes a lo largo del tiempo. Cuando las muestras son estables, los lotes de escaneo sucesivos pueden
combinados y promediados. Si las muestras comienzan a degradarse, los espectros se pueden descartar
después del punto de cambio. Cuando los productos alimenticios se desestabilizan al pulverizar y
exponiendo una nueva superficie, se pueden sustituir por muestras diminutas de alimentos intactos;
sin embargo, se necesitarán más muestras para superar la falta de homogeneidad natural
de los materiales.
Se han propuesto tarjetas de teflón desechables como alternativa a las
muestreo al estudiar la oxidación en aceites comestibles ( Russin et al., 2003, 2004 ), y
se han utilizado en algunos DART (análisis directo en tiempo real) -Análisis de MS
también. Estas tarjetas consisten en un politetrafluoretileno microporoso (PTFE,
Película de teflón) intercalada entre dos capas de cartón con aberturas de 1,9 cm,
y todo el conjunto encaja en los soportes de placa IR estándar. Tres gotas de aceite son
colocado en la película y distribuido uniformemente en toda el área, luego analizado en
Modo ATR. Las tarjetas simplifican las mediciones directas sobre aceites, pero también pueden
moverse con la muestra restante en ellos. Por lo tanto, se pueden colocar
en incubadoras y se retira periódicamente para rastrear los cambios en la oxidación evidentes en
Espectros de infrarrojos. Esto hace posible ejecutar estudios de vida útil con cada muestra como
su propio control. Se han tomado las precauciones necesarias para estandarizar el uso de las tarjetas.
revisado ( Russin et al., 2003, 2004).
Ventajas de mid-IR . Los diseños de instrumentación y la informatización son
cada vez más sofisticado, por lo que ahora se pueden obtener espectros de infrarrojos medios
rápida y fácilmente con la debida atención a la manipulación de muestras. Solo muy
se necesitan pequeñas cantidades de material (mg) para el análisis. La fuerza del IR medio
es su capacidad para identificar estructuras moleculares a partir de la característica y bien
bandas de absorción delineadas en este rango espectral que se pueden combinar para
identificar moléculas individuales, analizadas por separado para detectar múltiples componentes
en un sistema mixto (p. ej., lípidos y proteínas en un alimento), o integrados para seguir
reacciones por aparición y desaparición de absorciones de diferentes funciones
grupos nacionales. Quizás lo más importante es que el IR medio proporciona un medio para obtener
medidas de oxidación en muestras de alimentos intactos sin extracción de lípidos, disolventes o
reacciones químicas.
La intensidad de los picos de infrarrojos medios sigue la ley de Beer al ser proporcional a la
centrado del componente, por lo que la producción o pérdida de funciones individuales
grupos o productos, tales como hidroperóxidos, dobles enlaces o carbonilos pueden
Página 71
ser cuantificado mediante la aplicación de un coeficiente de extinción o por referencia a un

curva estándar, ambas determinadas por separado.
Desventajas de mid-IR . La instrumentación contemporánea ha superado
muchas de las limitaciones de los sistemas IR anteriores. Sin embargo, para la transmisión
modo, todavía queda una curva de aprendizaje sustancial para la preparación de muestras
y manejo para obtener resultados consistentes. Los espectros de infrarrojos no se obtienen en un
cámara, por lo que es común ver agua atmosférica y dióxido de carbono en blanco
espectros. Por lo tanto, la mayoría de los instrumentos ahora ejecutan un espectro de "fondo" primero y luego
restarlo automáticamente de cada espectro, y algunos instrumentos también purgan
la muestra con nitrógeno seco para minimizar las interferencias de agua y CO 2 . IR medio
los resultados no son cuantitativamente independientes. Tanto la cuantificación directa, como la de
hidroperóxidos y los análisis quimiométricos cuantitativos dependen de la correlación
de intensidades de pico de IR a análisis primarios determinados en los mismos tipos de
muestras. Crear y validar esta base de datos puede llevar mucho tiempo, pero una vez
desarrollado los valores son ampliamente aplicables a diferentes instrumentos y diferentes
tipos de muestras.
Las matrices no homogéneas, como los alimentos, contrarrestan muchas de las ventajas
tages de mid-IR. Lo más irritante es que las muestras muy pequeñas hacen imposible
obtener ejemplos "representativos". La pequeña limitación de la muestra es más exacta
ervado por el haz de luz que incide sólo en una región limitada del material. Por eso,
Los análisis precisos tanto para la cuantificación como para la identificación de estructuras requieren promedios
espectros de envejecimiento de un gran número de muestras. Las recomendaciones van desde un
mínimo de 10 para búsqueda de rango a más de 100 para cuantificación y estadística
análisis cal. El tiempo requerido para esto presenta un desafío significativo cuando
pruebas de procesos que cambian rápidamente, como la oxidación de lípidos.
Finalmente, para los análisis de oxidación de lípidos, especialmente en matrices de alimentos mixtos,
hay demasiadas superposiciones de absorciones clave (dOH de alcoholes, hidro-
peróxidos, ácidos grasos libres, aminoácidos, azúcares; carbonilos de ácidos grasos y
aldehídos) para una fácil interpretación y una cuantificación absoluta precisa. Creciente
La aplicación de análisis estadísticos quimiométricos puede ayudar a distinguir cambios y
cambia a medida que avanza la oxidación.
Aplicaciones de mid-IR . Clásicamente, las frecuencias medias IR características tienen
ha sido muy útil para identificar múltiples productos de oxidación en la misma muestra,
para seguir la oxidación (y co-oxidación) a lo largo del tiempo, y para verificar la ausencia
de los mismos en productos frescos o ingredientes entrantes. Frecuencias del grupo característico
Las frecuencias para los dobles enlaces y los productos esperados de oxidación de lípidos se enumeran en
Cuadro 1.6. Dado que los grupos de moléculas no lipídicas en muestras mixtas también son
revelado en los espectros, las frecuencias asociadas con la co-oxidación de proteínas son
incluido también.
Quizás la aplicación más común a la oxidación de lípidos ha sido analizada
sis de hidroperóxidos y determinación de PV. Numerosos informes citan PV
determinado por comparaciones directas de IR y análisis estándar. Sin embargo, aplica
Los cationes de la quimiometría también han identificado otros cambios que acompañan
formación de hidroperóxido y puede aumentar la sensibilidad de los análisis de oxidación.
Página 72
TABLA 1.6 Frecuencias características del infrarrojo medio de funciones

Grupos involucrados o afectados por la oxidación de lípidos: enlaces dobles de lípidos
(Perdidos en la oxidación) y productos de oxidación, frecuencias de proteínas
de la cadena de péptidos nativos y los grupos laterales (perdidos en la oxidación) y algunos
Grupos oxidados
Frecuencia Funcional Molecular

(cm −1 ) Grupo Acción Referencia
Lípidos
3610–3640 Hidroperóxidos, OdH Guillén y Cabo (2000)

ROOH extensión y Borchman y Sinha
(2002)
3520 Hidroperóxido OdH Neff y col. (mil novecientos ochenta y dos)

epidióxido extensión
3435 Hidroperóxidos, OdH Guillén y Cabo (2000)

PUFA extensión
3444–3450 Hidroperóxidos, OdH Guillén y Cabo (2000)

aislado extensión
3470 C] O, glicérido CO Guillén y Cabo (2000)

ester armónico
3468 Hidróxidos Estiramiento de OdH Guillén y Cabo (2000)

(alcoholes), ROH
3020–3080 Aislado C] C ( cis ) C] CdH Borchman y Sinha

estirarse (2002)
3006–3012 Conjugado C] C estiramiento Guillén y Cabo (2000)

dienes ( cis )
1746-1765 C] O en glicerilo C] O estiramiento Vlachos y col. (2006)

ester
1728-1743 C] O, saturado C] O estiramiento Guillén y Cabo (2000)

aldehídos y Vlachos y col. (2006)
1720 C] O en ácido libre C] O estiramiento Guillén y Cabo (2000)

y Borchman y Sinha
(2002)
17.00-17.30 C] O, cetonas C] O estiramiento Stuart (2004)

1650-1654 C] C, conjugado C] C estiramiento Guillén y Cabo (2000)
y Hayati y col. (2005)
1630 C] O, α, β- van de Voort y col. (1994)

insaturado
950–815 epóxido (CdO) asimétrico QuímicaBlog (2012)

estiramiento de anillo
Página 73

Grupos oxidados (continuación)

880–750 epóxido simétrico QuímicaBlog (2012)

(CdOdC) estiramiento de anillo
987 trans, trans Curva CdH

dieno conjugado
982–983 cis, trans Curva CdH Guillén y Cabo (2000)

dieno conjugado
967–976 db trans aislado Curva CdH Guillén y Cabo (2000)
914 cis aislado C] C Curva CdH Guillén y Cabo (2000)
Proteinas Columna vertebralC Barth (2007)
3310 amida A NH NdH

extensión
3270 amida-B NdH

NH unido a H extensión
1655 amide yo hélices α
1650 amide yo CO
extensión
1630 amide yo antiparalelo

(1685 semanas) plisado β
sábana
1550 amida II NUEVA HAMPSHIRE

doblar + CN
estirarsea
1490-1460 amida II ′ Estiramiento CN
1400-1200 amida III NUEVA HAMPSHIRE

doblar + CN
estirarseB
Cadenas laterales
2551 SH SdH
extensión
1716-1712 C] O en COOH, CO
asp y glu extensión
Continuado
Página 74

Grupos oxidados (continuación)

1677 C] O en COOH,
asn
+
1695–1652 / Arg CN 3 H 5
1663-1614
1688 Gln C] O
1631 su C] C
+
1626 lys NH 3
1622, 1509, trp C] C, CN / NH,

1496 Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades
Grupos oxidados Reusch (2013)
1325, 1140 S] O sulfona
1345 S] O sulfónico
ácido
1365, 1180 S] O sulfonilo

cloruro
1350-1450 S] O, sulfato
500–540 S] S
3550, 1665, C] NOH

945
960 Amina NdO

óxido
1550/1530 + N] O nitroso /
1350 nitro
a Desfasado, independiente de la estructura de la cadena lateral.

b En fase, varía con las cadenas laterales.
c Aquí solo se incluyen las bandas principales; más detalles están disponibles para cada aminoácido enBarth (2007).
En estudios de varios aceites, los indicadores de oxidación más sensibles fueron

aumentos en las bandas de los dobles enlaces trans (968 y 986 cm −1 ) y una disminución
en intensidad de banda de dobles enlaces cis (710 y 3006 cm −1 ) más un cambio a
menor número de olas ( Le Dreau et al., 2009a, b; Pinto et al., 2010). Pérdida de cis
Página 75
Se propuso el doble enlace como marcador de oxidación de lípidos ( Guillén y Cabo ,

1999, 2000 ). Los hidroperóxidos se identificaron a 3500 cm −1 , junto con pequeñas
cantidades de carbonilos (1744 cm −1 ) ( Holman et al., 1958; Guillén y Cabo ,
2002; Wójcicki et al., 2015).
Algunos ejemplos de otros enfoques incluyen el uso de frecuencias características.
para desarrollar PV, aplicación de frecuencias características - mínimos cuadrados parciales
regresión para cuantificar hidroperóxidos en aceite de nuez virgen (Liang et al., 2013 )
y lipoproteínas de baja densidad (Lam et al., 2005 ), aplicación de característica
frecuencias: redes neuronales artificiales para predecir el peróxido y los AV en el aceite de pescado
( Klaypradit et al., 2011 ), y la reacción de hidroperóxidos lipídicos con trifenilfos-
cuantificación de phine e IR del óxido de trifenilfosfina resultante directamente (Mamá
et al., 1997, 1998) y automatizado en celdas de flujo continuo ( Yu et al., 2007 ).
Valores de hidroxilo determinados en aceites de soja hidroxilados utilizando el mínimo
Se realizaron análisis estadísticos de máquinas vectoriales de soporte de cuadrados de espectros de infrarrojos medios.
demostrado que proporciona una alternativa mucho más simple pero equivalente a AOCS OHV CD
13–60 (Ferrao et al., 2007).
Una segunda área de amplia aplicación de IR ha sido la medición de la fritura.
calidad y degradación del aceite en un intento de reemplazar los laboriosos
Normalmente se requieren análisis cal. Ácidos grasos libres, hidroperóxidos, polares totales y
Los contenidos de trans determinados en aceites calentados por FTIR han mostrado una buena
relaciones con los análisis químicos estándar (Shen y col., 2014; Innawong y col. ,
2004; Tena et al., 2009, 2013; Yavari et al., 2009; Srivastava y Semwal, 2015 ).
También puede ser posible derivar medidas de polímeros a partir de la huella dactilar.
región 1500–400 cm -1 que refleja configuraciones moleculares.
Finalmente, el advenimiento de la quimiometría ahora está reorientando la atención lejos de
valores absolutos de productos individuales a la "minería de datos", identificando más componentes
patrones complejos de cambios espectrales que también pueden involucrar la configuración molecular
modificaciones y explicar los cambios sutiles de calidad asociados con la oxidación de lípidos
ción. También hay esfuerzos importantes para mejorar la normalización y eliminar
variabilidad entre muestras repetidas, por ejemplo, calculando las proporciones de todas las bandas
durante la oxidación para normalizar las diferencias en la preparación y el espesor de la muestra
( Guillén y Cabo, 2000 ). La puerta permanece abierta a muchas aplicaciones nuevas.
de FT mid-IR para dilucidar las modificaciones en los lípidos oxidantes que no han sido
previamente detectable.
1.5.3.2 IR cercano (FT-NIR)

Las aplicaciones de infrarrojos cercanos a la oxidación de lípidos han sido mínimas hasta la fecha. Sin embargo-
menos, la técnica tiene el potencial de convertirse en una poderosa herramienta en la oxidación de lípidos
análisis a medida que se adquiere más experiencia con el manejo de muestras, el calibrador genera
ción, y especialmente con evaluaciones estadísticas quimiométricas.
Aspectos prácticos . Los modos de muestreo que se utilizan con mayor frecuencia en IR cercano son diferentes
fusionar transmitancia y reflectancia difusa, que son paralelas a la difusión y
ATR excepto que la luz se dispersa más debido a la presencia de partículas y
superficies, respectivamente. Esto hace que el infrarrojo cercano sea particularmente atractivo para su uso con
alimentos. Para los análisis de oxidación de lípidos, ambos modos son importantes ya que los aceites requieren
Página 76
transmitancia difusa mientras que los alimentos sólidos y semisólidos utilizan reflectancia difusa.
Los aceites se pueden analizar por reflectancia difusa con el uso de un adaptador reflectante
disponibles en algunos fabricantes, en cuyo caso las aplicaciones se distribuyen
acusatorio. El muestreo de transmitancia, interactancia y transflectancia también se
disponible para aplicaciones especiales.
El manejo de muestras y el análisis de datos informáticos funcionan de la mano para lograr el éxito
en análisis de infrarrojos cercanos. Al menos superficialmente, el infrarrojo cercano hace que el manejo de muestras sea muy
fácil en comparación con el IR medio porque las muestras simplemente se cargan en contenedores y
analizado. Se puede utilizar vidrio normal, como el de las placas de Petri y los viales de concha;
algunos fabricantes tienen sus propios diseños de muestreo con diferentes materiales.
Al mismo tiempo, la falta de homogeneidad de los alimentos introduce una variabilidad significativa
incluso dentro de las muestras, por lo que la "falta de reproducibilidad" ha sido un
queja. El diseño de instrumentos más nuevo ha abordado esto en el modo de reflectancia al
rotar muestras o escanearlas de un lado a otro horizontalmente durante la grabación
espectros repetidos (al menos 10) para asegurar un muestreo representativo del material.
Luego, estos se promedian durante el análisis de datos.
Los análisis estadísticos informáticos pueden detectar pequeñas diferencias entre muestras
ples, por sin rasgos distintivos que puedan parecer sus espectros. De hecho, una computadora poderosa
Los análisis son los que hacen que el infrarrojo cercano sea factible y útil en un nivel práctico. Nevada-
Sin embargo, la sensibilidad de la computadora a diferencias mínimas significa que la variabilidad de
el muestreo debe minimizarse para obtener conjuntos de datos nítidos con una clara distinción o
la variación dentro de la muestra ocultará la característica que se analiza. Porque
La dispersión de la luz se ve fuertemente afectada por la naturaleza de la superficie de la muestra en diferentes
Transmisión de fusibles y especialmente reflectancia, tamaño de partícula, forma y empaque.
La densidad juega un papel fundamental en la intensidad y reproducibilidad de los espectros.
La identificación estructural de moléculas se puede obtener directamente de mid-IR
espectros, incluso mediante inspección visual. Eso no es posible en infrarrojo cercano debido a la
superposición extensa de bandas armónicas. Por lo tanto, el análisis informático sofisticado
Los ses son necesarios para resolver las diferencias en los patrones de absorción y correlacionar
ellos con patrones (calibradores) para identificación y cuantificación. A diferencia de la EM,
donde las características de las moléculas individuales son constantes, por lo que bibliotecas masivas de fragmentos
Los patrones de mentación se pueden compilar para aplicaciones generales, alimentos y aceites.
Las posiciones son demasiado variables, por lo que cada laboratorio debe construir bibliotecas de infrarrojos cercanos para
cada uno de sus materiales utilizando calibradores que se formulan exactamente y se analizan
independientemente para componentes específicos. Básicamente, la computadora debe estar entrenada
para correlacionar los patrones que discierne con cualidades, cantidades y productos químicos específicos
identidades. Los datos de estos calibradores se utilizan luego como base para la comparación en
análisis estadísticos discriminatorios y cuantitativos para responder preguntas tales como:
● ¿Hay algún componente en particular y cuánto?

● ¿Están oxidadas estas muestras y cuánto?
● ¿Este material coincide con otro material (como el mismo o diferente
composición, misma composición pero cambiada?)
● ¿Son estos materiales diferentes y cómo?
Página 77
Para responder a estas y otras preguntas, el software de quimiometría utiliza múltiples

ate estadsticas para correlacionar parmetros de calidad o propiedades fsicas con complejos
datos instrumentales y encontrar patrones de información cualitativa y cuantitativa. Cuali-
Los análisis discriminantes o negativos incluyen análisis de componentes principales, análisis de conglomerados
sis, análisis discriminante lineal, redes neuronales artificiales y Mahalanobis y
Distancia euclidiana. Los análisis cuantitativos incluyen regresión lineal de mínimos cuadrados parciales.
sión, regresión de componentes principales, regresión lineal múltiple, así como
oídos mínimos cuadrados parciales, redes neuronales artificiales y máquinas de vectores de soporte
( Munck et al., 1998; Geladi, 2003; Roggo et al., 2007; Forina et al., 2009 ). Quizás
En la actualidad, el mayor desafío en el infrarrojo cercano es aprender a aplicar estos métodos.
para obtener la máxima información que refleje con precisión la química de oxidación.
Finalmente, la aplicación de quimiometría requiere un "pretratamiento" sustancial de
los datos espectrales de infrarrojos cercanos para convertir los componentes amplios en enfocados definidos
bandas que se pueden comparar con mayor distinción. Por tanto, es costumbre
someter los datos originales al menos para señalar el promedio de las réplicas, las normas de referencia
malización, primera y segunda derivatización para localizar picos y, a menudo, más
manipulación. Son estas manipulaciones las que hacen posible la identificación por computadora
ción de los componentes principales que diferencian las muestras.
Ventajas del infrarrojo cercano : al igual que con el infrarrojo medio, el infrarrojo cercano proporciona
análisis simultáneos de múltiples compuestos en materiales intactos sin diluir,
lo que hace que este método sea muy atractivo y útil para alimentos e ingredientes.
Casi todas las formas de alimentos: sólidos, líquidos, pastas, geles, polvos y frescos intactos
alimentos: se pueden analizar con los modos de muestreo adecuados. El agua es transparente
en la región del espectro infrarrojo cercano, por lo que la deshidratación no es un requisito. Cada cerca
El espectro IR proporciona simultáneamente información sobre la mayoría de las moléculas principales.
componentes lar (por ejemplo, humedad, proteínas, lípidos, carbohidratos) en la muestra,
y estos datos se pueden extraer con calibradores apropiados. Sin embargo, el gran-
La mayor fuerza del infrarrojo cercano combinado con la quimiometría es la asombrosa capacidad
para distinguir pequeñas diferencias entre grupos y para categorizar materiales
als. Esto hace que el infrarrojo cercano sea único en sus capacidades de selección de ingredientes.
( Fernandez-Ibanez et al., 2010 ), monitoreo en línea durante la fabricación y
Procesando (Huang y col., 2008), prueba de identidad y adulteración de aceites ( Yang
et al., 2005) y el seguimiento de la degradación de los alimentos durante el almacenamiento.
Desventajas del IR cercano : Habilidades desarrolladas para interpretar las especificaciones del IR medio.
tra no se puede transferir fácilmente a IR cercano y es difícil superar los viejos
hábitos de buscar bandas nítidas específicas que indiquen claramente las diversas funciones
grupos nacionales. No ve todos los movimientos atómicos (el infrarrojo cercano detecta solo vibraciones
de H unido a átomos de C, O o N), las absorciones son débiles y el complejo
Los patrones de armónicos hacen que sea imposible obtener más que información muy general.
mación de los espectros visualmente. Más bien, el enfoque en infrarrojo cercano está en la computadora
procesamiento de datos. El tiempo para obtener datos de una sola muestra puede ser solo de unos pocos
segundos, pero el tiempo necesario para analizar la gran cantidad de muestras necesarias
minimizar la variabilidad estadística puede llevar horas. Manejo de muestras para siempre
La reproducibilidad requiere una gran atención a los detalles de la muestra, como se señaló en el
Página 78
introducción a esta sección. Extracción de información útil del espectro difuso

los datos son laboriosos y la curva de aprendizaje para utilizar la quimiometría es empinada.
Todos los espectros requieren varios tratamientos previos (p. Ej., Promediado de señales, normalización
ción de líneas de base, conversión de espectros de absorción a segundas derivadas) para poner
los datos en una forma que se pueda utilizar en análisis estadísticos, luego múltiples estadísticas
Los enfoques cal deben probarse para determinar cuál proporciona el mejor modelo de la
datos. Si no se reconocen estos factores, el IR cercano puede rechazarse como una herramienta que
proporciona muy pocos datos aceptables con demasiado trabajo.
La limitación quizás más fuertemente asociada con IR cercano es la necesidad
de calibradores de construcción para cada conjunto de muestras y análisis. Preparación precisa
calibradores que están bien definidos en composición (por formulación) y características
ización (mediante análisis químicos primarios) lleva mucho tiempo, pero son fundamentales
para entrenar a la computadora a interpretar los datos. El viejo adagio sobre las computadoras
“Basura adentro, basura afuera” es ciertamente cierto aquí. Si los calibradores no coinciden
las muestras lo suficientemente cerca, las muestras no se identifican o cuantifican correctamente.
Sin embargo, para muchas aplicaciones, una vez desarrollados y analizados los calibradores
y el método está validado, la información puede ir a una biblioteca para uso repetido.
Aplicaciones de IR cercano . En los análisis de lípidos, el IR cercano se ha utilizado con mayor frecuencia.
para determinar el contenido de lípidos y la composición de ácidos grasos, como en las salchichas de cerdo
( Ortiz-Somovilla et al., 2007) y carne de vacuno ( Sierra et al., 2008 ), respectivamente. Menos
Se han desarrollado aplicaciones de IR cercano a la oxidación de lípidos, probablemente debido a la
requisito de calibracin al menos mediante anlisis qumico de productos de oxidacin mltiple
ucts en las mismas muestras. En uno de los primeros estudios publicados, el hidroperóxido
se identificaron picos a 6849 y 4831 cm -1 (1460 y 2070 nm) (Holman y col. ,
1958 ). Más recientemente, utilizando análisis de conglomerados y mínimos cuadrados parciales, 0,03% libre
Se detectaron ácidos grasos e hidroperóxidos de 0,8 mEq en aceite de oliva y varias verduras.
los aceites comestiblesArmenta et al., 2007 ). Mínimos cuadrados parciales y regresión lineal múltiple
siones identificaron cambios en las regiones de 2068 nm como los más fuertemente asociados con
hidroperóxidos; La intensidad espectral a esta longitud de onda se mostró con una
correlación efectiva con PVs determinada por titulación yodométrica ( Yildiz et al., 2002 ).
Durante la oxidación de los aceites de oliva, girasol y colza, los más importantes
Los cambios en los espectros del IR cercano fueron visualmente incrementos a 7068 cm -1 y 4810 cm -1
(2079 y 1415 nm) asignados a hidroperóxidos Sin embargo, PCA reveló una marcada
pérdida de dobles enlaces (4590 y 4670 cm -1 , 2179 y 2141 nm) y metileno
hidrógenos (5870 cm −1 primer sobretono y 8600 cm −1 segundo sobretono; 1704 y
1163 nm) mientras que los hidroperóxidos estaban aumentando (4804 y 6950 cm -1 , 2082 y
1439 nm) ( Wójcicki et al., 2015 ). La pérdida de dobles enlaces, por lo tanto, podría ser una apuesta uniforme.
ter marcador de oxidación que los hidroperóxidos porque el cambio es continuo en
una dirección y no implica cambios secundarios. Concurrente tan detallado
Los cambios químicos son muy difíciles, si no imposibles, de observar mediante reacciones químicas.
en las que se requieren múltiples análisis simultáneos y los límites de detección son
no es el mismo en cada ensayo. Estos resultados demuestran el poder de la quimiometría
para identificar información clave en espectros de infrarrojos cercanos, así como el valor de mirar
más allá de establecer productos tradicionales para obtener información útil sobre la oxidación de lípidos.
Página 79
1.5.4 Evaluación de estabilidad o resistencia a la oxidación
Existe una controversia sobre si las pruebas de producción temprana o secundaria

ucts proporcionan la predicción más precisa y útil de la estabilidad oxidativa, o
resistencia a la oxidación. Para la investigación básica, siguiendo los primeros productos y sus
La transformación progresiva del período de inducción a la oxidación activa es más
importante porque los detalles de todo el proceso son importantes. El oxidografo
ya discutido en la Sección 1.5.1.1 fue de hecho diseñado para probar la estabilidad en
el mismo comienzo de la oxidación. Por el contrario, para la industria alimentaria, a menudo
más importante saber qué tan rápido los productos secundarios que tienen en cuenta los malos olores
y los sabores detectados por los consumidores se desarrollan en diferentes condiciones. En el
Al mismo tiempo, la industria no puede darse el lujo de esperar meses o un año para
observar la degradación a tasas en condiciones ambientales. Por lo tanto, tres análisis:
Prueba de horno OSI, Rancimat y Schaal (ahora reemplazada en gran parte por ASL) - se han
se aplica ampliamente para evaluar rápidamente las tasas de progresión de la oxidación a la inaceptación
puntos capaces en etapas secundarias. Todos estos ensayos utilizan niveles sustancialmente elevados
temperaturas para acelerar la oxidación de modo que el procesamiento o la formulación, como
como composición de ácidos grasos o contenido de antioxidantes, se puede evaluar rápidamente. La
La temperatura de prueba del horno Schaal es de 63 ° C (correspondiente a 6-10 días a 21 ° C)
( Pomeranz y Meloan, 2000 ), los estudios acelerados de vida útil suelen
conducidos a 40 o 60 ° C, y los análisis Rancimat y OSI generalmente se ejecutan a
100–130 ° C (Wrolstad et al., 2005).
De las pruebas de la máquina, OSI y Rancimat generalmente se justifican como empujando
todo el proceso de oxidación a través de más rápido basado en la cinética de Arrhenius, y para
prueban esto, tradicionalmente están correlacionados con evaluaciones sensoriales, PV o
otras medidas de oxidación de lípidos. Sin embargo, ambos métodos reflejan principalmente rupturas
reducción de los productos iniciales y oxidación de aldehídos a ácidos grasos que son altamente
conductivo. Los factores catalíticos no actúan todos en un solo lugar o en el mismo lugar en los lípidos.
oxidación ( Schaich, 2005). Por lo tanto, como se señaló anteriormente, en lugar de utilizar estos
pruebas por sí solas, podría resultar muy útil combinar estos ensayos de segunda
productos aria con análisis Oxidigraph de la absorción de oxígeno para diferenciar qué
etapa de oxidación - iniciación o progresión - se ve afectada por
procesamiento, tratamiento o formulación.
Las pruebas de ASL también han asumido la cinética de Arrhenius pero, al no estar ligadas a un par-
instrumento particular, proporciona considerablemente más flexibilidad en el análisis de diferentes
etapas de oxidación, individualmente o (más eficazmente) en combinación.
1.5.4.1 Rancimat y OSI

Estos son fundamentalmente el mismo procedimiento, pero los instrumentos son de diferentes
diferentes fabricantes: Rancimat (Metrohm) y OSI (Omnion).
Principio del análisis : históricamente, este ensayo se basa en observaciones
que los productos de oxidación, al ser polares, imparten conductividad a las soluciones ( Pardun
y Kroll, 1972). La grasa o el aceite se calienta a altas temperaturas (≥100 ° C) y se oxida.
dized burbujeando aire a través de la muestra. Productos secundarios volátiles de
Página 80
la oxidación de lípidos son transportados por el aire a un tubo con agua destilada donde
La ductividad se controla constantemente entre dos electrodos de platino, se registra,
y representado frente al tiempo para producir curvas de oxidación. Conductividad lentamente
aumenta a medida que se generan productos oxigenados hasta aumentos marcados repentinos
en conductividad indican el final del período de inducción. El punto de inflexión en
la curva denota el tiempo de estabilidad. Este punto se calcula en el Rancimat
métodos por la intersección de las pendientes antes y después del cambio de velocidad, mientras que
en el método OSI se determina mediante la segunda derivada de la curva continua.
Los resultados se expresan como tiempo de estabilidad, tiempo hasta la oxidación activa o tiempo hasta alcanzar
un aumento especificado en la conductividad en el Rancimat, o como% de extensión sobre
referencia = 100 x [OSI (muestra) - OSI (en blanco) / OSI (en blanco)] para el sistema OSI.
Ventajas : Ambos sistemas son fáciles de configurar con muestras, las ejecuciones son completamente
automatizado y manejar múltiples muestras simultáneamente (8 para Rancimat y 24
para OSI), y los datos se adquieren continuamente para que los puntos finales sean claros (sin interpo-
lación necesaria). Se encuentran disponibles procedimientos estandarizados nacionales e internacionales:
American Oil Chemists 'Society Cd 12b-92, Muestreo y análisis de compuestos
grasas y aceites comerciales: OSI; Organización Internacional de Normalización ISO
6886: 2006, Grasas y aceites animales y vegetales. Determinación del estado de oxidación.
bilidad (prueba de oxidación acelerada); Sociedad Japonesa de Químicos del Aceite 2.4.28.2–93 grasas
ensayo de estabilidad de autooxidación, método de determinación conductimétrica 2.4.28.2–93;
Manual de alimentos suizos (Schweizerisches Lebensmittelbuch, SLB), sección 1.7.5.4 .
Quizás lo más útil es que se hayan establecido correlaciones para facilitar las estimaciones.
ción de la vida útilCuadro 1.7).
Desventajas y precauciones : la química medida es una "caja negra"
basado en productos de oxidación terciaria que requieren una larga progresión en la oxidación
antes de que se generen - formación de LOOH, descomposición a secundaria
productos, oxidación de aldehídos a ácidos de cadena corta (fórmico, acético, propiónico)
que son volátiles y contribuyen más a la conductividad. El ácido fórmico contribuye
la mayoría, acético mucho menos, otros pequeñas cantidades. Estos no son productos típicamente
asociado con la oxidación de lípidos, o incluso medido con ensayos químicos.
TABLA 1.7 Predicciones de vida útil a partir de OSI y

Tiempos de inducción de Rancimat para aceites con PV <2 mEq / kg
OSI / Rancimat
Tiempo de estabilidad (h) Vida útil prevista
0-5 Sin garantía
6-12 6 meses
12-20 1 año
> 20 ≥2 años
De Floratech (2015) ; utilizado con permiso.
Página 81
Cualquier factor que altere la oxidación en la dirección de la oxidación, es decir, a través de

peróxidos versus adición o reordenamiento, también alterarán Rancimat / OSI
resultados que dependen de productos específicos. Los ácidos detectados ocurren aguas abajo
de aldehídos y otros productos que tienen olores y sabores distintivos, por lo que
sobrestima la estabilidad. El método detecta solo compuestos volátiles mientras
los no volátiles que son igualmente importantes para mantener la oxidación no se registran.
Por tanto, la estabilidad determinada por Rancimat / OSI debe combinarse con otros
ensayos, tanto sensoriales como químicos, para su verificación.
Los índices de estabilidad determinados por los métodos OSI y Rancimat son
totalmente dependiente de las condiciones utilizadas (temperatura y flujo de oxígeno),
y estos deben especificarse para cualquier comparación entre corridas o laboratorios.
Las temperaturas normalmente utilizadas están determinadas por las características de los aceites.
siendo probado. Las grasas saturadas requieren temperaturas más altas para mantener el líquido.
y para aumentar la oxidación (120 ° C), los aceites vegetales estándar se degradan más
rápidamente, por lo que se prueban a 100-110 ° C, y los aceites de pescado u otros aceites muy sensibles
se analizan a 68 ° C. No se deben utilizar temperaturas superiores a 120 ° C
porque ponen el aceite en modo de degradación térmica en lugar de oxidación
( Tian, 2013 ), lo que da períodos de inducción demasiado cortos para medir con precisión,
y aumentan enormemente la pérdida de agua en la celda del detector. Demostración de
fuertes relaciones lineales inversas entre los períodos de inducción y la temperatura
en aceites vegetalesHasenhuettl y Wan, 1992 ) y aceites de pescado (Méndez et al. ,
1997) verificó que las reacciones que aportan productos con conductividad siguen
cinética de Arrhenius disminuida en las condiciones de los análisis (disminuyendo
períodos de inducción en un factor de aproximadamente 2 por cada 10 ° C de aumento en el funcionamiento
temperatura), pero al mismo tiempo demostró que pequeñas diferencias en el con-
Las posiciones tienen un gran impacto en los resultados.
Se ha prestado menos atención al papel del oxígeno en Rancimat y OSI
análisis, pero el control de las tasas de flujo de oxígeno también es fundamental ya que el oxígeno impulsa
las reacciones que generan productos. La principal preocupación es mantener suficientes
flujo para evitar el agotamiento de oxígeno sin soplar productos a través del colector
ing agua. Sin embargo, los productos de oxidación cambian bajo diferentes niveles de oxígeno,
y los efectos del oxígeno sobre los tipos y niveles de productos formados se vuelven más
pronunciado a medida que aumentan las temperaturas (Peng, 2010; Tian, 2013 ). Al mismo
Con el tiempo, las muestras en la vida real casi nunca están expuestas a oxígeno total. Por lo tanto, el oxígeno
El flujo debe equilibrarse con la temperatura para determinar las condiciones óptimas.
para cada aceite de prueba.
Aplicaciones : Rancimat y OSI son aplicables solo a aceites, aunque se aplican
los alimentos de baja densidad con superficies abiertas (p. ej., patatas fritas) también
( Barrera-Arellano y Esteves, 1992). Estos dos métodos tienen
Se ha utilizado ampliamente para evaluar la eficiencia de la refinación de petróleo, comparar la estabilidad de
diferentes aceites, probar los efectos de las modificaciones genéticas sobre la estabilidad oxidativa de los aceites,
comparar y proyectar los efectos a largo plazo de los antioxidantes y más.
Los protocolos detallados para los análisis de Rancimat / OSI están disponibles en ( Wrolsta d
et al., 2005).
Página 82
1.5.4.2 Prueba del horno Schaal (prueba de almacenamiento en el horno,

Método AOCS Cg 5-97)
Principio del análisis : Se coloca una muestra en un horno con flujo de aire forzado a
temperatura elevada entre ambiente y 80 ° C; cerca de 60 ° C es el más
temperatura del lunes. La prueba inicial de Schaal determinó el punto final a partir del peso
ganancia durante la oxidación y por la aparición de olores rancios, que requirieron
evaluadores capacitados ( Rossell, 1994). Aunque este ensayo ha sido en gran parte abandonado
donado en su forma original, los conceptos básicos todavía proporcionan la base
para pruebas de ASL.
Ventajas : desarrollado originalmente para probar galletas, el ensayo es muy simple,
no requiere equipo especial y se puede utilizar en aceites o muestras de alimentos con
varias matrices.
Desventajas y precauciones : aunque suene simple, el Schaal
La prueba del horno es muy variable, tediosa y no práctica para los análisis de rutina.
Las condiciones de reacción son difíciles de controlar a través de todas las manipulaciones repetidas,
oxidaciones son muy sensibles a las trazas de contaminación en la cristalería, pueden
no ser automatizado, y por lo general es solo semicuantitativo en el mejor de los casos. Incubaciones
requieren mucho tiempo y no permiten la incubación de varias muestras abiertas en
misma cámara si se van a realizar pruebas sensoriales.
Aplicaciones apropiadas : Este antiguo ensayo ha sido reemplazado en gran medida por Oxi-
pres y análisis ASL para una mayor precisión. La prueba del horno debe reservarse
para situaciones en las que no hay otras opciones disponibles y solo estimaciones generales
de estabilidad oxidativa.
1.5.4.3 Pruebas de ASL
Los estudios de ASL en estos días proporcionan la estructura básica de lo que la investigación y la calidad
Los laboratorios de control lo hacen todo el tiempo - siguen la oxidación de lípidos - solo
Las incubaciones se llevan a cabo con mucha más sofisticación y control que las
primeras pruebas del horno Schaal. Por lo general, las muestras se pesan en contenedores combinados.
e incubados cerrados o abiertos en incubadoras con temperatura controlada con precisión
vibraciones, temblores y, a menudo, atmósferas específicas. Luz con longitudes de onda exactas
se pueden suministrar, o las muestras se pueden guardar en la oscuridad. Se retiran muestras
periódicamente para su análisis, no por pesaje y degustación, sino por una amplia gama de
Análisis químicos e instrumentales para determinar la progresión de la oxidación. La
Se puede utilizar el mismo enfoque básico para estudiar las reacciones de oxidación fundamentales,
comparar la estabilidad de diferentes aceites o alimentos, comparar el procesamiento y la formulación
de alimentos, probar catalizadores y antioxidantes, guiar modificaciones genéticas, determinar
"Vender antes de" fechas, o responder cualquier número de otras preguntas de investigación, prácticas o
fundamental.
Los estudios de ASL tienen un propósito importante, pero no sin perjuicios. Como el
Prueba de horno de Schaal, ASL se basa en la suposición de que los mecanismos de oxidación,
catalizadores y efectos antioxidantes a temperaturas moderadamente elevadas,
Ally 40 y / o 60 ° C, son los mismos que a temperatura ambiente, solo más rápido, y por lo tanto
Página 83
las proyecciones de oxidación que se producirán se pueden obtener en tiempos mucho más cortos.
Esta suposición tiene algunas deficiencias porque, en realidad, la oxidación de lípidos es
una serie de reacciones, no solo una, y cada paso activo en la formación, transformación
ing, o descomponer los productos de oxidación de lípidos tiene una energía de activación diferente.
De manera similar, todos los catalizadores que se encuentran en grasas, aceites o alimentos almacenados: calor, lipoxigenasa,
metales, irradiación, alto contenido de oxígeno, etc.- promueven vías específicas que difieren
de autoxidaciones fundamentales, y cada una de ellas también tiene su propia activación
energía, así como productos específicos mejorados. Esto significa que la presencia y
El equilibrio entre las diferentes vías y los catalizadores debe cambiar con el aumento
temperatura a medida que algunas vías se facilitan y otras se saturan, por lo que
no se deben esperar los mismos productos de oxidación de lípidos a todas las temperaturas.
Los resultados de las pruebas de ASL pueden revelar cómo cambia la oxidación en las tasas y la producción.
distribuciones de uct bajo las condiciones catalizadas (cómo los aceites o alimentos manejan la prueba
enfatiza) pero debe aplicarse con gran precaución, y tal vez incluso con escepticismo,
para predecir la oxidación en condiciones más suaves.
Por supuesto, el corolario de diversas reacciones es que la imagen de la oxidación
generado es dirigido por el producto (s) analizados, por la frecuencia de análisis
ses, y si los resultados se interpretan de manera amplia o restringida. El juicio
sobre la vida útil es diferente si solo se miden los hidroperóxidos y alcanzan su punto máximo
a los 10 días, luego se degrada en comparación con si solo se mide el hexanal y aún es exacto
mulando después de 20 días. De manera similar, si solo se mide el hexanal pero a niveles elevados
temperaturas, se generan más productos C9 (por ejemplo, nonenal y decadienal),
Los niveles de oxidación están tremendamente subestimados y la vida útil puede ser subestimada.
sustancialmente sobreestimado porque las vías de oxidación se han desplazado y no se han
detectado. Todos estos son ejemplos que hemos observado en nuestro laboratorio (Bogusz ,
2015; Xie, 2015 ). Para captar todo lo que está sucediendo, debe emitir su análisis
redes ampliamente y miden tantos productos como puedan manipularse con precisión. Más-
sobre, siempre que sea posible, los análisis deben incluir la diferenciación de
productos, no solo clases totales. Tanto en productos volátiles como no volátiles,
han observado cambios notables en las distribuciones de aldehídos y alcanos incluso
cuando las variaciones en los niveles totales de aldehído son pequeñas. Las distribuciones de productos
revelan cambios en las vías que hubiéramos pasado por alto si solo los carbonilos totales
fueron cuantificados. Finalmente, aunque ASL está diseñado para modelar el almacenamiento a largo plazo,
Las muestras deben analizarse con la mayor frecuencia posible, no solo una vez a la semana o
mes, para observar patrones detallados de cambio.
Á
1.6 ANÁLISIS SENSORIALES
DE ENSAYOS QUÍMICOSPARA ESTABLECER CORRELACIONES
Y FÍSICOS
Los análisis sensoriales de la oxidación de lípidos son componentes críticos de cualquier evaluación
protocolo, particularmente cuando se trata de alimentos reales, porque proporcionan
conexión a tierra a los ensayos químicos y responder a la pregunta: "¿Qué hacen estos
¿Qué significan las medidas químicas en términos de la calidad percibida del producto? El general
correlaciones de PV que definen fresco (<1), cuestionable (5) e inaceptable
Página 84
(10) se determinaron mediante la integración de evaluaciones sensoriales con peróxido

Ensayos. Del mismo modo, los umbrales de sabor y las características de olor de aldehídos específicos.
y otros productos de oxidación fueron determinados por paneles sensoriales (cf. Frankel ,
2005by referencias en el mismo).
Claramente, los análisis sensoriales de la oxidación de lípidos son invaluables pero probablemente deberían
Bly ser reservado para responder preguntas específicas por varias razones. Regulador
Los obstáculos para los análisis sensoriales de aceites o alimentos con oxidación en estos días son empinados
debido al requisito de demostrar seguridad y falta de toxicidad antes
permitiendo el consumo. Los paneles sensoriales son costosos y deben ser cuidadosamente
seleccionados y capacitados para análisis de oxidación de lípidos. Además, la gran cantidad de
Las muestras de alimentos requeridas pueden estar fácilmente disponibles en la industria, pero a menudo están más allá
el alcance económico de la investigación básica.
Una consideración completa de los análisis sensoriales de la oxidación de lípidos está más allá del
alcance del capítulo. Los lectores interesados pueden consultar los capítulos 3 a 5 deWarner
y Eskin (1995) yCiville y Dus (1992) para obtener información detallada.
1.7 ANÁLISIS DE COOXIDACIÓN DE PROTEÍNAS
Como se señaló en la Introducción, este capítulo aboga por un nuevo paradigma en la oxidación de lípidos.
análisis de dación. Las secciones anteriores de este capítulo describieron análisis de múltiples
productos que deben ser monitoreados para rastrear la oxidación de lípidos con precisión. El segundo
parte de este nuevo paradigma agrega análisis de la co-oxidación de proteínas para seguir el
huellas de oxidación de lípidos y determinar el grado más amplio de oxidación
degradación en los alimentos. Los protocolos detallados están más allá del alcance de este libro y
están disponibles en demasiados textos de biología molecular y bioquímica para enumerarlos aquí.
Más bien, el análisis de proteínas co-oxidadas requiere un pensamiento diferente al que se hace cuando
analizar proteínas nativas, incluso cuando se utilizan los mismos ensayos. Este capítulo
centrarse en enfoques que puedan proporcionar información sobre la naturaleza y el alcance
de la co-oxidación de proteínas a partir de lípidos, y cómo los ensayos y la interpretación de los resultados
debe modificarse para proteínas dañadas.
La cooxidación de proteínas se ha ignorado en gran medida como un problema práctico.
en los alimentos hasta hace poco, a pesar de la evidencia de la investigación de que ocurre (Schaich, 2008
y referencias en el mismo). La oxidación de proteínas está entrelazada con la oxidación de lípidos
íntima y mecánicamente porque los lípidos y las proteínas a menudo están estrechamente
asociados en las estructuras alimentarias y en las membranas, y porque literalmente cada
intermedio y producto de la oxidación lipídica reacciona con las proteínas. Detalles de
Los mecanismos implicados en la co-oxidación de proteínas se pueden encontrar en Schaich (2008).
y referencias en el mismo. Estas interacciones tienen efectos antioxidantes sobre los lípidos.
reacciones en cadena de radicales mientras redirigen y transmiten oxidación a proteínas
y otras biomoléculas, y también median la degradación de la textura, el sabor,
color y nutrición de formas que pueden no estar obviamente conectadas con la oxidación de lípidos.
dación. Por ejemplo, la mantequilla de maní se endurece sin deshidratarse a medida que se oxida.
en paquetes laminados sellados, los chips de tortilla se vuelven duros y quebradizos, y la harina
pierde la capacidad de hacer pan con el tiempo sin el desarrollo del rancio típico
Página 85
olores y saboresSchaich, 2014 ). Todos estos cambios son el resultado de la combinación de proteínas
oxidación. Sabores calentados en carnes, que nunca han sido exitosos.
atribuidos a productos específicos de oxidación de lípidos, probablemente también sean de proteínas
co-oxidación. Por lo tanto, cuando las medidas de oxidación de lípidos son bajas pero la pérdida de calidad es
evidente en alimentos complejos, la co-oxidación de proteínas es siempre una explicación probable.
La tarea de analizar la co-oxidación de proteínas no es tan sencilla como analizar
lizar proteínas nativas en materiales naturales, ya sean vegetales o animales. Primero, co-
Las proteínas oxidadas están, por definición, modificadas, por lo que no se debe esperar que
comportarse "normalmente" en cualquier análisis, como se mostrará en las discusiones de los métodos
debajo. Además, un problema particular que hace que la interpretación de los cambios en las proteínas
en los alimentos más desafiante que en los tejidos biológicos es que el procesamiento de
se impone o se produce en paralelo al daño por oxidación, y los dos procesos
puede ser independiente o interactivo. No existen métodos infalibles para separar
fuerzas de ing, pero, como mínimo, los niveles básicos de las propiedades químicas de las proteínas deben
establecerse para cada producto alimenticio antes de su procesamiento. Comparaciones de estos
con valores determinados inmediatamente después del procesamiento dan una estimación de
daño inducido por el procesamiento, mientras que los cambios en las propiedades durante o después del almacenamiento
reflejan el daño por oxidación.
Esta sección describe una serie de análisis que se utilizan para caracterizar
Proteínas oxidadas. Algunos son generales y se pueden utilizar fácilmente en calidad industrial.
control. Otros proporcionan más detalles moleculares o son productos especializados. Estas
son probablemente más aplicables a la investigación sobre la oxidación de proteínas, pero también pueden proporcionar
información de la industria sobre química específica para contrarrestar en el desarrollo de
enfoques de bilización. Los ensayos que se utilicen en una aplicación determinada dependerán
sobre las proteínas involucradas, la información más necesaria y la instrumentación
y mano de obra disponible.
El análisis de la oxidación de proteínas en los alimentos sigue siendo relativamente limitado debido a la falta
de conciencia de su importancia y desconocimiento de los métodos de detección. Canalla-
Actualmente, los análisis de la oxidación de proteínas son en su mayoría comparativos, diseñados para identificar
tificar qué condiciones causan la oxidación de proteínas en los alimentos, pero al menos esto es un comienzo.
Se necesita una aplicación más generalizada de los métodos descritos a continuación para corregir
relacionar los niveles de productos de oxidación de proteínas específicos con otros productos químicos degradantes
y cambios en las propiedades de los alimentos para determinar "aceptable" y "rechazado"
niveles para diferentes alimentos.
1.7.1 Extracción de proteínas co-oxidadas

Cada proteína tiene una organización estructural diferente y características de solubilidad.
que imparten requisitos de extracción únicos. No es posible que este capítulo
cubren los procedimientos para todas las proteínas, pero aquí se ofrecen algunas pautas generales,
con especial referencia a las modificaciones necesarias para las proteínas oxidadas. Uno
La regla cardinal a tener en cuenta es que la incapacidad de extraer proteínas por métodos normales
ods simplemente refleja las modificaciones de proteínas que son el objetivo de la investigación
ción. Las proteínas que no se extraen no se pueden analizar. Por lo tanto, prepárate para
Página 86
"Piense en la química" y sea creativo en el diseño de procedimientos de extracción alternativos que

adaptarse a los cambios de proteínas. Algunas modificaciones típicas incluyen las siguientes:
● Debido a que las proteínas agregadas o reticuladas reaccionan mal con la mayoría de las proteínas
reactivos, un solvente desnaturalizante como SDS o dimetilsulfóxido a menudo se
necesario para extraer proteínas co-oxidadas.
● Para proteínas muy polares o cargadas donde los residuos superficiales son modificados por
lípidos, puede ser necesario un cambio en el tampón, el pH o la concentración de la sal para mejorar
solubilización.
● Para proteínas con contenido razonable de aminoácidos azufrados, extracción tanto con
y sin un agente reductor como 2-mercaptoetanol para romper el disulfuro
Se requieren bonos. Esto proporciona una imagen más precisa del contenido de proteínas,
y un aumento en la solubilidad con el agente reductor también revela la participación de
enlaces cruzados de disulfuro.
● En alimentos con mayor contenido de grasa, a veces se puede mejorar la producción de proteínas.
por extracción de lípidos antes de la solubilización de proteínas.
● En alimentos procesados donde las proteínas se asocian estrechamente con gelatinizadas
almidones en la matriz del alimento (por ejemplo, productos horneados o bocadillos extruidos o mascotas
alimentos), la predigestión con mezclas de amilasas puede ser necesaria para
recuperación de proteínas ( Strange y Schaich, 2000; Wang, 2000).
1.7.2 Pérdida de solubilidad de proteínas con y sin

Reducción de disulfuro
Uno de los primeros indicadores de la modificación de proteínas es la pérdida de solubilidad o capacidad.
capacidad de extraer proteínas en determinados disolventes. Desafortunadamente, todos los ensayos químicos para
El contenido de proteína en la solución depende de las reacciones de algún reactivo con el aminoácido.
residuos accesibles en la superficie de la proteína. Dado que todas las proteínas tienen diferentes aminoácidos
composiciones ácidas, todas reaccionan de manera diferente en los ensayos, lo que hace
curvas estándar necesarias. Este problema se agrava para los pro-
teins porque los aminoácidos que reaccionan en los ensayos son los mismos
fied por oxidación. Por lo tanto, es común que las proteínas oxidadas muestren aparentes
Disminución de la solubilidad mientras permanecen en suspensión. Estimaciones inexactas de
La proteína en solución es particularmente perjudicial cuando se normalizan otros ensayos.
al contenido de proteína "medido" porque causa una sobreestimación de la
aminoácidos y sobrecarga de geles de electroforesis.
Dado que no existe un ensayo perfecto para la solubilidad de las proteínas, el mejor enfoque es
mantener varios ensayos disponibles en el laboratorio y seleccionar el que mejor se adapte
la composición de aminoácidos de las proteínas implicadas, las condiciones de extracción
ción, y la sensibilidad necesaria. De hecho, a menudo es útil combinar más
de un ensayo con diferente especificidad de residuo para generar vistas alternativas
de solubilidad y obtener información sobre los aminoácidos implicados en la modificación
ciones. La información de las siguientes secciones proporcionará algunas pautas
para mezclar y combinar ensayos de concentración de proteínas al analizar proteínas
oxidación. Hemos incluido una discusión de solo los ensayos principales para los que
Página 87
tener experiencia en aplicaciones a proteínas oxidadas. Como se verá, todos tienen

limitaciones cuando la oxidación modifica los sitios de unión de aminoácidos. Hemos evitado
utilizando ensayos basados en fluorescencia como fluorescamina y o -ftalaldehído
porque reaccionan con lisina y glutamina, principales objetivos de oxidación, y
porque los rendimientos de fluorescencia son muy sensibles al medio ambiente y otros factores.
Otros métodos como el oro coloidal ( Harrison et al., 2008) y polihidroxi
complejos metálicos de tinte de bencenosulfoneftaleína ( Antharavally et al., 2009) están
se está investigando, pero todavía hay poca información sobre sus especificidades vinculantes.
disponible. La falta de inclusión de otros métodos no implica que no sean
eficaz o útil, pero aún no probado y validado con proteínas oxidadas.
Los detalles de los protocolos de ensayo están disponibles en numerosos textos y en línea; ver,
por ejemplo, ( Noble y Bailey, 2009; Walker, 2009; ThermoScientific, 2010 ;
Noble, 2014 ) y la serie Methods in Molecular Biology. El noble y
Capítulo de Bailey (2009) y Guía de selección de ensayos de proteínas Pierce (Pierce, 2014 ), en
en particular, son muy recomendables por sus excelentes evaluaciones y comparaciones
hijos de los diversos ensayos de proteínas, incluidos los detalles de compatibilidad e interferencia
sustancias.
1.7.2.1 Ensayo de Lowry
Principios del análisis . Las proteínas reaccionan primero con el sulfato cúprico alcalino en el
presencia de tartrato de sodio y potasio para formar un complejo cuproso tetradentado
(cuatro enlaces peptídicos: un átomo de cobre). El Cu + en el complejo luego reduce
ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico (reactivo de fenol de Folin-Ciocalteu) para
generar un color azul intenso (Reacción (29) ). Aunque el pico de absorbancia
es bastante amplia, la reacción generalmente se monitorea a 750 nm donde pocos otros
las sustancias interfierenLowry y col., 1951; Noble y Bailey, 2009).
NH 2 H2N
O O
NUEVA HAMPSHIRE NUEVA HAMPSHIRE
O O Folin reducido
NH 2 Reactivo de folin
Proteína + Cu 2+ Cu 2+ H 2 N reactivo azul
NH 2 H2N 750 nm (29)
O O
3H 2 O • P 2 O 5
NUEVA HAMPSHIRE NUEVA HAMPSHIRE • 13WO 3 • 5MO 3• 10H 2 O
O O 3H 2 O • P 2 O 5• 13WO 3 • 5MO 3• 10H 2 O
NH 2 H2N
Ventajas : La reacción del reactivo de Folin con proteínas intactas es relativamente confusa.
Estante de proteína en proteína (Dorsey et al., 1977 ) y no reacciona con
aminoácidos excepto tirosina y triptófano. El ensayo tolera hasta un 1% de SDS
en la muestra, una consideración importante considerando el uso extensivo de SDS
en la extracción de proteínas.
Desventajas y precauciones : el ensayo de Lowry tiene la sensibilidad más baja de
todos los discutidos aquí (5–100 μg) (Noble y Bailey, 2009 ). La reacción es rela-
tivamente lento, y la respuesta del ensayo depende del tamaño de la proteína y la composición de aminoácidos
posición. La formación de color aumenta con el tamaño del péptido y con el contenido de tirosina,
Página 88
triptófano, cisteína, histidina y asparagina que contribuyen a la mayor parte de la reduc-

equivalentes de ing. Dado que estos residuos son fácilmente atacados por radicales lipídicos oxidantes
y productos, este ensayo a menudo muestra una reacción muy baja con proteínas oxidadas.
El alto contenido de prolina en la proteína (p. Ej., Gelatina) también interfiere con la proteína-cobre
formación compleja y desarrollo del color. El manejo es muy incómodo ya que Folin
El reactivo debe agregarse a cada tubo después de exactamente 10 minutos de reacción entre
proteína y cobre mientras se mezclan simultáneamente cada tubo para evitar la precipitación
del reactivo de Folin. Esto limita el número de muestras que se pueden analizar en el
Mismo tiempo. El ensayo está sujeto a muchas detracciones e interferencias que incluyen
sustancias reductoras y tioles libres, agentes quelantes, ácidos fuertes o bases fuertes,
y detergentes e iones de potasio en la muestra (Waterborg, 2009).
Aplicaciones apropiadas : este ensayo tradicional ha sido reemplazado en gran medida
con otros ensayos que son más sensibles y menos sujetos a interferencias.
1.7.2.2 Ensayo de ácido bicinconínico (BCA)

Principios del análisis . Las proteínas forman complejos azules con iones cúpricos en
solución alcalina que contiene tartrato de sodio y potasio, reduciendo el cobre en
el proceso (Smith y col., 1985 ). Los sitios de unión son enlaces peptídicos más cisteína
o residuos de cistina, tirosina o triptófano, de cuatro a seis por molécula de cobre
( Weichelman et al., 1988). Con la adición de BCA, que tiene un metal más fuerte.
constantes de unión, los iones cuprosos se liberan y se transfieren al BCA para
forman quelatos de color púrpura intenso (2 BCA: 1 Cu 1+ ) que absorben a 562 nm
( Smith et al., 1985 ) ( Reacción (30a, b)):
Proteína + Cu 2+ → Cu 1+ - Proteína (azul) (30a)
Na + O - Na + O - O - Na +
O O O
norte norte norte
Cu 1+
Cu 1+
norte norte norte (30b)
O O O
Na + O - Na + O - O - Na +
BCA, sal de Na Complejo BCA-Cobre, violeta
Los protocolos para la reacción utilizan 37 o 60 ° C como temperatura de reacción.

Las temperaturas más altas aumentan la respuesta de reacción debido a la desnaturalización parcial de proteínas.
ación con exposición de residuos aromáticos reactivos y reacción más completa
de los aminoácidos con el cobre ( Weichelman et al., 1988 ). Sin embargo, mayor
Las temperaturas de reacción solo se pueden usar con proteínas que no se agregan a
60 ° C. Dado que el comportamiento de las proteínas dañadas a menudo difiere del de sus
contrapartes, ambas temperaturas deben probarse cuando se utiliza el ensayo BCA con
Página 89
proteínas oxidadas o modificadas de otro modo. Del mismo modo, la reacción es normalmente
Se deja continuar durante 30 minutos, pero las proteínas dañadas pueden necesitar una incubación más prolongada.
tiempos de reacción para una reacción completa. Se determinan e informan las concentraciones de proteínas
con referencia a una curva estándar preparada a partir de diluciones seriadas de un
proteína como la albúmina de suero bovino (BSA) o una proteína que se asemeja mucho
el contenido de aminoácidos (tipo y número) de la proteína a analizar (Noble
y Bailey, 2009).
Debido a que las proteínas oxidadas y procesadas a menudo pierden solubilidad, una fase sólida
La versión del ensayo BCA se desarrolló para el ensayo directo de proteínas en
materiales alimenticios como cereales (Chan y Wasserman, 1993a ). Aquí la comida
El material se suspende en el reactivo BCA, se incuba con sonicación y el
El BCA reaccionado liberado en solución se analiza a 562 nm después de la centrifugación para
eliminar los sólidos. Hemos descubierto que esta modificación funciona muy bien siempre que
las cisteínas componentes no están dañadas.
Ventajas : este es el ensayo de proteínas más sensible. El BCA estándar
el ensayo detecta concentraciones de proteína de 20 a 2000 μg / mL; el micro-BCA
El ensayo que usa muestras diluidas es aún más sensible y tiene un
rango dinámico de 0,1 a 25 μg / ml. Los métodos de cubeta estándar se adaptan fácilmente
a microplacas de dispensación manual o automática ( Redinbaugh y Turley, 1986 ), y
es compatible con hasta un 5% de detergentes, por lo que se puede utilizar con la mayoría de los extractos de SDS.
Solo los tripéptidos y polipéptidos o proteínas más grandes reducen suficiente cobre para
la reacción BCA, por lo que las aminas simples y los dipéptidos, como las de hidrolizaciones
durante el procesamiento, no interfiera.
Desventajas y precauciones : a pesar de su sensibilidad y amplio uso, dos
factores limitan la utilidad del ensayo BCA con proteínas oxidadas. Primero,
La formación del complejo BCA-cobre es sensible a la presencia de sub-
sustancias, agentes quelantes y ácidos fuertes o bases fuertes en la muestra, particu-
principalmente en el ensayo micro-BCA, por lo que no se puede utilizar cuando las extracciones de proteínas son
realizado con 2-mercaptoetanol o ditiotreitol a menos que estos se eliminen
por diálisis o las proteínas se separan por precipitación en acetona helada (puertas ,
1991 ) o desoxicolato y ácido tricloroacético ( Brown et al., 1989), seguido
por lavado. Dos interferencias son potencialmente críticas para las oxidaciones lipídicas
de proteínas. Los lípidos asociados con las proteínas también reaccionan con el cobre y conducen a
sobreestimación del contenido de proteínas ( Kessler y Fanestil, 1986); esta interferencia
se puede eliminar con un 2% de SDS (Morton y Evans, 1992), que es un
componente de disolventes para la extracción de proteínas de los alimentos.
Aún más importante, los cuatro aminoácidos que se unen y reducen la
per en el ensayo de BCA - cisteína, cistina, triptófano y tirosina - son los principales
objetivos de daño durante el procesamiento y para la reacción con lípidos oxidantes, par-
particularmente radicales tempranos. En consecuencia, las proteínas que se cuantifican con precisión en
su forma nativa se subestima significativamente cuando se oxidan. Esto
conduce a una sobreestimación significativa de otros cambios químicos cuyo cálculo
ciones se basan en el contenido de proteínas, y causa problemas particulares en la aplicación
cantidades precisas consistentes de proteína a geles de electroforesis.
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Al mismo tiempo, se ha demostrado recientemente que BCA reacciona con hidroxilcetonas.

así como enlaces peptídicos (Weiser et al., 2012). Pueden producirse estructuras similares
en proteínas oxidadas, lo que conduce a concentraciones aparentes de proteína aberrantemente altas.
Por lo tanto, el ensayo BCA presenta algunas limitaciones muy serias para cuantificar la concentración.
centraciones de proteínas oxidadas en solución. Como mínimo, se justifica la precaución
al interpretar los datos de este ensayo aplicado a proteínas oxidadas.
Finalmente, en términos de manejo, la reacción BCA no tiene un verdadero final.
punto; al igual que el método Lowry, el color final continúa desarrollándose con el tiempo.
Por lo tanto, el tiempo de reacción debe controlarse con precisión. Cuando mas de uno
la muestra se analiza simultáneamente, los tiempos de inicio de las muestras deben estar escalonados
para obtener resultados precisos.
Aplicaciones apropiadas : el ensayo es aplicable a todas las proteínas nativas.
Sin embargo, cuando las proteínas que se analizan tienen altos contenidos de cisteína que pueden
oxidarse (p. ej., a sulfóxidos), un ensayo con diferentes enlaces de aminoácidos
Se deben utilizar sitios o se debe verificar la pérdida aparente de solubilidad de las proteínas mediante
un método independiente de los aminoácidos, como Kjeldahl o análisis elemental.
1.7.2.3 Ensayo de Bradford

Principios del análisis . El ensayo de Bradford elimina el intermedio de cobre
y las interferencias asociadas con él en los ensayos de Lowry y BCA al unirse
Colorante Coomassie Brilliant Blue (CBB) directamente a la proteína (Bradford, 1976 ).
NUEVA HAMPSHIRE
+ Proteína
O - + Proteína O-
CBB-2H + Proteína + O O (31)
S S
O O
norte norte
Free Coomassie Blue existe en tres formas iónicas principales con diferentes colores
dependiendo del pH. Para Coomassie Blue G-250, las formas tienen un pH <0.3 - el doble
catión, rojo (465–470 nm); pH 1,3 - neutro, verde (650 nm); y pH> 1,3 -
anión, azul (590 nm) (Chial y col., 1993). Se cree que la forma azul es la
forma activa, uniéndose a las proteínas inicialmente a través de complejos de carga entre sus
grupos de ácido fónico y cadenas laterales de aminoácidos cargados positivamente (arginina, his-
tidine, lisina) en la proteína ( Tal et al, 1985;.. de Moreno et al, 1986 ) ( Reactio n
(31)). Los complejos de carga alteran la estructura de la proteína y provocan una
tial desenrollado, exponiendo bolsas hidrofóbicas. CBB luego se une en estos pock-
ets por interacciones de van der Waals, estabilizando aún más los complejos (Katrahall i
et al., 2010 ). Cuando se une a la proteína, Coomassie G-250 no está protonado y
Página 91

azul, con absorbancia a 620 nm. Sin embargo, en esta longitud de onda hay demasiada
superposición de la absorbancia de la forma verde, por lo que el ensayo normalmente se ejecuta a
595 nm ( Bradford, 1976; Noble y Bailey, 2009; Noble, 2014). Desde esto
la longitud de onda está tan cerca de la forma azul sin reaccionar, es fundamental ejecutar la reacción
a un pH cercano a 1.3 para proporcionar suficiente forma azul para la reacción mientras se minimiza
fondo de tinte no unidoChial et al., 1993 ).
En este punto, conviene dar más explicaciones sobre los tintes Coomassie Blue.
Desarrollado originalmente en Ghana como tintes de lana, las dos formas principales utilizadas en proteínas
química son el R-250 original y el G-250 coloidal. 250 denota la pureza de
el tinte. Estructuralmente, las dos formas difieren solo en la ausencia (R) o presencia (G)
de dos aductos de metilo en los anillos de benceno, como lo indican las posiciones de las flechas en
Reacción (31), y su color en solución ácida (rojizo vs verdoso, respectivamente)
( Merril, 1990 ). La literatura científica está repleta de informes contradictorios de
relativa sensibilidad y preferencia de cada forma, algunas de las cuales pueden surgir de
diferencias en la pureza y concentración del tinte en un determinado comercial
producto. Para los propósitos de esta discusión, es suficiente decir que el G-250 es el
forma preferida actual para el ensayo de Bradford porque sus estados de ionización son
más ventajoso para las interacciones de carga con proteínas, los dos metil añadidos
Los grupos fortalecen las interacciones de van der Waals y es más fácil de manejar.
La cuantificación de proteínas proviene de las relaciones de la ley de Beer entre
concentración de teína y la absorbancia de los complejos de proteína-colorante en solución.
Por tanto, las concentraciones de proteínas se determinan mediante la comparación de
absorbancias con curvas estándar preparadas a partir de una proteína purificada lo mismo que
ser analizados cuando sea posible, o tener una composición de aminoácidos comparable.
BSA purificada o inmunoglobulina G son los estándares convencionales utilizados cuando
Se desconocen las composiciones de proteínas o no se dispone de proteínas puras. Usu-
Los valores de absorbancia aliados a 595 nm se utilizan para generar la curva estándar, pero
La sensibilidad y la precisión a bajas concentraciones se pueden aumentar aproximadamente.
10 veces trazando la relación de lecturas de absorbancia a 595 y 450 nm ( Zor
y Selinger, 1996 ).
Ventajas : el método Bradford es muy sensible, con menor detección
límite de 0 a 50 μg en métodos estándar (Noble y Bailey, 2009 ) y nano-
gramos detectables en versiones modificadas recientes (Grintzalis et al., 2015, 2009). Eso
Requiere las muestras más pequeñas y los tiempos de análisis más cortos y tiene un bajo costo unitario.
( Chutipongtanate et al., 2012). Tolerará niveles normales de la mayoría de las sales,
disolventes, tampones, tioles, sustancias reductoras y agentes quelantes de metales que se encuentran
en muestras de proteína ( Noble y Bailey, 2009 ), y es adaptable a ambos
protocolos de microplacas y cubetas.
Desventajas y precauciones . El ensayo de proteína de Bradford es inhibido por
la presencia de detergentes, ácidos fuertes o bases, por lo que los extractos que contienen estos
puede necesitar ser dializado o neutralizado antes del análisis, o las proteínas pueden ser
precipitado en ácido tricloroacético o acetona y luego resuspendido en tampón neutro
fer. El rango lineal es bastante corto, por lo que las muestras deben probarse con al menos
una dilución para asegurarse de que las concentraciones estén por debajo de la región de meseta. La mayoría
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problemático para proteínas oxidadas, ácidos (arginina, histidina y lisina) que

ligar el tinte también son objetivos importantes para las reacciones con radicales y productos de
lípidos oxidantes. La pérdida de estos sitios de unión reduce la reactividad y la aparente sol-
ubilidad en solución e impide la tinción en geles de poliacrilamida.
Aplicaciones apropiadas . Al igual que el ensayo BCA, el método de Bradford es
aplicable a todas las proteínas nativas. Sin embargo, cuando se sospecha de inhibición de la unión
en proteínas oxidadas (es decir, cuando la lisina, la arginina y la histidina están dañadas y
ya no puede establecer complejos de carga), pérdida aparente de solubilidad de proteínas
debe ser verificado por un método independiente de los aminoácidos, como Kjeldahl o
análisis elemental.
1.7.3 Análisis de sulfhidrilo / disulfuro y óxido de azufre

1.7.3.1 Sulfhidrilo / disulfuro
Principio del análisis : El método predominante para la determinación de SH / SS es
por reacción con el reactivo de Ellman, ácido 5,5'-ditiobis- (2-nitrobenzoico) (DTNB)
( Ellman, 1958, 1959 ). Dado que DTNB es un disulfuro, sufre tiol-disulfuro
intercambio con grupos tiol en compuestos libres o en proteínas (Reacción (32)).
HOOC S S COOH HOOC S SR HS COOH

RSH + +
O2N NO 2 O2N NO 2 (32)
Tiol DTNB disulfuro mixto TNB -
La reacción fundamental para detectar tioles libres ha sido bien caracterizada.

Cada tiol que reacciona con DTNB se suma a través del enlace disulfuro para formar una mezcla
producto disulfuro y liberan un anión 2-nitro-5-tiobenzoato (TNB - ), que
ioniza al dianión TNB 2− en condiciones alcalinas suaves. TNB 2− es amarillo
y puede detectarse ópticamente a 412 nm. Las concentraciones de tiol se cuantifican
tadas de la ley de Beer usando un coeficiente de extinción si las condiciones estándar son
utilizado o en comparación con una curva estándar preparada a partir de un tiol puro como
cisteína si se han modificado las condiciones de reacción. El coeficiente de extinción de
el dianión varía con el solvente usado ( Tabla 1.8 ), por lo que el valor de 13,600 mol /
(L s) originalmente citados no deben aplicarse automáticamente. Límite de detección inferior
es un grupo tiol por proteína en 2 nmol de proteína.
Los disulfuros están determinados por el método ahora clásico de Thannhauser y col .
(1984, 1987) , que crea una reacción de intercambio de tiol-disulfuro a la inversa.
Con el reactivo de Ellman, los tioles libres se agregan al enlace disulfuro de DTNB, pero
La fides no puede hacer esto. Si S – S se reducen in situ, DTNB también se reduce y
no se forma el disulfuro mixto. El método de Thannhauser primero reduce DTNB
asimétricamente con sulfito de sodio para generar NTSB 2− (disodio 2-nitro, 5-
ácido tiosulfobenzoico) y ácido nitrotiobenzoico NTB a pH 9,5. La proteína se distribuye
resuelto en guanidina HCl o tiocianato para desenrollar la cadena peptídica y exponer
todos los aminoácidos azufrados. Para la reacción, cada disulfuro se reduce con sulfuro de sodio.
fito a un tiosulfonato y un anión tiilo (Reacción (33) ), la última de las cuales añade
Página 93
TABLA 1.8 Coeficientes de extinción molar del ácido ditio-bis-nitrobenzoico

(DTNB), reactivo de Ellman, utilizado en ensayos de tiol / disulfuro
Solvente ε (mol / (L s)) a 412 nm
SDS al 2% 12.500
Fosfato 0,1 mol / L, pH 8,0, EDTA 1 mmol / L 14.150
Clorhidrato de guanidina tamponado 6 mol / L 13,700
6 mol / L de clorhidrato de guanidina 13,880
Tiocianato de guanidina 13.600 (original)
8 mol / L de urea 14,290
Extraído de ThermoScientific (2011) ; utilizado con permiso.
a través del enlace SdS de NTSB para dar el reactivo estándar de Ellman mezclado
disulfuro ( reacción (34) ).
2−
RSSR ′ + SO 3 RSSO 3 - + R′S - (33)
S-SO 3 - S-
+ R′S– + R′S-SO 3 -
(34)
ARRULLO- ARRULLO-
NO 2 NO 2
Este producto se detecta a 412 nm y se cuantifica en comparación con un estándar.

curva de dard preparada a partir de cistina. Un coeficiente de extinción de 13.600 mol /
(L cm) por tiol o disulfuro se utiliza normalmente, pero esto se puede modificar con
proteínas específicas. El valor de tiol determinado en este ensayo en realidad explica
tioles totales de tioles y disulfuros, por lo que el contenido de tiol libre determina
en proteínas no reducidas por la reacción estándar de DTNB debe sustraerse de la
contenido total de tiol para determinar el contenido de SdS por diferencia. El ensayo es rápido,
requiere de 3 a 5 min para los oligopéptidos y 20 min para las proteínas, y detecta tan poco
como 10 −8 moles de enlaces disulfuro, con un error de ± 3%.
Esta reacción básica de Ellman se ha modificado de numerosas formas para
lograr diferentes objetivos. DTNB reacciona solo con los tioles disponibles en la superficie
de proteínas, cuya pérdida durante el procesamiento y almacenamiento puede sugerir proteínas
agregación, reticulación de disulfuro u oxidación de tiol a varios óxidos de azufre.
La ganancia de tioles superficiales en las mismas circunstancias indica que se desenrolla
de estructura nativa para exponer cisteínas adicionales o escisión de disulfuro nativo
fides. La determinación de tioles proteicos totales requiere desnaturalización antes del ensayo para
Página 94
exponer tioles que están enterrados en configuración nativa o por calor u oxidativo
agregación. La diferencia entre este valor y los tioles superficiales proporciona una
medida del plegamiento o agregación de proteínas. 6 mol / L de sales de guanidinio son pre
ferred para la desnaturalización de proteínas en este ensayo porque son estables y proporcionan
sin interferencia. La urea debe prepararse fresca y usarse con precaución porque
se degrada fácilmente para formar cianatos que reaccionarán con grupos tiol. Añadiendo
el ensayo de disulfuro para cuantificar los tioles totales y distinguir los disulfuros proporciona
un balance de masa para tioles. Cuando los tioles se oxidan solo a enlaces cruzados de SdS, el total
los tioles permanecen constantes. Cuando los tioles totales disminuyen, otros mecanismos de pérdida,
como la oxidación a óxidos de azufre por radicales lipídicos y la complejación con lípidos
los aldehídos de oxidación, probablemente estén activos.
El ensayo de Ellman detecta tioles libres solo en solución, pero proteínas oxidadas
a menudo pierden solubilidad y se vuelven difíciles de extraer, y se requieren agentes reductores
para solubilizar algunas proteínas, se destruyen los enlaces disulfuro existentes. Tomar ventaja
del hecho de que NTB 2− , el agente productor de color tanto en el ensayo SH de Ellman
y el ensayo SdS de Thannhauser, no permanece unido a la proteína sino que se libera
en solución, Chan y Wasserman (1993b) desarrollaron un ensayo en fase sólida para
detectar grupos tiol y disulfuro solubles y particulados en simulaciones combinadas
procedimientos plificados. El procedimiento fue diseñado para proteínas de cereales extruidas pero
también lo hemos usado con otros tipos de alimentos. Brevemente, para tioles libres, secos
Las muestras de alimentos molidos (10-30 mg) se suspenden en 8 mol / L de urea (recién preparada
pared), 10 mmol / L de DTNB, 3 mmol / L de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA),
SDS al 1% y Tris-HCl 0,2 mol / L, pH 8, y se deja reaccionar (tiempo requerido
determinado por el material), luego las muestras se centrifugan para eliminar los sólidos,
y la absorbancia del sobrenadante se lee a 412 nm (Ellman modificado
ensayo). Los procedimientos son básicamente los mismos para el disulfuro y el tiol total, excepto que
Tris-HCl, pH 9.5 y NTSB 2− se sustituyen (ensayo de Thannhauser modificado).
La reacción se realiza sin sulfito para determinar los disulfuros y con sulfito reductor.
ción para determinar los tioles totales. El contenido de disulfuro se calcula a partir de la diferencia
entre los tioles totales después y antes de la reducción de los enlaces disulfuro con sulfito.
La cisteína total se calcula como [- SH] + 2 [- S - S -].
Ventajas . Las reacciones de Ellman y Thannhauser son rápidas, simples y
estequiométricamente cuantitativo; son muy sensibles y pueden detectar pequeños
cambios en las proteínas oxidadas. Juntos, los ensayos proporcionan una flexibilidad considerable
ity para investigar los roles de SH / SS en las modificaciones de proteínas mediante el análisis de tioles
conversión
La y sin desnaturalización
en fase sólida dely ensayo
con y sin reducción
(Chan de disulfuros.
y Wasserman, 1993b ) proporciona
un método rápido y conveniente para cuantificar el contenido de tiol y disulfuro de oxi-
proteínas diluidas sin extracción previa. Supera los inconvenientes de la incompleta
extracción o solubilización de proteínas dañadas, y reduce en gran medida el sulfhidrato
oxidación en seco y pérdida de proteínas durante la manipulación y las reacciones.
Desventajas y precauciones : detección básica de tiol mediante el reactivo de Ellman
requiere la eliminación de agentes reductores de los medios de extracción ya sea por diálisis
o por precipitación y resuspensión de proteínas antes del análisis. Reactivo DTNB
Página 95
debe recristalizarse en etanol para eliminar las impurezas que interfieren con el
reacciones. DTNB suministrado en kits presumiblemente ya lo ha hecho. Tioles
son sensibles a la oxidación y tanto los aniones TNB - como NTSB 2− se degradan con la luz
( Walmsley et al., 1987 ), por lo que los resultados más precisos se obtienen cuando las reacciones
se ejecutan con poca luz en condiciones anóxicas, como las soluciones rociadas con argón
y espacio de cabeza mantenido bajo argón o reacción en una caja de guantes.
Aplicaciones . Los métodos en solución y en fase sólida descritos aquí son
aplicable para determinar el contenido de cisteína y cistina nativa de todos los pro-
teins, así como modificaciones SH / SS durante el procesamiento y almacenamiento.
1.7.3.2 Óxidos de azufre

Los óxidos de azufre casi nunca se analizan en las proteínas alimentarias, probablemente porque
Se supone que las cisteínas oxidadas solo forman enlaces cruzados de disulfuro. Sin emabargo,
La formación de sulfóxido de metionina es bien reconocida, por lo que hay muchas razones.
esperar reacciones paralelas de cisteína para formar sulfóxidos de cisteína y sulfínico,
ácidos sulfénico y sulfónico. Recientemente hemos observado una pérdida casi completa
de tioles y disulfuros detectados en harinas envejecidas, acompañadas de reducción de
polimerización de gluteninas de alto peso molecular y actualmente están probando para
determinar si la oxidación superficial de los residuos de cisteína a sulfóxidos es la respuesta
sible. Los óxidos de azufre pueden al menos ser detectables a mediados del RI ( Reusch, 2013), incluso
si no son cuantificables. Rudyk y Eaton (2014) han revisado recientemente
métodos para medir los estados de oxidación del azufre en las proteínas, pero cuantitativos
Quedan por desarrollar métodos para analizar los óxidos de azufre en las proteínas alimentarias.
1.7.4 Polimerización y fragmentación (SDS-PAGE)

La oxidación a menudo causa entrecruzamiento de proteínas por radicales, enlaces disulfuro y
Base de Schiff o puentes de Michael, y formación de dicarbonilos en el fondo proteico
el hueso conduce a la escisión de las cadenas peptídicas (Schaich, 2008). Siguiendo estas molec-
ular cambios de peso es una de las formas más fáciles de detectar la co-oxidación de proteínas.
El método más sencillo para determinar la distribución del peso molecular
ciones en mezclas de proteínas o cambios en los pesos moleculares de proteínas modificadas
es la separación por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS.
Principios del análisis . El sistema de formación de gel consta de cuatro componentes:
polímero base acrilamida (CH 2 = CH - CO - NH 2 ), reticulante bisacrilamida
(CH = CH - CO - NH - CH 2 - NH - CO - CH = CH 2 ), persulfato de amonio
(iniciador de radicales) y acelerador TEMED (tetrametiletilendiamina).
TEMED forma radicales libres en el persulfato de amonio, que a su vez inician
reacciones en cadena de radicales libres entre acrilamida y bisacrilamida, y copoliamida
La merización entre estos dos agentes forma un gel. El gel es una red abierta con
poros de tamaños que varían con las concentraciones de los componentes de acrilamida.
La estructura porosa del gel actúa como una especie de tamiz, permitiendo o retardando
movimiento a través de él dependiendo del tamaño molecular. Crecimiento de acrilamida total superior
elimina los poros más pequeños y separa las proteínas más pequeñas al tiempo que excluye las proteínas grandes.
Página 96
Las concentraciones bajas de acrilamida hacen lo contrario, separando el peso molecular alto
proteínas sin retener proteínas muy pequeñas. Del mismo modo, a un porcentaje dado
acrilamida, bajas concentraciones de bis abren la matriz y expanden la proteína
tamaño aceptado mientras que bis más alto tiene el efecto de aumentar el tamaño de malla del gel
(poros más pequeños) y reteniendo más péptidos pequeños. Los tamaños de los poros son los más pequeños al 5%
bisacrilamida y aumentan tanto en valores más bajos como más altos.
En los análisis de rutina, los niveles totales de acrilamida (% T) suelen oscilar entre
7-20%. Para proporcionar un marco de referencia, algunos ejemplos de masas moleculares
separados por varias concentraciones de acrilamida se enumeran en la Tabla 1.9. Estas
deben usarse como pautas generales solo ya que los límites de masa proteica, bajos
y alto, que puede manejarse con un porcentaje dado de acrilamida varía con el porcentaje
reticulante agregado, así como el sistema de tampón de gel, como Tris – HCl, Tris– glicina,
Tris-acetato, etc.
Como se muestra en Tabla 1.9 , los geles pueden ser simples (isocráticos) o un rango de (gradiente)
concentraciones de acrilamida. La elección de las condiciones depende de las características moleculares.
distribución ponderal de proteínas en los extractos y concentraciones de acrilamida
de los geles debe adaptarse a cada tipo o mezcla de proteínas analizadas. Cuándo
Los péptidos a analizar tienen un rango de peso molecular muy amplio o tienen muchos
bandas de péptidos (nativos o modificados) muy similares en peso, los geles de gradiente pueden
TABLA 1.9 Tamaños de proteínas separados por diferentes totales

Concentraciones de acrilamida (% T) en isocrático y gradiente
Geles. Se supone que geles de tris-glicina, 5% de reticulante
Masa Mol de Proteína

%T (kDa)
7 45-200
7.5 50-200
8 40-200
10 25-200
12 20-100
15 3–100
20 1-50
4-20 5-200
10-20 5–150
4–12 25–250
8-16 15-200
Adaptado de Lonza (2015); utilizado con permiso.
Página 97
Extiende efectivamente el rango de trabajo y mejora la separación de bandas cercanas.

La mayoría de los alimentos, por ejemplo, tienen muchos péptidos con pesos moleculares que agrupan
ter en determinadas regiones. En tales casos, los geles isocráticos pueden comprimir estas regiones.
y reducir la resolución de bandas individuales. Reticulación, fragmentación y
La alteración de la organización cuaternaria normal en las proteínas oxidadas puede sub-
cambiar de forma drástica y dramática los patrones de peso molecular, por lo que el analista debe
dispuesto a explorar concentraciones de acrilamida isocrática que son diferentes a las
las proteínas nativas o la adición de un gradiente para rastrear todas las fracciones de proteínas
ciones. Encontrar las condiciones óptimas para diferentes extractos proteicos de nativos
y las proteínas modificadas pueden requerir mucho ensayo y error.
Hoy en día, los geles en placa se utilizan casi exclusivamente para la separación de proteínas. Una delgada
La solución de acrilamida-bisacrilamida se prepara en tampón y se vierte entre
dos placas de vidrio para gelificar; este es el gel de resolución o separación. Un peine especial
colocada en la acrilamida líquida en la parte superior crea pozos de muestra a medida que el gel se solidifica
fies. Para separar proteínas, el ensamblaje de gel con proteína cargada en los pocillos se
colocado entre dos depósitos de disolvente que contienen tampones. Cada depósito tiene un
electrodo, generalmente con el electrodo negativo en la parte superior y el electrodo positivo
trodo en la parte inferior, pero esto se puede revertir. Cuando se aplica un campo eléctrico
al sistema, las cargas de la proteína comienzan a conducir cada péptido hacia el
electrodo con carga opuesta (Garfin, 1990).
Si las proteínas se cargan directamente, se difunden lentamente en el gel de resolución en
diferentes velocidades, y esto conduce a la distorsión y reducción de la resolución de separados
bandas de péptidos. Para proporcionar patrones más limpios y bandas de péptidos más ajustadas,
La phoresis se realiza de forma rutinaria con un gel de apilamiento estrecho (4-5% de acrilamida) vertido
en la parte superior del gel de resolución. Los geles apilables tienen poros grandes que permiten
teins hasta aproximadamente 250 kDa para entrar y concentrarse. Ahora agregue a esto
un sistema tampón discontinuo en el que los geles se preparan con mayor frecuencia
con tampones Tris-HCl (pH 6,8 para gel de apilamiento, pH 8,8 para gel de resolución) y
el tampón del depósito es Tris-glicina pH 8,3. Cuando se aplica corriente, el cloruro
iones (-) de los dos geles migran en el frente mientras que los iones de glicina (+) de
el rastro del amortiguador del reservorio detrás y las proteínas se apilan o se enfocan entre
estos dos frentes en bandas apretadas. Las proteínas permanecen apiladas hasta que finalmente los iones de glicina
entrar en el gel de resolución a un pH más alto, desprotonarse y asumir una neta
(-) cargo. En este punto, todas las moléculas comienzan a migrar y separarse de acuerdo con
masa molecular.
La electroforesis tiene dos modos principales de uso en el estudio de pro-
tensiones: geles nativos y geles SDS. Ambos se pueden ejecutar con o sin geles apilables.
Los geles nativos separan las proteínas principalmente por equilibrio de carga y pueden proporcionar
información importante sobre las modificaciones de la superficie (consulte la Sección 1.7.5.1 ). A diferencia de,
SDS-PAGE, también conocido como sistema Laemmli, incluye SDS al 1% y
0,1 mol / L de mercaptoetanol en el tampón de electroforesis para separar proteínas por
masa molecular (Laemmli, 1970 ). SDS es un tensioactivo aniónico que desnaturaliza
proteínas, exponiendo los aminoácidos enterrados, luego se une a las proteínas a un nivel constante
de aproximadamente 1,4 mg de SDS / mg de proteína, mientras que el mercaptoetanol reduce el disulfuro
Página 98
entrecruza y facilita el desenrollamiento completo de proteínas. La SDS encuadernada

imparte una carga negativa y un volumen hidrodinámico a la proteína que se
proporcional a la masa molecular. Dado que la relación carga-masa es la misma para
todas las proteínas, en un campo eléctrico las proteínas se mueven a una velocidad determinada estrictamente
por su tamaño, es decir, la carga total y la capacidad de moverse a través de los poros del gel.
Las proteínas más pequeñas tienen menos carga, pero pueden atravesar la matriz del gel.
mientras que las proteínas más grandes están impedidas. Así, las proteínas se distribuyen en un gel SDS con
proteínas más pequeñas en la parte inferior (+ electrodo) y proteínas más grandes en la parte superior
(- electrodo). Las aplicaciones SDS-PAGE son críticas para detectar enlaces cruzados,
fragmentación y reordenamientos de proteínas oxidadas. SDS-PAGE lo hace
Es fácil determinar qué fracciones de péptidos han sido más modificadas (las bandas son
borrosa, disminuida o perdida por completo), y revela la formación de nuevas bandas.
Sin embargo, estos resultados deben combinarse con otro método como el específico
anticuerpos ( Partridge et al., 2003 ) o aislamiento de bandas seguido de espectrometría de masas
referencia de análisis trométrico u otro para rastrear la fuente de nuevas bandas.
Finalmente, los geles deben teñirse para visualizar bandas de proteínas separadas.
La mayoría de las tinciones tradicionales son positivas, es decir, las proteínas se tiñen y destacan
en un contexto claro. También se dispone ahora de una serie de nuevas tinciones negativas.
capaz que se unen a la matriz de gel exclusivamente para que las proteínas se destaquen como claras
bandas. Dado que las proteínas oxidadas tienen sus propios problemas únicos con la tinción, esto
la discusión se limitará al azul Coomassie y la tinción plateada. Información sobre
se pueden encontrar manchas adicionales en (Steinberg, 2009 ).
Coomassie Blue R-250 (en contraste con G-250) utilizado en la proteína Bradford
El ensayo ha sido la tinción estándar para geles PAGE casi desde el desarrollo
de electroforesis. Como se señaló en la sección de ensayo de proteínas de Bradford, Coomassie
azul se asocia con aminoácidos cargados positivamente en la superficie de la proteína (argi-
nueve, histidina, lisina) por interacciones de carga y con aminoácidos aromáticos
y regiones peptídicas por interacciones hidrófobas o de van der Waals ( Roth, 2010 ).
Los geles eluidos se retiran de las placas, se sumergen en agua para eliminar el SDS y luego
en Coomassie Blue R-250 (0,1% en metanol: ácido acético glacial: agua 4: 1: 5) para
fijar las proteínas y dejar tiempo para que el tinte se asocie con la proteína diana
sitios. El R-250 tiñe todo el gel, decolorando en el mismo solvente sin tinte
es necesario para eliminar el tinte unido de forma inespecífica. Las proteínas luego aparecen como
bandas azules con intensidad proporcional al número de residuos reactivos en
el péptido. Se pueden detectar tan solo 0,1 a 1,0 μg de proteína por banda (Brunell e
y verde, 2014). Coomassie R-250 funciona muy bien con proteínas nativas, pero
nos hemos encontrado con una pérdida significativa de la unión del tinte en proteínas que han sido
modificado por procesamiento y oxidación, donde los tres aminoácidos diana son
dañados con frecuencia. En tales casos, las bandas aparecen desvaídas e incluso se pueden perder.
El aumento de las concentraciones de proteínas en el gel no corrige el problema.
Hay muchas declaraciones en la literatura que Coomassie Blue G-250
no funciona para teñir geles PAGE. No obstante, los procedimientos para el uso de
El tinte dal se ha desarrollado y se ha demostrado que es preferible al R-250 en algunos casos.
Los disolventes de tinción para G-250 son sulfato de amonio, ácido fosfórico y metanol.
Página 99
mezclas y la forma coloidal del tinte no queda atrapada en el gel

matriz. Por lo tanto, el tinte no unido se puede lavar fácilmente con agua, dando un color claro.
antecedentes sobre el gel ( Neuhoff et al., 1985, 1988; Kavran y Leahy, 2014 ).
CBB G-250 tiene dos grupos metilo adicionales que aumentan la unión del tinte a
proteínas por interacciones de van der Waals, reemplazando la asociación de carga potencialmente perdida
ciones. Estamos en el proceso de evaluar si el uso de este tinte puede mejorar
tinción de proteínas oxidadas.
Los protocolos para teñir geles con azul de Coomassie están ampliamente disponibles.
en muchas series de Protocolos. Se pueden encontrar algunos ejemplos específicos en ( Grintzali s
et al., 2009; Dyballa y Metzger, 2012; Brunelle y Green, 2014).
La tinción con plata es 100 veces más sensible que el azul Coomassie, detectando
10-100 ng por banda de péptido ( Merril et al., 1983, 1984; Merril, 1990 ). Iones de plata
se unen a los grupos sulfhidrilo y carboxilo de las proteínas y se reducen a libres
plata metálica, que luego se deposita en la columna vertebral del péptido cerca de donde se
fue formado (Rabilloud, 1990 ). Esto es opuesto a las características de unión de Coomassie.
ter. Debido a que la mayoría de las proteínas tienen componentes de aminoácidos tanto básicos como ácidos,
Los patrones de péptidos suelen ser los mismos ya sea que estén teñidos con azul de Coomassie o
plata. Sin embargo, cuando las proteínas son predominantemente una u otra, básica o
ácidos, sus geles pueden verse muy diferentes con los dos tintes.
Los procedimientos de tinción con plata son complejos y muy fáciles de desarrollar en exceso. Todas
de las muchas variaciones publicadas en la literatura tienen en común las siguientes
siguiendo los mismos pasos básicos: (1) fijar proteínas y eliminar compuestos interferentes
en geles; (2) sensibilizar con tiosulfato para aumentar la sensibilidad y el contraste
de la tinción; (3) impregnar el gel con una solución de nitrato de plata o una
solución de complejo de plata-amoniaco, se une a proteínas mediante complejos de carga;
(4) enjuague la plata no unida del gel y luego desarrolle con formaldehído u otro
agente para construir la imagen del metal plateado; y (5) detener la reacción y enjuagar para terminar
desarrollo antes de la formación excesiva de fondo y para eliminar el exceso de sil-
ver ion y otros productos químicos antes de su procesamiento posterior (Chevallet et al., 2006 ).
El color de la banda resultante varía de marrón oscuro con tiempos de exposición cortos a un
gama de colores oxidados a naranja a amarillo oscuro con tiempos de exposición prolongados
( Dunn, 1996 ). La tinción en gel con plata depende mucho de la temperatura, por lo que
El laboratorio o el área de trabajo deben mantenerse a aproximadamente 25 ° C durante todo el
proceso de tinción ( Chevallet et al., 2006 ).
Se pueden incluir ejemplos de protocolos con procedimientos detallados y sugerencias útiles.
encontrado en ( Patel et al., 1988; Dunn, 1996; Chevallet et al., 2006; Gromova y d
Celis, 2006; Kavran y Leahy, 2014 ).
Una nota importante: los patrones de péptidos suelen ser los mismos ya sea que estén manchados
por Coomassie Blue o silver porque la mayoría de las proteínas tienen tanto básicas como ácidas
componentes de aminoácidos. Sin embargo, cuando las proteínas son predominantemente una o la
otros, básicos o ácidos, sus geles pueden verse muy diferentes con los dos tintes.
De manera similar, la modificación de los residuos de unión en las proteínas oxidadas cambia la tinción.
ing patrones con Coomassie Blue y plata de manera diferente. Por lo tanto, comparando pep-
Los patrones de marea obtenidos de las dos manchas pueden proporcionar algunas pistas muy útiles.
Página 100
sobre los sitios de daño que pueden ayudar a interpretar los resultados de PAGE, así como guiar
análisis detallados posteriores para productos específicos.
Ventajas . La electroforesis ofrece una flexibilidad considerable a la hora de
separaciones de teinas a diferentes distribuciones de peso molecular y propiedades proteicas
erties ajustando las concentraciones de acrilamida en geles isocráticos y en gradiente,
alterar la concentración del tampón de funcionamiento y el pH, utilizando SDS frente a geles nativos
variando el tinte utilizado para la visualización de bandas de péptidos. Solo muy pequeño
se necesitan cantidades de proteínas, típicamente de 1 a 100 ng, según la tinción.
Se pueden analizar varias muestras en el mismo gel (normalmente 12 en geles de 5 cm),
permitiendo que los controles y las réplicas se ejecuten simultáneamente, o muchas variantes para
compararse con el espacio que queda para los patrones de peso molecular.
Desventajas y precauciones . La acrilamida es una potente neurotoxina, por lo que debe
manipularse con capucha y guantes, teniendo especial cuidado de no inhalar partículas.
Los geles son frágiles. Aprender a prepararlos consistentemente y manejarlos sin
El daño requiere mucha práctica y atención constante a los detalles. Comercial
Hay geles prefabricados disponibles, pero a un precio elevado. Porque la reticulación de acrilamida
se acelera en gran medida por el oxígeno, las soluciones deben desairearse cuidadosamente o el
la acrilamida solidifica antes de que el gel se pueda moldear. Mantener la acrilamida caliente
facilita el casting. La electroforesis no es un proceso rápido. Mucho tiempo (al menos dos
días o más) es necesario para verter geles, ejecutar separaciones, fijar-manchar-detener geles,
y escanee los geles teñidos finales.
Sales, detergentes, desnaturalizantes, trazas de disolventes orgánicos y carbohidratos
drate contaminantes en extractos de proteínas, todos interfieren con SDS-PAGE, cambiando
ing migración y reducción de enfoque de banda. Por lo tanto, es habitual con los nativos
extractos de proteínas y aún más crítico con proteínas oxidadas, para limpiar el
extractos antes de someter las proteínas a PAGE. Hay varias opciones disponibles.
Dependiendo de la naturaleza del contaminante, la cantidad de proteína disponible
capaz, y la susceptibilidad de los péptidos de prueba a una mayor oxidación ( Evans et al. ,
2009 ). La diálisis es una opción, pero requiere mucho tiempo y grandes cantidades de
tein; Los casetes de portaobjetos de diálisis son una opción para muestras limitadas. Lluvia ácida
(p. ej., ácido tricloroacético) es un método estándar con proteínas nativas, pero ejecuta el
riesgo de modificar los sitios de oxidación en proteínas oxidadas. Precipitación en frío
la acetona es eficaz, se puede manipular a microescala, no daña modificado
proteínas, y tiene la ventaja adicional de disolver los lípidos no unidos que
han sido arrastrados en el extracto. Hemos encontrado este método muy útil.
con una serie de aplicaciones de proteínas modificadas (Partridge et al., 2003). Huellas
Los disolventes orgánicos se pueden eliminar fácilmente mediante evaporación / congelación por congelación al vacío.
centrado sin dejar de proteger las proteínas.
Finalmente, unas palabras para los sabios con respecto a la electroforesis de proteínas oxidadas:
¡No espere obtener geles atractivos con patrones de bandas limpios! Daño
a los grupos de superficie, así como la fragmentación aleatoria y la reticulación de todo el plomo
a modificaciones que pueden resultar en una considerable mancha de bandas. Además, pérdida
de unión del tinte, especialmente con azul de Coomassie, ya que
La lisina y la arginina se encuentran entre los aminoácidos más sensibles a la oxidación.
Página 101
La tinción con plata es menos susceptible pero aún muestra aberraciones si los grupos ácidos
se pierden, como por descarboxilación (Schaich, 2014). Complejamiento covalente de
Las proteínas con almidones y lípidos en los alimentos complican aún más los patrones de migración.
y unión de tinte. Interpretación de patrones de bandas de electroforesis de proteínas oxidadas
de los alimentos no suele ser un dilema de "¿qué cambios podemos ver?" pero
más bien, "¿qué química pudo haber sucedido para hacer cambios tan dramáticos?"
Aplicaciones . La electroforesis se ubica con solubilidad como el análisis más
utilizados como indicadores de oxidación y modificación de proteínas. Geles SDS para detección
ción de entrecruzamiento y fragmentación son la aplicación más común, pero
El uso más extenso de geles nativos y tinción diferencial puede proporcionar incluso
más información sobre otros cambios moleculares que se han producido. Hemos usado
Geles SDS para estudiar la oxidación de proteínas en chips de tortilla horneados y fritos, laminado-
mantequilla de maní envasada y harina almacenada en diferentes envases ( Schaich, 2014 ).
Wu y col. (2009) utilizaron electroforesis para determinar que el peroxilo generado por azida
los radicales indujeron la reticulación de disulfuro específicamente en las β-conglicininas.
1.7.5 Modificaciones de superficie
Los radicales lipídicos, hidroperóxidos, aldehídos y epóxidos reaccionan con amino

cadenas laterales ácidas para modificar las superficies de las proteínas de manera que interfieran con las
función de las proteínas y degradan la estructura de las proteínas en los alimentos. Modificaciones de superficie
incluyen la oxidación de aminas, alcoholes y tioles a óxidos y carbonilos;
desaminación y descarboxilación; y complejación de productos de oxidación de lípidos
a través de la adición de Michael y las condensaciones de base de Schiff. Desafortunadamente, hay
no hay forma de probar todas estas modificaciones en un solo ensayo; cada modificación
debe analizarse de forma independiente. ¿Cuántos y qué cambios deben seguirse?
como marcadores de oxidación depende de la proteína oxidada, la química
Se sospecha que subyace a las modificaciones macroscópicas o funcionales observadas, y
la pérdida de función o comportamiento alterado que necesita ser explicado.
1.7.5.1 PÁGINA nativa

Principios del análisis . Principios generales de la electroforesis en gel de poliacrilamida
resis se describieron anteriormente. En contraste con SDS-PAGE que busca determinar
pesos moleculares, los geles nativos no contienen agentes desnaturalizantes, por lo que las proteínas retienen
su configuración nativa (o modificada) y la migración de proteínas se rige por
Propiedades moleculares: carga superficial principalmente, seguida de forma y tamaño. Pro-
La carga teína está determinada por la composición relativa de NH 3 + y COO - grupos
en la superficie del péptido. En general, cuanto mayor sea la densidad de carga, más rápido y
más proteínas se moverán en el gel, con proteínas ácidas que se moverán hacia el
cátodo en la parte inferior y proteínas básicas que permanecen más cerca del ánodo en la parte superior.
Al mismo tiempo, la matriz de gel impone un efecto de tamizado secundario que impide
movimiento de las proteínas de acuerdo con el tamaño y la forma hidrodinámicos. Porque carga
Las fuerzas impulsoras son a veces opuestas a los efectos que impiden la masa, las proteínas no
no se distribuyen por tamaño en los geles, y los patrones de bandas de péptidos suelen ser muy
Página 102
diferente que en geles SDS para las mismas proteínas. Posición de los péptidos en los geles.
no es fácil de deducir por lógica. Por lo tanto, deben ejecutarse controles puros para identificar posi-
ciones de diferentes proteínas en los geles.
Ventajas . Esta es la forma más rápida y sencilla de evaluar si
se han producido modificaciones superficiales en proteínas oxidadas. Porque no desnaturalizar
Las hormigas se utilizan en PAGE nativa, interacciones de subunidades dentro de un pro-
tein generalmente se retienen y se puede obtener información sobre el cuaternario
estructura. Además, por la dirección de los cambios de migración y los cambios en Coo-
Massie Blue versus tinción con plata, se pueden hacer deducciones sobre el potencial
para la desaminación y descarboxilación o bloqueo de la amina respectiva y
grupos ácidos.
Desventajas . Ejecutar estos geles genera más calor por fricción que SDS
geles, por lo que es fundamental mantener el aparato frío para minimizar los efectos de la desnaturalización
turación y proteólisis y para evitar el desenfoque de la banda. La mayoría de los sistemas de gel tienen
camisa de enfriamiento alrededor del gel; esto debe llenarse con agua muy fría o hielo
lodos. Interpretación de patrones de bandas y seguimiento de cambios de oxidación de un
la proteína en una mezcla es difícil debido a la migración de modo mixto. Controles de indi-
proteínas individuales no modificadas o extractos de materiales nativos antes del procesamiento
debe ejecutarse en cada gel para comparar. La reproducibilidad es un problema; nativo
Los geles son mucho más sensibles a las variaciones en la corriente eléctrica de la fuente.
oa través del gel, así como a variaciones microscópicas en cada gel. Com prefabricado
Los geles merciales aumentan la reproducibilidad pero a un costo elevado.
Aplicaciones . Los geles nativos se utilizan cuando se utiliza información distinta a la molecular.
Se necesita un peso mayor. Por ejemplo, en grupos de proteínas como las gliadinas donde
muchos péptidos tienen pesos moleculares similares pero propiedades diferentes, gliadinas
se ejecutan muy de cerca o incluso se superponen en geles SDS, pero pueden ser completamente
separados en geles nativosPartridge et al., 2003 ). Los geles nativos también son útiles para
detectar proteínas con muchos grupos cargados que pueden haber sido descarboxilo
atado o desaminado, como las proteínas de maní ( Wan Ibadullah, 2013) y carne
proteínas miofibrilares, así como proteínas en las que se cargan asociaciones entre
Las estructuras cuaternarias se han alterado, como las araquinas de maní y las conara-
barbillasWan Ibadullah, 2013 ).
1.7.5.2 Fluorescencia
1.7.5.2.1 Pérdida de triptófano
Todos los aminoácidos aromáticos exhiben fluorescencia en solución y en proteínas ( Tabl e
1.10 ). El triptófano exhibe la fluorescencia intrínseca más fuerte, con menor con-
tribus de tirosina, y la menor de fenilalanina ( Teale y Weber ,
1957 ). Curiosamente, este es también el orden de susceptibilidad a la oxidación por
ids y otras especies reactivas de oxígeno; triptófano, en particular, es muy sus-
susceptible de pérdida durante el procesamiento y almacenamiento. Fluorescencia de lo aromático
Los aminoácidos cambian de longitud de onda con cambios en la estructura de las proteínas y los aminoácidos.
ambiente ácido. Residuos de triptófano que están totalmente enterrados en proteínas plegadas.
Página 103
TABLA 1.10 Características de fluorescencia de los aminoácidos aromáticos
Absorción Fluorescencia
Longitud de onda Longitud de onda Cuántico

Aminoácidos (Nuevo Méjico) Absorción (Nuevo Méjico) Producir
Triptófano 280 5600 348 0,20
Tirosina 274 1400 303 0,14
Fenilalanina 257 200 282 0,04

Held (2003) , usado con autorización.
fluorescen a aproximadamente 330 nm mientras que los residuos expuestos al agua después de la desnaturalización
tienen fluorescencia máxima a una longitud de onda de aproximadamente 340-350 nm ( Lakowicz ,
1983 ). La fluorescencia disminuye en intensidad o se pierde por completo cuando la
las cuotas se oxidan o se modifican químicamente de otro modo. Por tanto, tanto la intensidad como
longitud de onda de la emisión de triptófano puede servir como marcadores rápidos y simples para
oxidación teína.
La fluorescencia intrínseca de los aminoácidos aromáticos (principalmente triptófano) es
determinado en extractos de proteínas (en tampón de extracción) mediante el registro de fluorescencia
espectros de emisión de 300 a 400 nm, con excitación a 280 nm para detectar todos los aro-
aminoácidos matemáticos y a 295 nm para detectar triptófano por separado. La emisión
La longitud de onda máxima para el triptófano es diagnóstica para los nativos versus los modificados.
configuración de proteínas y ambiente de residuos. La intensidad disminuida se diagnostica
nóstica para la modificación de residuos. Desafortunadamente, el triptófano está dañado de manera extensiva.
sivamente por el calor y la oxidación, por lo que la pérdida medida en muestras aisladas no puede
Se atribuye inequívocamente a la oxidación de lípidos. Sin embargo, los daños en el procesamiento pueden
separarse de la oxidación al menos presuntamente mediante el análisis de espectros
inmediatamente después del procesamiento (estrés térmico o físico) y después de la incubación
o almacenamiento donde se produce la oxidación.
La intensidad de la fluorescencia varía con la temperatura, para la mayoría de las proteínas disminuye
a diferentes velocidades a medida que aumenta la temperatura. Por tanto, los ensayos de fluorescencia de triptófano
cence requieren una temperatura constante estrictamente controlada (Gally y Edelman, 1962 ).
Utrera y Estévez (2012) utilizaron fluorescencia intrínseca para seguir la oxidación
de triptófano en solución por reacciones de Fenton, así como protección por varios
Compuestos fenólicos. Usamos cambios y pérdida de fluorescencia de triptófano en todos
nuestros estudios de oxidación de proteínas en los alimentos.
1.7.5.2.2 Apariencia de productos fluorescentes

Este fenómeno fue descubierto en gran parte por ALTappel y sus colegas.
( Chio y Tappel, 1969; Fletcher y Tappel, 1970; Fletcher et al., 1973; Malshe t
y Tappel, 1973; Dillard y Tappel, 1984), y se ha utilizado con frecuencia como
Página 104
un marcador de interacciones lipídico-carbonil-proteína. Una percepción errónea generalizada ha

sido que la fluorescencia surge de los productos base de Schiff de cualquier lipido carbonilo
reacción con grupos amino de proteínas ( Schaich, 2008 ). Sin embargo, modelo detallado
Los estudios del sistema han demostrado que mientras que los aductos simples de la base de Schiff (- N = CH -
CH 2 - CHO o - NH - CH = CH - CHO) contribuyen al dorado (Zamora et al. ,
2000 ), no todos son fluorescentes ( Itakura y Uchida, 2001 ). Más bien, piridinio
y productos de pirrol resultantes de reacciones de proteínas con hidroper-
Los óxidos, así como los productos secundarios de carbonilo, son las principales fuentes de fuertes
fluorescencia detectada en alimentos [( Schaich, 2008) y referencias en el mismo], y
la característica estructural responsable de la fluorescencia es el conjugado imino-eno
ción (R - N = CH - CH = CH - NH - R) originalmente identificado por Malshet y Tappe l
(1973). Los productos fluorescentes existen tanto en forma de monómero como en enlaces cruzados, por lo que
contribuir tanto a las modificaciones de la superficie como a la reticulación en co-oxidadas
proteínas, respectivamente.
Los productos de co-oxidación fluorescentes requieren temperaturas elevadas para formarse;
sólo se observan trazas, si las hay, a temperatura ambiente o de refrigeración. Pequeño
a que no se desarrolle fluorescencia en reacciones a temperatura ambiente o refrigerada,
pero a temperaturas de prueba ASL de 40 y 60 ° C y más procesamiento de alimentos
temperaturas, los compuestos fluorescentes se convierten en productos importantes que contribuyen
al dorado característico y la producción de sabor (Hidalgo et al., 1999, 2005 ).
Las características espectrales de los productos fluorescentes varían enormemente dependiendo
sobre los productos y proteínas de oxidación de lípidos originarios, los números y tipos
de múltiples productos formados, condiciones de reacción y solvente. Generalmente, fluo-
Los rangos de resistencia son de 350 a 395 nm de excitación y de 425 a 470 nm de emisión (Schaich ,
2008). Los productos lineales y cíclicos a menudo están presentes y tienen diferentes especificaciones.
rangos tral, con máximos de emisión cercanos a 430 nm para productos lineales ( Nadkarn i
y Sayre, 1995 ) y 470 nm para pirrol ( Hidalgo y Zamora, 1993) o piri-
dinium ( Kikugawa e Ido, 1984; Kikugawa y Beppu, 1987 ) productos cíclicos.
Estas diferencias se pueden utilizar para el diagnóstico en el análisis de proteínas oxidadas.
Los procedimientos para medir la fluorescencia de carbonil-amina son bastante malos.
definido, con cada laboratorio utilizando su propio método, en su mayor parte. Proteína
La fluorescencia se ha analizado en soluciones tampón (Viljanen et al., 2004 ), en
medios de extracción acuosos, y en extractos solventes, generalmente cloroformo: metanol
1: 1 ( Chio y Tappel, 1969; Fletcher y Tappel, 1970; Dillard y Tappel ,
1971, 1973, 1984; Fletcher y col., 1973; Malshet y Tappel, 1973 ). Fluores
Las características de cence varían con el solvente, ex / em máximos y la intensidad de emisión.
sity ambos aumentan el aumento con la polaridad del solvente (Kikugawa e Ido, 1984 ;
Kikugawa y Beppu, 1987 ). Para determinar los máximos de excitación y emisión para
cada sistema, primero identifique la longitud de onda de máxima excitación registrando
la absorción UV / VIS de la solución de proteína de 300 a 420 nm. Entonces usa
este valor como el punto de ajuste de excitación en el fluorómetro y escanear las emisiones de
400 a 500 nm. Dado que a menudo hay un cambio en el máximo de fluorescencia a medida que
progresa, a menudo es ventajoso escanear las emisiones en un rango amplio.
Para la cuantificación, las longitudes de onda espectrales y la intensidad se calibran con qui-
nueve sulfato y se informa como fotones / mg de proteína.
Página 105
El manejo cuidadoso de las muestras es fundamental para evitar artefactos en el análisis de fluorescencia.
ses. Los contaminantes en los extractos catalizan tanto las fotorreacciones secundarias como la fluidez.
se produce un enfriamiento rápido de la orescencia, especialmente en disolventes acuosos. Por lo tanto, extrae
deben prepararse y analizarse lo más rápidamente posible y protegerse de la luz
para evitar pérdidas por descomposición y alteración de la fluorescencia.
Finalmente, mientras que la fluorescencia de las proteínas puede servir como un marcador general de oxidación
degradación significativa, se debe tener mucho cuidado al interpretar los datos. Como introducción
Como se mencionó brevemente en la discusión anterior, muchos factores afectan la intensidad y la
longitudes de onda de emisión y emisiones de sistemas complejos como los alimentos
probablemente refleje muchas especies fluorescentes. Por lo tanto, la asignación de fluorescentes
estructuras basadas únicamente en los máximos de excitación y emisión se limitan a
distinción mínima entre complejos fluorescentes lineales y anulares. Sin emabargo,
incluso esta información puede respaldar otros resultados analíticos (por ejemplo, electroforesis)
y orientar las decisiones sobre pruebas confirmatorias y auxiliares.
1.7.5.3 Carbonilos proteicos

El desarrollo de métodos para analizar carbonilos de proteínas se ha
impulsado por la necesidad de comprender las funciones de estos productos de oxidación en la patología
ogy ( Shacter, 2000a, b). Sólo recientemente se han aplicado métodos para comprender
efectos de los carbonilos de proteínas en los alimentos, particularmente las carnes ( Estévez, 2011). Proteína
carbonilos, desarrollados a partir de la escisión α y β de radicales alcoxilo formados en el
la columna vertebral del péptido, así como de la oxidación de las cadenas laterales de aminoácidos, son más
estable que los hidroperóxidos de proteínas y lípidos, por lo que proporcionan marcadores muy sensibles
para oxidación. La mayoría de las preparaciones de proteínas contienen aproximadamente 1 nmol de carbonilo / mg de proteína.
teína o ∼0,05 mol de carbonilo / mol de proteína, y estos niveles aumentan en órdenes de
magnitud durante la oxidación en los alimentos. Kits ahora disponibles de varios fabricantes.
Los fabricantes de todos los ensayos descritos a continuación son costosos, pero a menudo proporcionan
mayor sensibilidad y reproducibilidad que ejecutar los ensayos "desde cero"
en el laboratorio, particularmente cuando la pureza del reactivo es crítica. Las pautas son
proporcionados por cada fabricante, pero las diluciones / concentraciones óptimas deben ser
determinado para cada aplicación por el usuario final.
Actualmente, los valores de carbonilo de proteínas son en su mayoría comparativos. Aumenta indi-
cate que se ha producido la oxidación de proteínas, pero no dan pistas sobre el origen, reac-
ciones involucradas, o impacto en la calidad de los alimentos. Se necesitan más estudios para correlacionar
niveles de carbonilo de proteína específicos a otros cambios degradativos en proteínas,
ids, cualidades nutricionales y propiedades de los alimentos para aprender la mejor manera de interpretar y
utilizar los resultados de los análisis. Los estudios de oxidación también deben coordinarse con
estudios de metabolismo y toxicidad para determinar los niveles a los que se oxidan las proteínas
puede comenzar a causar daño fisiológico.
1.7.5.3.1 Carbonilos totales

Los carbonilos de proteínas totales, como los carbonilos de lípidos, se determinan por reacción con
2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) recristalizada. El enfoque básico fue
desarrollado por Levine et al. (1990, 1994) y las versiones analíticas están ahora
Página 106
disponible en solución (análisis espectrofotométrico), por inmunoenzima-

ensayo nosorbente (ELISA), por electroforesis seguida de Western blot y
reacción de anticuerpos específicos, o por HPLC. Una excelente revisión ha comparado y
evaluó estos diversos procedimientos (Dalle-Donne et al., 2003 ).
1.7.5.3.1.1 Reacciones de la solución. El mecanismo de reacción básico es el mismo que

el descrito anteriormente para los carbonilos de lípidos, aunque las condiciones de reacción son más
complejo. Las soluciones de proteínas o extractos de proteínas se hacen reaccionar con DNPH en ácido.
a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 h, las proteínas derivatizadas se precipitan por
El ácido tricloroacético luego se separa del DNPH sin reaccionar y otros contaminantes.
por centrifugación, el sedimento de proteína se lava 3 veces con etanol: acetato de etilo 1: 1,
centrifugado, sedimento resuspendido en 6 mol / L de guanidina-HCl, luego absorbancia óptica
se lee a 276 nm para determinar la concentración de proteína (ε = 9460 M −1 cm −1 ) y en
370 nm para determinar las concentraciones de hidrazona proteica (ε = 22.000 M −1 cm −1 )
( Levine et al., 1990; Shacter et al., 1994b). Los carbonilos proteicos se expresan como
nmol de carbonilo / mg de proteína.
El uso de este ensayo se ha informado en numerosos estudios, con casi la misma
variaciones como informes. Algunos procedimientos se realizan con extractos de proteínas y
algunos con homogeneizados de alimentos para ahorrar tiempo o cuando las extracciones de proteínas son diferentes
ficult. Sin embargo, obtener resultados útiles de esta reacción depende fundamentalmente de
eliminar dos interferencias clave: contaminantes no proteicos en los extractos y
DNPH sin reaccionar después de la reacción. Cualquier procedimiento que omita esta limpieza
los pasos son muy cuestionables. En los homogeneizados de alimentos, en particular, el DNPH reacciona
con cualquier lípido u otros carbonilos presentes, y todos estos se contabilizarán si
no quitar. El lavado final del sedimento de proteína en el procedimiento descrito anteriormente
fue diseñado para eliminar ambas interferencias, pero extractos de proteínas de los tejidos
y los alimentos a menudo necesitan pasos adicionales. Precipitación de proteínas de extractos iniciales
en ácido tricloroacético al 10% como primer paso elimina las proteínas no reactivas con DNPH
materiales y da reacciones más limpias, y agregando un lavado de TCA al 20% después de DNPH
reacción además de aumentar el volumen de acetato de etilo elimina más eficazmente
todos los rastros de DNPH sin reaccionar (Fagan y col., 1999 ).
Ventajas . El ensayo espectrofotométrico no requiere equipo especial
o reactivos y pueden manipularse en cualquier laboratorio. Concentraciones de proteínas en el
La solución de prueba puede determinarse mediante cualquier método aceptable para la normalización de
contenido de carbonilo.
Desventajas . Tiene la sensibilidad más baja de todas las versiones del ensayo,
Se requieren cantidades relativamente grandes de proteína, el manejo requerido es extenso.
sivo y tedioso, y se deben incluir muchos espacios en blanco en la reacción. La solución
El ensayo es propenso a interferencias de contaminantes e inexactitudes debido a la pérdida de
solubilidad de algunas proteínas derivadas de DNPH. Este no es un ensayo de fácil aplicación
a un gran número de muestras, por lo que no es sorprendente que la mayoría de las aplicaciones
estado en estudios biológicos en lugar de con proteínas alimentarias donde muchos tratamientos
necesitan ser comparados. Desde una perspectiva fundamental, este es un ensayo de "caja negra"
donde se cuentan todos los carbonilos pero no se identifica la fuente de los carbonilos.
Página 107
Aplicaciones . A pesar de sus limitaciones, el ensayo de DNPH en solución se considera

ered el estándar de oro contra el cual la precisión de otros ensayos de carbonilo de proteínas
se miden, y se utiliza para cuantificar estándares para ELISA e inmunob-
métodos de lote. Cuando se maneja correctamente, la detección espectrofotométrica de proteínas
hidrazonas proporciona un valor para la comparación de la susceptibilidad de las proteínas a la oxidación
ción, como entre diferentes proteínas en una formulación y diferentes procesos
ing métodos de un material alimenticio. En los alimentos, esta reacción básica de DNPH se ha
utilizado para detectar carbonilos de proteína en el músculo de la carne ( Armenteros et al., 2009) y
rebanadas de músculo y queso de pescadoFernandez et al., 2014 ).
1.7.5.3.1.2 Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Principio de

el ensayo . Se desarrollaron versiones de anticuerpos del ensayo DNPH para eliminar
interferencias de la reacción de la solución y para aumentar la sensibilidad específicamente
detección de proteínas marcadas con DNPH. ELISA hace que los análisis sean cuantitativos por
unir en serie proteínas marcadas con DNPH a la superficie de los pozos en poliestireno
microplacas (típicamente de 96 pocillos), luego un anticuerpo anti-DNPH primario, un
anticuerpo secundario que lleva una enzima como la peroxidasa de rábano picante (HRP)
que proporcionará una reacción marcadora, y finalmente un agente que reaccionará con
HRP para producir color para cuantificación. Reactivos sin reaccionar y contaminantes
los materiales se lavan entre cada paso para que el fondo y
resultados de alta especificidad. Porque este proceso está diseñado para ser manejado en 96
placas de pocillos y equipos especiales están disponibles tanto para los depósitos de reactivos como para
los lavados, el procedimiento total es en realidad más fácil y rápido de lo que parece desde
esta descripción.
Al igual que con cualquier procedimiento complejo, la controversia sobre los procedimientos óptimos es
destinado a desarrollarse. Con ELISA de carbonilos proteicos, puntos de desacuerdo
centrarse principalmente en el paso de unión a proteínas, en particular si se unen nativos
o proteína derivatizada y cuánto unir. Procedimientos iniciales utilizados saturando
concentraciones de 1 μg de proteínas oxidadas en cada pocillo y altas concentraciones
de DTNB ( Buss et al., 1997; Buss y Winterbourn, 2002). Otros estudios afirman
que se obtienen resultados más consistentes con fondos más bajos al enlazar
menos proteína que la capacidad de unión del poliestireno (0,25-0,3 ug / pocillo), reaccionando
DTNB con proteína después de la unión y usando concentraciones más bajas de DTNB
(p. ej., 0,05 mmol / L) (Alamdari y col., 2005; Uehara y Rao, 2015). Ambos pro
Los medicamentos tienen sus proponentes, y los kits comerciales están disponibles con cada
Acercarse. La conclusión es que, especialmente para las proteínas alimentarias oxidadas donde
hay poca experiencia base y los niveles de oxidación deberían ser mucho más altos que
en tejidos biológicos, se deben probar y optimizar protocolos de ELISA alternativos
para cada nuevo material analizado.
Ventajas . ELISA es muy sensible. Tan solo 5 μg / mL o un ug / pocillo
La proteína conjugada con DNPH se puede detectar en un lector de microplacas estándar
( Alamdari et al., 2005) por lo que el método es muy útil cuando se utilizan cantidades de
las proteínas son limitadas. Aumenta la especificidad y la sensibilidad sobre el estándar.
ensayo espectrofotométrico DNPH y proporciona resultados cuantitativos. El método
Página 108
maneja fácilmente una gran cantidad de muestras en paralelo, y sin concentración o

los pasos de precipitación contribuyen a la pérdida de muestras.
Desventajas y precauciones . La cuantificación depende totalmente de la com-
unión completa de la proteína a la superficie del pozo mediante interacciones hidrofóbicas y
otros reactivos en la mayoría de los extractos de proteínas alimentarias. La unión a proteínas es extremadamente
difícil de determinar y es inhibida por detergentes ( Uehara y Rao, 2015 ).
Por lo tanto, las proteínas en los extractos de alimentos deben aislarse mediante diálisis o precipitación y
lavado antes de analizar en ELISA. Se requiere un manejo cuidadoso para evitar pérdidas.
de cantidades variables de proteína en las etapas de lavado. Proteínas oxidadas para el desarrollo
La solución de curvas estándar debe sintetizar y estandarizar
Ensayo DNPH. Los procedimientos aún no están bien desarrollados, pero deben probarse y
optimizado para cada sistema. Los ensayos no son aplicables a pro-
teins donde la agregación bloquea los sitios de reacción y las reacciones secundarias se transforman
aductos de carbonilo ( Augustyniak et al., 2015). Finalmente, un impedimento importante es
costo. Los equipos, kits y anticuerpos de ELISA son bastante caros.
Aplicaciones . Los ensayos ELISA de proteínas marcadas con DNPH son adecuados para plasma,
suero, lisados celulares, extractos o proteínas purificadas. La capacidad de manejar grandes
número de muestras simultáneamente en una sola placa y su aumento en la sensibilidad
La actividad sobre el ensayo en solución ha hecho de esta una técnica muy popular para
ing oxidación de proteínas en muestras biológicas donde las proteínas se aíslan fácilmente
( Dalle-Donne et al., 2003; Khatoon et al., 2012 ). Sin embargo, las aplicaciones paralelas
aún no se han desarrollado para detectar la oxidación de proteínas alimentarias porque
La importancia de la oxidación de proteínas en los alimentos ha atraído recientemente a la industria.
atención, los requisitos para el aislamiento de proteínas se suman significativamente a la manipulación
tiempo y mano de obra, y el costo por análisis es alto en relación con otras opciones.
1.7.5.3.1.3 Carbonilos en proteínas individuales por inmunotransferencia. Como tiene

Se ha observado que todos los métodos DNPH descritos hasta ahora miden los carbonilos totales
y no distingue qué péptidos se ven afectados. Están todos oxidados por igual o
son algunos particularmente sensibles? Porque esta información puede ser muy importante
en alimentos donde las proteínas individuales tienen funciones únicas (p. ej., estructura, gelificación,
formación de espuma, hidratación, emulsificación, unión de agua), determinando qué
Las proteínas se han oxidado en un extracto mediante inmunotransferencia puede ser una herramienta muy útil.
adjunto a los análisis cuantitativos de carbonilo.
Principio del ensayo . La inmunotransferencia, o Western blot, fue originalmente
desarrollado para hacer que las proteínas separadas estén disponibles para los anticuerpos en una matriz inerte
para la detección de propiedades específicas ( Towbin et al., 1979). El proceso involucra
seis pasos similares a los de ELISA: (1) separación de mezclas de proteínas por gel
electroforesis, ya sea SDS o nativa; (2) transferencia de proteínas no teñidas en el
mismo patrón de separación del gel al papel secante por corriente eléctrica en
una unidad especial de "sándwich"; (3) incubación de la membrana con un pro-
teína (generalmente albúmina de suero bovino) para unirse a sitios abiertos en la membrana;
(4) unión de un anticuerpo anti-DNPH, lavado para eliminar el anti-
cuerpo; (5) unión de un anticuerpo secundario conjugado a una enzima informadora;
Página 109
(6) reacción de la enzima con un sustrato para crear un marcador de color para la detección
ción de complejos anticuerpo-proteína, lavado para eliminar el sustrato que no ha reaccionado.
Se encuentran disponibles varias enzimas y sustratos diferentes que permiten la detección
ción por diferentes métodos (color, fluorescencia, quimioluminiscencia, etc.) pero
más común es la peroxidasa de rábano picante con tetrametilbencidina para el color
Detección o Luminata Forte para la detección por quimioluminiscencia. Un gel paralelo
ejecutar simultáneamente con las mismas proteínas pero teñidas normalmente con plata
o el azul de Coomassie proporciona un patrón PAGE normal para la identificación de péptidos
( Figura 1.14 ). Los procedimientos detallados están disponibles en muchos sitios web y en muchos
libros de texto de biología molecular y compendios de protocolos.
Las membranas de transferencia estaban hechas originalmente de nitrocelulosa. sin embargo, el
Las membranas dominantes en uso ahora son de PVDF (difluoruro de polivinilo) o nailon.
que son materiales más resistentes, tienen una mejor retención de proteínas adsorbidas, más
resistencia a la decoloración, niveles de fondo más bajos y mayor sensibilidad que
membranas de nitrocelulosa, particularmente cuando la fluorescencia o quimioluminis-
Se utiliza la detección de cence ( Shewry y Fido, 1998 ).
El ensayo de DNPH de inmunotransferencia tradicional comienza con la reacción de la prueba
proteínas con DNPH, luego separa los complejos por PAGE antes de trans-
fer a una membrana y reacción con anticuerpos específicamente planteados contra
Proteínas DNPH. Sin embargo, existe cierta controversia sobre si la DNPH
La derivatización de proteínas oxidadas debe realizarse antes o después de la transferencia.
del gel PAGE a la membrana. Un argumento clave que respalda la reacción de DNPH después
El blot es que la derivatización de proteínas antes de PAGE, como en el ensayo original,
Requiere un manejo excesivo y conduce a inexactitudes y sensibilidad reducida.
(A) (B)
Sta de plata ain DN
NPH Antibo ody
12345 678 8 12 345 67 8
FIGURA 1.14 Detección de carbonilos proteicos en extractos de harina de maíz procesados y envejecidos en
diferentes caminos. (A) Gel PAGE con tinción de plata para establecer el patrón de péptidos. (B) Western blot
de las mismas proteínas reaccionaron con anticuerpos DNPH. Las regiones coloreadas indican la presencia de proteínas.
carbonilos.
Página 110
debido a la degradación de proteínas derivatizadas durante la electroforesis. Enlace DNPH

ing también altera las cargas de proteínas y la migración electroforética, por lo que no es posible
para comparar directamente los patrones de proteínas oxidadas en transferencias Western con
proteínas totales en geles ( Robinson et al., 1999 ). Por lo tanto, kits disponibles de diferentes
Las empresas se dividen entre los dos métodos (reacción DNPH antes de electro-
foresis versus después de la transferencia). Cada laboratorio necesita probar los dos enfoques
con sus proteínas particulares y habilidades técnicas para determinar qué método es
mejor para su aplicación.
Ventajas . El ensayo es muy sensible, detecta ≤ 1 pmol de proteína car-
bonylShacter et al., 1994a ), y determina qué proteínas individuales son
oxidadoFigura 1.14 ). La identificación de fracciones oxidadas proporciona importantes
datos complementarios para integrar con otros análisis de oxidación. En altamente
fracciones oxidadas, los anticuerpos a menudo detectan fracciones modificadas que están mal
detectado por tintes de electroforesis y escaneo. Con el uso de computadoras
escáneres de gel, los resultados se pueden obtener al menos semicuantitativos. Hay kits disponibles
de muchas fuentes comerciales.
Desventajas . Los Western blots requieren mucho tiempo y tienen un aprendizaje profundo.
curva de desarrollo para desarrollar la experiencia necesaria para obtener resultados reproducibles con
fondo bajo. Las condiciones experimentales deben optimizarse para cada tipo de
proteína, anticuerpo y diana de modificación. Sin un escáner, los resultados son solo
diagnóstico, pero incluso eso puede ser útil.
Aplicaciones . Las inmunotransferencias han tenido una serie de aplicaciones para detectar
proteínas oxidadas en los alimentos. En estudios de pescado congelado, ensayos espectrofotométricos
para la cuantificación se combinaron con inmunotransferencias para identificar clases de proteínas de pescado
afectado (Baron et al., 2007). Reacción de DNPH con PAGE e inmunotransferencia
demostró que en filetes de res en envasado en atmósfera modificada con alto contenido de oxígeno,
la degradación mórtem de la troponina-T y la desmina no se vieron afectadas, pero la miosina
La cadena pesada específicamente se volvió altamente oxidada y reticulada (Kim y col. ,
2010). Hemos utilizado inmunotransferencias para detectar la oxidación de proteínas en extruidos
proteínas, tortillas al horno y fritas (Dong, 2011) y maní envasado en laminado
manteca (Wan Ibadullah, 2013).
1.7.5.3.2 Carbonilos individuales

A medida que se acumulan pruebas que demuestran la presencia de carbonilos en
proteínas diferenciadas, el interés también se ha intensificado en ir más allá de las
Análisis de carbonilos de proteínas totales para determinar la oxidación de aminoácidos específicos.
ácidos. La lisina y la arginina son particularmente susceptibles a la oxidación por lípidos,
formando semialdehído α-aminoadípico (AAS) y semialdehído γ-glutámico
(GGS), respectivamente, y estos productos están demostrando ser útiles para la oxidación
marcadores en proteínas tanto fisiológicas como alimentarias. Los primeros ensayos para estas modificaciones
Los aminoácidos enriquecidos eran complicados y difíciles de manejar, y no eran susceptibles de
analizar muchas muestras. Recientemente, procedimientos más sencillos de detección y cuantificación
La titulación de estos dos carbonilos proteicos se ha desarrollado utilizando
aminación por ácido aminobenzoico, hidrólisis ácida para liberar los productos, luego
Página 111
COOH
COOH
COOH H2N
HN HN
O O HOOC NUEVA HAMPSHIRE
O
NUEVA HAMPSHIRE
AAS AAS-ABA
NH 2
HCl
HN HN H2N
O
ABA NUEVA HAMPSHIRE
NUEVA HAMPSHIRE
O O
GGS HOOC
COOH
GGS-ABA
COOH
FIGURA 1.15 Reacción del ácido aminobenzoico (ABA) para la detección de semialdehído α-aminoadípico
(AAS) y el semialdehído γ-glutámico (GGS).
análisis de HPLC de fase inversa de los productos (Figura 1.15 ) (Akagawa y col. ,
2006, 2009 ). Se están aplicando modificaciones de estos procedimientos para determinar
oxidación de proteínas en las carnes ( Estévez et al., 2009; Utrera et al., 2011; Utrer a
y Estévez, 2013 ).
En la reacción básica, las proteínas extraídas aisladas por diálisis o tricloro-
La precipitación con ácido acético se disuelve en ácido 2- ( N -morfolino) etanosulfónico
tampón, luego reaccionó con ácido aminobenzoico y cianoborohidruro de sodio en
la oscuridad. La proteína derivatizada se precipita en ácido tricloroacético (TCA),
centrifugado y lavado con TCA y luego con etanol. A continuación, se hidroliza el pellet.
en HCl 6 N, evaporado hasta sequedad al vacío, reconstituido en tampón y
analizado por HPLC con detección de fluorescencia a 283 nm de excitación y 350 nm
emisión. Los límites de detección más bajos son picomoles por mg de proteína.
En comparaciones de métodos para determinar la oxidación de proteínas en las carnes,
Determinación de teína carbonilo por DNPH-HPLC y fluorescencia de triptófano
Los ensayos se vieron afectados por la composición o la estructura de la matriz alimentaria, mientras que
semialdehído α-aminoadípico (AAS) y semialdehído γ-glutámico (GGS)
la detección fue independienteArmenteros et al., 2009), tal vez debido a la
procesamiento de proteínas cional que estaba involucrado. Por tanto, se propuso que estos
Los semialdehídos, particularmente GGS, podrían usarse como indicadores de oxidación de proteínas.
en productos cárnicos, reemplazando los números TBARS. Aplicación más extensa
de estos análisis debería comenzar a identificar qué proteínas son particularmente propensas
a la formación de AAS y GGS, y qué condiciones facilitan la oxidación.
1.7.5.4 Espectroscopía de infrarrojos

La Tabla 1.6 enumeró las frecuencias de IR de los principales productos de oxidación de lípidos y se incluyeron también
frecuencias clave para enlaces peptídicos, aminoácidos que probablemente se oxidarán y algunos
productos de oxidación de azufre y nitrógeno. Se incluyeron frecuencias de proteínas.
porque las muestras de alimentos intactos se analizan cada vez más a mediados del RI, especialmente
principalmente por reflectancia atenuada, por lo que los componentes tanto de lípidos como de proteínas
estará presente en los espectros. En el pasado, había tanta superposición de bandas
en las regiones amida y carbonilo que la información definitiva era difícil de
Página 112
obtener. Sin embargo, la quimiometría está cambiando drásticamente la escena, por lo que debería
ahora es posible distinguir la pérdida de frecuencias de grupos nativos, así como
aparición de productos de oxidación de lípidos y proteínas en la misma muestra
ple. Esto ofrece una técnica interesante para monitorear la oxidación de lípidos mientras
al mismo tiempo siguiendo sus huellas en co-oxidaciones. Los métodos ciertamente
merecen una aplicación más amplia tanto en el control de calidad como en la investigación.
1.8 RESUMEN Y CONCLUSIONES

No hace mucho tiempo, las opciones para el control de rutina de la oxidación de lípidos fueron
bastante limitado. Los CD y los hidroperóxidos se midieron en ensayos de tubo de ensayo y
El hexanal y otros volátiles fueron detectados por GC. Debido a que estos análisis limitados
Los ses por sí solos no presentan de manera completa o precisa el grado de oxidación de los lípidos,
Este capítulo ha abogado por un nuevo paradigma en el análisis de la oxidación de lípidos: uno
que monitorea múltiples productos lipídicos de vías alternativas, busca
cantidades valorativas y estequiométricas de productos en lugar de cambios relativos,
integra análisis químicos e instrumentales de extractos y alimentos intactos, y
mira más allá de la oxidación de lípidos solo para rastrear sus huellas en las co-oxidaciones de
otras moléculas. Los objetivos de co-oxidación cubiertos en este capítulo fueron proteínas.
El material del capítulo se organizó como un mini curso y se intentó incluir
detalles y consideraciones importantes que rara vez se encuentran en las revisiones generales. Un
El objetivo principal obvio era proporcionar guías para la elección y el manejo de los análisis.
Un objetivo menos obvio pero no menos importante fue también estimular a los estudiantes, técnicos,
investigadores y profesores para pensar críticamente sobre los métodos, para pagar de cerca
atención a todos los aspectos del entorno analítico, no solo a copiar procedimientos
a ciegas de una publicación y, en general, a "Piense en la química" en cada paso de cada
procedimiento. Aún queda mucho por aprender sobre los mecanismos por los cuales los lípidos
y las proteínas se oxidan y cómo sus oxidaciones afectan las propiedades y cualidades de los alimentos.
Con suerte, este capítulo estimulará un mayor interés en los desafíos analíticos de
oxidación de lípidos y proteínas y fomentará una investigación más detallada.
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Análisis de lípidos y proteínas

Estabilidad oxidativa y vida útil de alimentos que contienen aceites y grasas

1.1.1 Procesos fundamentales de oxidación de lípidos

Durante más de 70 años, la oxidación de lípidos se ha considerado una cadena de radicales

Análisis del capítulo de oxidación de lípidos y proteínas | 1 3

MECANISMO CLÁSICO DE REACCIÓN EN CADENA DE RADICALES LIBRES DE OXIDACIÓN DE LÍPIDOS

Iniciación (formación de radicales libres lipídicos ab initio)

Reacción en cadena de radicales libres establecida

Ramificación de cadenas de radicales libres (iniciación de nuevas cadenas)

Terminación (formación de productos no radicales)

i - iniciación; o-oxigenación; - Escisión de Oβ2 ; p-propagación; d-disociación; terminación en t;

formación de productos: primero CD, luego hidroperóxidos y productos secundarios

4 Estabilidad oxidativa y vida útil de alimentos que contienen aceites y grasas

oxidación de lípidos. Estas reacciones alternativas se combinaron con las tradicionales

LOO + o LOO - Epóxidos •

Análisis del capítulo de oxidación de lípidos y proteínas | 1 5

subestimar el grado de oxidación de los lípidos. Energías de activación de la alternativa

1.2.1 Lavado de cristalería

El lavado de cristalería puede parecer un procedimiento de laboratorio rutinario y mundano.

Análisis del capítulo de oxidación de lípidos y proteínas | 1 7

1.2.2.1 Selectividad y propiedades generales de los disolventes

8 Estabilidad oxidativa y vida útil de alimentos que contienen aceites y grasas

Análisis del capítulo de oxidación de lípidos y proteínas | 1 9

10 Estabilidad oxidativa y vida útil de alimentos que contienen aceites y grasas

Análisis del capítulo de oxidación de lípidos y proteínas | 1 11

El etanol generalmente se considera un solvente estable. Sin embargo, se oxida

1.2.2.3 Solubilidad en agua en solventes y viceversa

12 Estabilidad oxidativa y vida útil de alimentos que contienen aceites y grasas

TABLA 1.1 Solubilidades de agua en solvente y solvente en agua de orgánicos

Solubilidad en solvente H 2 O Solubilidad

n- octano 6,6 × 10 –7 0,0095

n- Hexano 0,00123 0.0111

1-octanol 0.0538 (-)

n-hexanol 0,706 7,42

1,2-dicloroetano 0,81 0,32

Cloroformo 0,815 0.0135

Diclorometano 1.3 0.093

Metil isobutil cetona 1,7 1,9

1,1-dicloroetano 5,03 0,187

Éter dietílico 6.04 1,47

n- Butanol 7,45 16,9

Metil t- butil éter 5.44 4.2

química y máxima reproducibilidad ( Burfield et al., 1977; DeLloyd, 2006 ;

1.2.3 Solubilidad de gas en disolventes

Análisis del capítulo de oxidación de lípidos y proteínas | 1 13

TABLA 1.2 Solubilidad de oxígeno, nitrógeno y argón en lípidos comunes

Solvente Oxígenoa Nitrógeno Argón

Iso-octano 26,81 14,13 c 29,2 días

Heptano 19,98 25,0 días

Hexano 19.60 14.0D 25,3 días

Ciclohexano 12.31 7.55 días 14,9 días

Tolueno 9.17 10,95D

Acetona 8,34 5,19 c

Butanol 8.03 4.52 c

Cloroformo 7.23 b 7,89 b 3,82B

Diclorometano 5,61 b 3,27 b 5.02B

Etanol 5,87 3,55 c

Metanol 4.15 2,75 c

Isopropanol 7.88 4.66

Aceite de oliva 0,51

14 Estabilidad oxidativa y vida útil de alimentos que contienen aceites y grasas

Análisis del capítulo de oxidación de lípidos y proteínas | 1 15