Manua de Laboratorio 2021 Ak

GUIA PARA LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO, TALLER O CÓDIGO DE DOCUMENTO:
DCIV-GUI-2019-V1-008
CAMPO.
DEPARTAMENTO: Ciencias de la Vida y la Agricultura CARRERA: ☐ Ing. Agropecuaria ☒ Ing. Biotecnología

PERÍODO Nov 2020 – III Malla
ASIGNATURA: Biología de los microorganismos. NIVEL:
LECTIVO: Marzo 2021 Rediseño
DOCENTE: Alma Koch Kaiser NRC: PRÁCTICA N°: 1
LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA Laboratorio multidisciplinario 04, docencia de Microbiología.

TEMA DE LA
CONTAMINACIÓN EN EL TRABAJO DE LABORATORIO: SIMULACIÓN DEL FENÓMENO.
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
En el laboratorio de microbiología, la contaminación se refiere a la existencia indeseada y desconocida de un agente microbiano
infeccioso o no infeccioso: (1) en la superficie de la persona o en su vestimenta, mandil, guantes, gafas y zapatos; así como en las
mesas, equipos, material de vidrio, lápices, cuadernos, mochilas, lentes y otros objetos inanimados, incluyendo agua y alimentos
que pueden causar daño a las personas o a productos y materiales; y, (2) en los cultivos microbianos, medios de cultivo y otros
insumos de laboratorio dando resultados dudosos y/o falsos en los análisis de laboratorio.
Para evitar y/o reducir la contaminación en el trabajo experimental, se debe utilizar la bioseguridad. La bioseguridad consiste en la
aplicación de conceptos teóricos, métodos de laboratorio e insumos necesarios con el fin de evitar la exposición física personal, del
área de laboratorio, cultivos microbianos y ambiente a agentes vivos con o sin capacidad infecciosa: bacterias, hongos, protozoos,
gusanos, productos recombinantes, alérgenos, priones, virus, entre otros; es un proceso que incluye los principios, técnicas y
prácticas de contención para evitar o reducir la posibilidad de exposición. Los agentes biológicos infecciosos constituyen un factor
de riesgo por su capacidad de producir enfermedades. La infección es la invasión y multiplicación de agentes biológicos patógenos
(que causan daño) en los tejidos de un organismo produciendo enfermedad. El riesgo microbiológico está presente en toda
actividad práctica en el laboratorio con el manejo de cultivos microbianos vivos. Son cuatro los factores determinantes de un
accidente (contaminación e infección) en el laboratorio con microorganismos vivos: un huésped susceptible, un agente infeccioso,
una concentración suficiente de microorganismo y una ruta de transmisión adecuada. Las vías de infección son la piel (intacta o
lesionada), la conjuntiva, la boca, la nariz, los ojos, los oídos, etc. Las vías de contaminación más usuales en el laboratorio son
comer, beber y fumar, pipetear con la boca, tocar, toser, estornudar, hablar y gritar, entre otros. La transferencia indirecta de
microorganismos ocurre a través de los dedos o utensilios contaminados (lápices, bolígrafos, etc.), la inoculación accidental con
una aguja hipodérmica u otros instrumentos punzantes o de vidrio, heridas; y, salpicaduras de materiales infecciosos y
microorganismos transportados por el aire (bioaerosoles). La contaminación directa se da de persona a persona.
OBJETIVOS:
Demostrar la posibilidad de contaminación con microorganismos en el trabajo de laboratorio.
MATERIALES:
REACTIVOS: Cajas Petri con agar nutriente estériles. INSUMOS: Aplicadores de algodón estériles, agua destilada estéril,
Cajas Petri con agar PDA estériles. chocolate en barra, parafilm, papel toalla, jabón, lápiz, mandil,
Savlon. guantes, marcador, tijeras, dos cajas Petri estériles.
EQUIPOS: Incubadora a 37ºC, Mecheros bunsen, Autoclave, Refrigeradora.
MUESTRA: Cultivo de Saccharomyces cerevisiae.
INSTRUCCIONES:
1. Lavarse las manos con agua y jabón.
2. Utilizar ropa de protección: mandil, guantes, gafas, cabello recogido, pantalones largos y zapatos cerrados.
3. Verificar la disponibilidad de los insumos, reactivos, muestras y equipos a usar en la práctica.
4. Desinfectar el área de trabajo y encender el mechero.
ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:
GRUPO 1 Ejercicio No. 1: Contaminación directa: persona a persona.
1. Encender el mechero y marcar seis cajas con agar nutriente (AN) en la base, en la superficie externa de vidrio, con el número 1 y
CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

CAMPO.
literales a, b, c, d, e y f. Además, poner su nombre, fecha y microorganismo de trabajo. Debe mantener cerradas las cajas Petri
para evitar su contaminación con el aire o sus manos.
2. A continuación, la primera persona del grupo debe tocar el chocolate en el sitio contaminado con levadura por su instructor. Con
los dedos contaminados, abrir brevemente la tapa, frotar toda la superficie del medio de cultivo de la primera caja de agar y taparla
enseguida. Inmediatamente, topar los dedos de la segunda persona del grupo. Rápidamente, la primera persona, lavarse las
manos con agua y jabón.
3. La segunda persona debe fregar toda la superficie de la segunda caja de agar con los dedos contaminados por la primera
persona. Inmediatamente, topar los dedos de la tercera persona del grupo. Rápidamente, lavarse las manos con agua y jabón.
4. Repetir el procedimiento hasta completar las seis cajas.
5. Sellar las cajas con plástico parafilm para impedir la contaminación por corriente de aire. Lavarse las manos con agua y jabón y
desinfectar la mesa de trabajo.
6. Incubar a 37ºC, por 24 h con el fin de permitir el crecimiento de las levaduras a temperatura óptima y tiempo requerido.
GRUPO 2 Ejercicio No. 2: Contaminación indirecta: utensilio/superficie inerte (fómite) a persona.
1. Encender el mechero y marcar seis cajas con agar nutriente (AN) en la base, en la superficie externa de vidrio, con el número 2
y literales a, b, c, d, e y f. Además, poner su nombre, fecha y microorganismo de trabajo.
2. La primera persona del grupo debe tocar con los dedos la parte del chocolate que fue contaminada con levadura por el
instructor. Inmediatamente, topar con los dedos contaminados una zona específica de la toalla de la segunda persona del grupo.
Rápidamente, lavarse las manos con agua y jabón.
3. La segunda persona del grupo debe coger la toalla en la zona contaminada y, de igual forma, frotar la superficie de la caja “a” y
coger el jabón de la tercera persona con la misma mano en un área predeterminada. Rápidamente, lavarse las manos con agua y
jabón.
4. La tercera persona debe manipular la zona contaminada del jabón, tocar la superficie de la caja “b” y con la misma mano, tocar
la mesa de trabajo en el lugar señalado. Rápidamente, lavarse las manos con agua y jabón.
5. La cuarta persona debe topar el lugar contaminado de la mesa, friccionar la superficie de la caja “c” y asir el lápiz de la quinta
persona. Rápidamente, lavarse las manos con agua y jabón.
6. La quinta persona debe coger el lápiz, tocar la superficie de la caja “d” y tocar, en el lugar señalado, el mandil de la sexta
persona. Rápidamente, lavarse las manos con agua y jabón.
7. La sexta persona debe tocar el mandil y sembrar la caja “e”. Rápidamente, lavarse las manos con agua y jabón.
8. Sellar las cajas con plástico parafilm. Lavarse las manos con agua y jabón y desinfectar la mesa de trabajo.
9. Incubar a 37ºC por 24 h.
GRUPO 1 Y GRUPO 2 Ejercicio No. 3: Contaminación ambiental.
1. Obtener una caja de agar papa dextrosa (PDA) y una de agar nutriente (AN) por grupo. Rotular la superficie externa de vidrio de
la base de la caja.
2. Destapar las cajas en un lugar del laboratorio y exponer el medio de cultivo al ambiente por 20 minutos.
3. Tapar las cajas y sellarla con parafilm.
4. Incubar a 37ºC por 24 h. Lavarse las manos con agua y jabón y desinfectar la mesa de trabajo.
Antes de salir del laboratorio, no se olvide de apagar el mechero y revisar que todo quede en orden y guardado.
RESULTADOS OBTENIDOS:
El agar sirve como medio de revelación de la contaminación. Encontrará crecimiento de la levadura en el agar después de haber
ejecutado tanto la contaminación directa entre las manos como la indirecta a través de objetos y luego del tiempo de incubación a
temperatura óptima. Anotar sus observaciones del crecimiento bacteriano en cada caja Petri y en conjunto, relacionándolos con el
procedimiento realizado, en su bitácora de laboratorio. Describir mediante párrafos. Si es necesario, hacer dibujos y tomar fotos. En
Resultados solamente van sus datos. Refiérase a los objetivos e hipótesis para elaborarlos en concordancia.
CONCLUSIONES:
Tanto la contaminación con microorganismos directa como la indirecta pueden ocurrir en el trabajo de laboratorio.
RECOMENDACIONES:
Seguir el procedimiento sin cambio alguno.
FIRMAS
F: …………………………………………. F:………………………………………… F: ……………………………………………
Nombre: Lic. Alma Koch Kaiser,Mgs. Nombre: Claudia Segovia, PhD. Nombre: Dra. Patricia Jiménez, PhD.
Docente Coordinadora de Área de Conocimiento Jefe de Laboratorios Multidisciplinarios

CAMPO.

PERÍODO Nov 2020 – Marzo III Malla
LECTIVO: 2021 Rediseño.
PRÁCTICA
DOCENTE: Alma Koch Kaiser NRC: 2
N°:
LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA
Laboratorio multidisciplinario 04, docencia de Microbiología.
PRÁCTICA
TEMA DE LA
FROTIS Y TINCIÓN SIMPLE DE LEVADURAS
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
Las levaduras son hongos unicelulares. Se reproducen asexualmente por gemación y la célula hija deja una cicatriz en el lugar de
separación de la madre. En cuanto a la reproducción sexual, las levaduras son hongos ascomicetos o basidiomicetos. Muchas se
presentan comúnmente en la forma imperfecta o asexual solamente. Al microscopio óptico, se ven células esféricas o alargadas
con yemas o gémulas. En el interior celular, se distinguen estructuras como núcleo y vacuolas. El núcleo se localiza siempre cerca
de la yema. El crecimiento macroscópico de levaduras sobre medio de cultivo sólido es muy parecido al de bacterias pero es más
cremoso y de color blanco, beige, amarillo y anaranjado; algunas son rosadas o rojas porque tienen carotenoides para protegerse
de los rayos uv del ambiente. Su manipulación mediante técnicas de laboratorio es similar a las bacterias. Las levaduras son
células eucariotas a diferencia de las bacterias procariotas. Algunas levaduras no se separan de la célula madre y forman un
pseudomicelio al permanecer unidas, la cadena se va alargando y se configura una pseudohifa o pseudofilamento. En ciertos
casos, si el cigoto hace mitosis, existen en el mismo ciclo, las fases vegetativas haploide y diploide de Saccharomyces. Las
levaduras son organismos aerobios y aunque muchas especies son fermentadoras, otras no lo son, como los géneros
Cryptococcus y Rhodotorula. El género Saccharomyces y unos pocos más, son fermentadores fuertes de los azúcares bajo
condiciones anaeróbicas. Dekkera, su anamorfo Brettanomyces, al igual que otras fermentan glucosa más rápidamente en
aerobiosis. Las levaduras oxidativas, como Pichia membranaefaciens, producen acetaldehído, ésteres y ácido acético que dañan
la calidad de los vinos. Unas son ubicuas y otras tienen un hábitat muy restringido. Las levaduras se encuentran en pocas
cantidades en hojas y flores, siendo los insectos un vector de su dispersión. El suelo y el agua son reservorios de ellas y su
presencia depende de la temperatura, pH, humedad y disponibilidad de azúcares simples.
OBJETIVOS:
1. Hacer frotis y tinción simple para observación microscópica.
2. Observar la morfología y estructura microscópica general de levaduras.
MATERIALES:
REACTIVOS: Set de tinción de núcleo de levaduras. Etanol INSUMOS: Portaobjetos, asas bacteriológicas, bandejas de tinción,
70 %. Aceite de inmersión. Azul de metileno de Loeffler. pinzas, jabón líquido, detergente y papel toalla.
EQUIPOS: Incubadora a 37ºC, mecheros Bunsen, autoclave, refrigeradora, microscopio óptico.
MUESTRA: Cultivo de Saccharomyces cerevisiae.
INSTRUCCIONES:
Frotis de levadura:
1. Lavar un portaobjeto con agua y jabón. Secarlo bien con papel toalla. Limpiarlo con etanol 70% con papel toalla.
2. Marcar la placa con sus iniciales, las del microorganismo y la fecha en el extremo izquierdo.
3. Colocar una gota de agua destilada pequeña en el centro del portaobjeto, si el cultivo es sólido; si es líquido, omitir el agua.
4. Encender el mechero. La llama debe ser azul y de tamaño mediano.
5. Con el asa bacteriológica, tomar una pequeña muestra del cultivo; si es sólido, mezclarla con una gota de agua previamente
depositada sobre el portaobjetos. Proceder a extenderla sobre toda la superficie disponible del portaobjeto logrando el frotis. Si
el cultivo es líquido, hacer el frotis directamente sobre la superficie de vidrio con la muestra tomada con el asa, sin agua.

Asa DCIV-GUI-2019-V1-008
CAMPO.
bacteriológica
Frotis
6. Secar el frotis al aire tomando la placa con el pulgar y el índice en un extremo y moviendo la mano horizontalmente. Debe
quedar totalmente seco. No pasar al portaobjeto por el fuego directo si ve gotas de agua porque se daña la preparación y
deberá repetirla.
7. Cuando esté del todo seca, fijar las células pasando brevemente el portaobjeto (con la muestra hacia arriba) cuatro o cinco
veces por la llama directamente. No debe calentarse demasiado. Esperar a que se enfríe.
8. El frotis está listo para ser teñido. Realizar la tinción como se indica a continuación.
Tinción simple de levaduras (células eucariotes):
1. Bañar, por un minuto, el portaobjeto con etanol 40% y enjuagar cuidadosamente agua de la llave o destilada.
2. Aplicar azul de metileno por un minuto. Enjuagar cuidadosamente con agua.
3. Cubrir la muestra con etanol 10%. Sacudir el exceso de alcohol y secar al aire.
4. Observar al microscopio en el objetivo 100X con aceite de inmersión, siguiendo el método de enfoque.

CAMPO.
1. Adición de Etanol
40%.
2. Adición de
Azul de metileno.
3. Adición de
Etanol 10%.
5. Al finalizar, lavar el portaobjeto con agua y jabón. Ponerle etanol 70% y secarlo con papel toalla. Guardarlo en la caja de
portaobjetos. Limpiar el lente de 100x con papel para lentes, dejar el lente de menor aumento en posición de enfoque y guardar el
microscopio.
En la observación microscópica, encontrará levaduras teñida de azul y/o celeste. Buscar núcleos como puntos teñidos de azul más
oscuro. Identificar vacuolas a manera de espacios transparentes dentro de la célula. Observar células en gemación. Anotar sus
observaciones relacionando con el procedimiento realizado, en su bitácora de laboratorio. Describir mediante párrafos. Si es
necesario, hacer dibujos y tomar fotos. En Resultados solamente van sus datos analizados. Refiérase a los objetivos e hipótesis
para elaborarlos en concordancia.
CONCLUSIONES:
Las levaduras muestran estructura eucariota al presentar núcleo. Se observa también la presencia de vacuolas y gémulas así como
forma y tamaño.
RECOMENDACIONES:
FIRMAS
F:………………………………………. F: …………………………………………. F:………………………………………………:

Nombre: Lic. Alma Koch Kaiser, Mgs. Nombre: Claudia Segovia, PhD. Nombre: Dra. Patricia Jiménez, PhD.

CAMPO.

LECTIVO: 2021 Rediseño
PRÁCTICA
DOCENTE: Alma Koch Kaiser NRC: 3
N°:
Laboratorio Multidisciplinario 04, docencia de Microbiología.
PRÁCTICA
TEMA DE LA
FROTIS Y TINCIÓN SIMPLE DE BACTERIAS
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
Para teñir bacterias, primero debe realizarse un frotis o dispersión de una pequeña cantidad de muestra sobre la superficie de un
portaobjeto limpio, tratando de cubrir toda el área disponible, para formar una capa delgada de células separadas distinguibles
individualmente al microscopio óptico. La capa delgada resultante es secada al aire. A continuación, se la fija a la llama pasándola
rápidamente tres o cuatro veces por el fuego. Este último procedimiento no solo mata a las bacterias, sino que coagula las
sustancias proteicas de las células, pegándolas al vidrio. La preparación queda, entonces, lista para la aplicación de la tinción.
Mediante tinción y contraste se hace fácil la observación, diferenciación y estudio de las células. Los colorantes son compuestos
orgánicos derivados de las anilinas. Pueden estar cargados positivamente (cationes), por ejemplo azul de metileno, cristal violeta y
safranina, que se combinan con los componentes celulares cargados negativamente, tales como polisacáridos ácidos y ácidos
nucleicos. Otros están cargados negativamente (aniones) y se pegan a constituyentes celulares cargados positivamente como
proteínas, son la eosina, fucsina ácida y rojo Congo. Existen, además, tintes lipofílicos que se combinan con grasas en las células,
como el Negro Sudán. En la tinción simple se aplica un tinte por una sola vez y sirve para estudiar morfología así como agrupación
de las bacterias.
OBJETIVOS:
1. Realizar frotis bacterianos y tinciones simples.
2. Mediante tinciones simples, observar bacterias al microscopio óptico para estudiar su morfología y agrupación.
MATERIALES:
REACTIVOS: Set de tinción simple, etanol 70 %, aceite de INSUMOS: Portaobjetos, asas bacteriológicas, bandejas de tinción,
inmersión. pinzas, jabón líquido, detergente, papel toalla.
EQUIPOS: Incubadora a 37ºC, mecheros bunsen, autoclave, refrigeradora, microscopio óptico.
MUESTRA: Cultivos de Bacillus subtilis, Escherichia coli y Staphylococcus epidermidis.
INSTRUCCIONES:
Frotis bacteriano:
1. Lavar un portaobjeto con agua y jabón. Secar bien con papel toalla. Limpiarlo con etanol 70% con otro papel toalla.
2. Marcar la placa con sus iniciales, las del microorganismo y la fecha en el extremo izquierdo.
3. Colocar una gota de agua destilada pequeña en el centro del portaobjeto si el cultivo es sólido. Si es líquido, omitir el agua.
4. Encender el mechero. La llama debe ser azul y de tamaño mediano.
5. Con el asa, tomar una pequeña muestra del cultivo bacteriano y si el cultivo es sólido, mezclarla con la gota de agua. Si es
líquido, tomar directamente la muestra líquida con el asa y realizar el frotis sobre el portaobjeto.

CAMPO.
6. Proceder a extenderla sobre toda la superficie disponible del portaobjeto logrando el frotis. Si el cultivo es líquido, hacer el
frotis directamente sobre la superficie de vidrio con la muestra tomada con el asa, sin agua.
7. Secar el frotis al aire tomando la placa con el pulgar y el índice en un extremo y moviendo la mano horizontalmente. Debe
quedar totalmente seco. No pasar al portaobjeto por el fuego directo si ve gotas de agua porque se daña la preparación y
deberá repetirla.
8. Cuando esté del todo seca, fijar las células pasando brevemente el portaobjeto (con la muestra hacia arriba) cuatro o cinco
veces por la llama directamente. No debe calentarse demasiado. Esperar a que se enfríe.
9. El frotis está listo para ser teñido. Realizar la tinción como se indica a continuación.
Tinción Simple:
1. Cubrir completamente el frotis con uno de los colorantes y esperar un minuto (por reloj). Lavar suavemente con agua de la
llave o destilada. No aplicar presión de agua porque las células se caerían.
2. Secar con papel toalla apretando cuidadosamente sobre el portaobjeto. No lo haga por arrastre porque se perdería toda la
muestra. Descartar el papel en el lugar apropiado.
3. Observar al microscopio óptico. No se olvide de seguir el método de enfoque, es decir, comience con el lente de menor aumento
y, paulatinamente, llegue al lente de inmersión con aceite (100X), aprovechando los enfoques previos. Centrar la muestra en el

CAMPO.
campo óptico al utilizar cada objetivo. Buscar un área de la placa en donde vea células individuales para poder distinguir forma y
agrupación.
4. Al finalizar, lavar el portaobjeto con agua y jabón. Ponerle etanol 70% y secarlo con papel toalla. Guardarlo en la caja de
portaobjetos. Limpiar el lente de 100x con papel para lentes, dejar el lente de menor aumento en posición de enfoque y guardar el
microscopio.
Observará células bacterianas individuales agrupadas o sueltas del color del tinte utilizado. Pueden ser bacilos de forma alargada o
cocos redondos. La agrupación puede ser estafilococo (cocos agrupados en forma de racimo de uvas). Anotar sus observaciones
relacionándolas con el procedimiento realizado en su bitácora de laboratorio. Describir mediante párrafos. Si es necesario, hacer
dibujos y tomar fotos. En Resultados solamente van sus datos y el análisis respectivo. Refiérase a los objetivos e hipótesis para
elaborarlos en concordancia.
CONCLUSIONES:
En el frotis bacteriano se separan las células bacterianas para poder observarlas individualmente. En la tinción simple se aplica un
tinte por una sola vez y sirve para estudiar morfología así como agrupación de las bacterias. Bacillus subtilis son bacilos aislados o
en cadena. Escherichia coli son bacilos aislados o en cadena. Staphylococcus epidermidis son cocos agrupados en racimo o
estafilococos.
RECOMENDACIONES:
FIRMAS
F: …………………………………………. F:……………………………………………. F:…………………………………………………

Nombre: Lic. Alma Koch Kaiser, Mgs. Nombre: Ing. Claudia Segovia, PhD. Nombre: Dra. Patricia Jiménez, PhD.
Docente Coordinador de Área de Conocimiento Jefe de Laboratorios Multidisciplinarios

CAMPO.

LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA Laboratorio Interdisciplinario 04, docencia de Microbiología.

TEMA DE LA
TINCIÓN GRAM
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
Tinción Gram es la tinción diferencial bacteriológica más usada. Se llama así en honor a su inventor, el Dr. Cristian Gram (1884).
Se compone de cuatro reactivos diferentes y se requiere algo de práctica para que funcione. El violeta de genciana es,
generalmente, el colorante primario, de color morado. El propósito de este primer paso es impartir color a todas las bacterias en el
frotis. El segundo reactivo de la serie es una solución diluida de yodo (yodo Gram o lugol), que actúa como mordente (aumenta o
refuerza la unión entre el colorante primario y su sustrato). El tercer reactivo se conoce como decolorante porque disuelve y
arrastra fuera de algunas células al colorante primario, se emplea una mezcla de acetona y etanol (95%), en proporciones 30% y
70%, respectivamente. El cuarto reactivo es el colorante de contraste, la safranina, de color rojo. Aquellos organismos desteñidos
por acción del decolorante se tornan invisibles, haciéndose necesario aplicar un tinte de diferente color para observarlos. Así, se
designa Gram negativo a cualquier bacteria que tome la coloración roja del colorante de contraste, es decir, de la safranina. Las
bacterias Gram positivas han reaccionado completamente con el violeta de genciana sin ser decoloradas y, por lo tanto, no pueden
ser teñidas por la safranina, permaneciendo de un color azul o violeta.
La tinción Gram constituye el punto inicial del proceso de caracterización bacteriana. Es una herramienta de gran valor taxonómico.
Al aplicarla, se divide a las bacterias en cuatro categorías bien definidas, tomando en cuenta también la morfología: cocos Gram
positivos, cocos Gram negativos, bacilos Gram positivos y bacilos Gram negativos. Además de formas como vibrios (coma) y
espiroquetas y espirilos (espirales).También se observa la agrupación, aumentando la información sobre las bacterias teñidas:
estafilococos (racimo), micrococos (grupos), estreptococos (cadenas de más de seis cocos), diplococos (dedos en dos),
monococos (cocos aislados) y estreptobacilos (cadenas), entre otros.
No se conoce a ciencia cierta el mecanismo regulador del comportamiento diferencial. Una de las posibles explicaciones postula
que la pared celular de las células Gram positivas es más sensible a la deshidratación con alcohol, el mismo que actúa cerrando
los poros de la pared celular. En estas condiciones, el complejo yodo-violeta de genciana no puede escapar hacia el exterior de la
célula resultando la retención del colorante primario. La pared celular de organismos Gram negativos es más rica en lípidos que la
de los Gram positivos y, aparentemente, no cierra sus poros durante el tratamiento con alcohol, por lo cual el decolorante arrastra
todo el colorante primario. Por lo tanto, al aplicar la tinción Gram a una mezcla de varios tipos de bacterias, algunos organismos
aparecen azules y otros rojos al microscopio 100X. Es preciso añadir que la coloración Gram de muchas especies es variable.
Además, no todas las bacterias Gram positivas retienen el colorante primario con la misma intensidad, por lo cual pueden aparecer
desde violetas intensas hasta celestes.
Es conveniente mencionar algunos riesgos posibles en la ejecución de Gram:
 La edad de los cultivos determina los resultados finales de la tinción. Únicamente se obtienen resultados confiables cuando se
utilizan cultivos jóvenes o de menos de 24 horas de incubación y frescos (no guardados).
 La decoloración es el paso crítico de la tinción; si se destiñe en exceso se corre el riesgo de debilitar las paredes y que no
respondan como deben hacerlo.
 Por otro lado, si se despinta muy poco, incluso las células Gram negativas retendrán el colorante primario y aparecerán como
Gram positivas.
 También se debe hacer el frotis con una cantidad moderada de bacterias; si se toma mucha muestra se verá una mancha
oscura en donde no se distinguirán células individuales.
OBJETIVOS:
1. Realizar tinción Gram.
2. Diferenciar grupos bacterianos de acuerdo a sus reacciones de tinción Gram, forma y agrupación.
MATERIALES:
REACTIVOS: Set de tinción Gram, etanol 70 %, aceite de INSUMOS: Portaobjetos, asas bacteriológicas, bandejas de tinción,
inmersión. pinzas, jabón líquido, detergente, papel toalla.
EQUIPOS: Incubadora a 37ºC, mecheros bunsen, autoclave, refrigeradora, microscopio óptico.

CAMPO.
MUESTRA: Cultivos de Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, Escherichia coli y Staphylococcus epidermidis.
INSTRUCCIONES:
4. Desinfectar el área de trabajo y encender el mechero
1. Prender el mechero y preparar frotis individuales de los cultivos bacterianos y la levadura proporcionados.
2. Cuando estén listos, teñir como sigue:
a) Cubrir completamente el frotis con violeta de genciana y esperar un minuto (por reloj). No dejar secar ni poner muy poco
colorante. Lavar cuidadosamente con agua corriente.
b) Cubrir el frotis con yodo Gram o lugol por un minuto. Lavar cuidadosamente con agua corriente.
c) En el portaobjeto inclinado, decolorar el frotis gota a gota con alcohol acetona o solución decolorante hasta que salga
transparente. Aproximadamente usar 10-15 gotas. Asegurarse de cubrir todo el frotis, de otra manera, quedarían espacios con
bacterias sin decolorar y producirían resultados falsos. Lavar con agua cuidadosamente.

CAMPO.
d) Cubrir con safranina por un minuto (por reloj). Enjuagar cuidadosamente con agua corriente o destilada. Secar por presión con
un pedazo de papel filtro o esperar a que se seque.
Gram positivas (violetas)

Gram negativas (rosadas)
e) Observar al microscopio con aceite de inmersión. Localizar áreas en donde las células estén separadas. Las bacterias Gram
positivas aparecerán azules, violetas o celestes; y las Gram negativas, rojas, rosadas o naranjas. Distinga forma y agrupación.
Observará células bacterianas individuales agrupadas o sueltas de color azul si son Gram positivas y rojo, si son Gram negativas.
Pueden ser bacilos de forma alargada o cocos redondos. La agrupación puede ser estafilococo (cocos agrupados en forma de
racimo de uvas). La levadura es Gram positiva. Anotar sus observaciones relacionándolas con el procedimiento realizado en su
bitácora de laboratorio. Describir mediante párrafos. Si es necesario, hacer dibujos y tomar fotos. En Resultados solamente van sus
datos analizados. Refiérase a los objetivos e hipótesis para elaborarlos en concordancia.
CONCLUSIONES:
Bacillus subtilis son bacilos Gram positivos. Escherichia coli son bacilos Gram negativos. Staphylococcus epidermidis son
estafilococos Gram positivos. Las levaduras se tiñen como Gram positivas.
RECOMENDACIONES:
FIRMAS
F: …………………………………………. F: …………………………………………. F:……………………………………………


CAMPO.


TEMA DE LA
TINCIÓN DE ESPORAS Y CÁPSULAS BACTERIANAS
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
Endosporas Bacterianas Una táctica extrema de supervivencia, principalmente en respuesta a la disminución de nutrientes, es la
formación de endosporas por algunas bacterias, mediante un ciclo de esporulación mediante cambios físicos y químicos. Las
esporas bacterianas son células especializadas, no reproductivas, inactivas metabólicamente, altamente deshidratadas y muy
resistentes a condiciones ambientales desfavorables. Su objetivo es conservar el material genético íntegro bajo situaciones de
intenso estrés como temperatura alta, alta irradiación UV, desecación, daño químico y destrucción enzimática. También resisten a
antimicrobianos. El 15% de la endospora está compuesto de calcio que estabiliza el DNA, le confiere tolerancia a la sal y a los
agentes oxidantes. Además contiene ácido dipicolínico que las hace impermeables al agua. Esta resistencia impide teñirlas porque
los colorantes no pueden penetrar la estructura; es por eso necesario un agente mordente para su captación, como por ejemplo, el
calor. Los géneros bacterianos productores de endosporas son Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Soporolactobacillus,
Desulfotomaculum, Sporomusa, Sporohalobacter, Anaerobacter, Heliobacterium, Heliophilum y Syntrophospora. Una vez
restablecidas las condiciones favorables, las endosporas ingresan en un proceso de germinación para formar una célula vegetativa
nueva.
Cápsulas bacterianas: La cápsula bacteriana es una capa mucoide extracelular en determinadas bacterias, cuyo tamaño depende
del sustrato de crecimiento, y puede ser sólo una fracción del diámetro celular o más. Constituye también reserva de alimento para
la bacteria así como obstaculiza la fijación de bacteriófagos y su ingreso a la misma; además, ayudan a las bacterias a fijarse a
superficies sólidas en el ambiente y a la formación de biopelículas. Por otro lado, protegen a la célula de la deshidratación.
Algunos ejemplos de bacterias productoras de cápsulas son: neumococos: Streptococcus pneumoniae y Klebsiella, aunque puede
estar presente en otras bacterias Gram positivas y Gram negativas. La cápsula de los neumococos tiene propiedades
antifagocíticas, es decir, dificulta o impide la fagocitosis de la bacteria, incrementando su virulencia ya que favorecen su
multiplicación y facilitan la invasión al organismo hospedador, aumentando la capacidad infectiva. Además inducen
la producción de anticuerpos en los organismos superiores. Para fines taxonómicos, permiten la diferenciación de tipos bacterianos
serológicos dentro de la misma especie por aglutinación con sueros específicos.
OBJETIVOS:
1. Hacer tinciones de Scaeffer – Fulton y negativa.
2. Observar endosporas y cápsulas bacterianas.
MATERIALES:
REACTIVOS: Set de tinción de endosporas (verde malaquita
INSUMOS: Portaobjetos, asas bacteriológicas, bandejas de tinción,
y safranina). Set de tinción de cápsulas (nigrosina,
pinzas, jabón líquido, detergente, papel toalla y trípodes con mallas.
safranina).Etanol 70 % y aceite de inmersión.
EQUIPOS: Incubadora a 37ºC, mecheros bunsen, autoclave, refrigeradora, plancha caliente y microscopio óptico.
MUESTRA: Cultivos viejos (48 h o más) de Bacillus subtilis. Cultivos de 24 h de Escherichia coli y Klebsiella.
INSTRUCCIONES:
Endosporas:
1. Preparar un frotis del cultivo bacteriano.
2. Colocar un pedazo de papel filtro (del tamaño del portaobjeto) sobre el frotis y aplicar en frío el colorante verde malaquita
hasta impregnar bien el papel (el papel impide que el colorante salpique).

CAMPO.
3. Coger el portaobjetos con la pinza y, mediante pases cortos sobre el mechero Bunsen, calentar la preparación durante
cinco minutos sin permitir que hierva la muestra; deben salir vapores. Puede hacerlo sobre la malla de un trípode encima
del mechero o en plancha caliente. Añadir constantemente colorante para mantener húmeda a la preparación, porque de
lo contrario, se daña. Luego de los cinco minutos, retirar del fuego y esperar a que se enfríe. Sacar con cuidado el papel
filtro y lavarla con abundante agua para eliminar el exceso de colorante.
4. Teñir con safranina durante un minuto.
5. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. Secar a presión la preparación entre dos papeles de filtro con cuidado
de no frotar. Observar al microscopio, con el lente de inmersión (100X).
Frotis
fijado
Safranina: 1 minuto,
enjuagar y secar.
Verde malaquita: 5 minutos al fuego
Mantener húmedo. Enjuagar.
Esporas: verdes
Bacilos: rojos
Cápsulas:
1. Lavar dos portaobjetos con agua, jabón y etanol 70%. Secarlos bien con papel toalla.
2. Tomar una gota de cada caldo proporcionado y ponerla en el portaobjetos correspondiente.
3. Colocar una gota de tinta china o nigrosina sobre la gota de cultivo y mezclar bien.
4. Con un cubreobjetos, hacer una extensión de esta mezcla sobre el portaobjetos.
5. Dejar secar al ambiente y aplicar calor por tres segundos.
6. Aplicar safranina o fucsina por un minuto sobre la tinta china o nigrosina seca.
7. Observar al microscopio con aceite de inmersión.

CAMPO.
Hacer la extensión con un

Mezclar la muestra
cubreobjetos.
bacteriana con la
nigrosina en el
Calentar 3 s
Teñir con safranina o Observar al microscopio

fucsina por 1 min 100X
Observará células bacterianas individuales agrupadas o sueltas de color rojo con endosporas en su interior de color verde o
endosporas verdes sueltas para la preparación del cultivo de Bacillus subtilis. En el cultivo de Escherichia coli no observará
endosporas. La tinción de cápsula mostrará un fondo negro sobre el que se distinguirán las cápsulas transparentes alrededor de
los bacilos de Klebsiella. Anotar sus observaciones relacionándolas con el procedimiento realizado en su bitácora de laboratorio.
Describir mediante párrafos. Si es necesario, hacer dibujos y tomar fotos. En Resultados solamente van sus datos analizados.
Refiérase a los objetivos e hipótesis para elaborarlos en concordancia.
CONCLUSIONES:
Bacillus subtilis son bacilos esporulados. Escherichia coli son bacilos no esporulados. Klebsiella pneumoniae presenta cápsula.
RECOMENDACIONES:
F:………………………………………. F:………………………………………. F:………………………………………………


CAMPO.


TEMA DE LA
TINCIÓN ÁCIDO - RESISTENTE O ZIEHL - NEELSEN
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
La tinción ácido–resistente o de Ziehl-Neelsen es una técnica diferencial rápida y económica, que identifica bacterias ácido-alcohol
resistentes (BAAR), como Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Nocardia o el género Apicomplexa (coccidios
intestinales), entre otros. Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (bacteriólogo) y Friedrich Neelsen
(patólogo). Las paredes celulares de algunas bacterias contienen ácidos grasos cerosos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 -
90 carbonos) responsables de la resistencia a la decoloración con alcohol-ácido, luego de la aplicación de tintes básicos. La
coloración clásica de Ziehl-Neelsen se realiza con calor para que el colorante atraviese la pared al disolver las ceras. Al enfriar con
agua, se vuelven a solidificar los ácidos grasos y el colorante no puede salir de las bacterias. El calentamiento también incrementa
la energía cinética de las moléculas del tinte facilitando su entrada.
Los microrganismos ácido-resistentes se vuelven de un color rojo brillante y los ácido-sensibles se ven azules porque el colorante
de contraste es el azul de metileno. Se diferencian dos grupos bacterianos, aquellos que resisten la decoloración por el ácido-
alcohol y los que se decoloran. La tinción tiene importancia clínica porque Mycobacterium tuberculosis o Mycobacterium leprae
(tuberculosis y lepra) son identificadas directamente en los muestras de los tejidos afectados y solamente pueden ser teñidas para
diagnóstico mediante ella. Hay tres tinciones principales que se utilizan con éxito con los organismos ácido - resistentes: Ziehl-
Neelsen, Kinyoun y fluorescencia (auramina-rodamina).
OBJETIVOS:
1. Realizar la tinción ácido resistente
2. Observar bacterias ácido-sensibles.
MATERIALES:
REACTIVOS: Set de tinción ácido-resistente (fucsina, INSUMOS: Portaobjetos, asas bacteriológicas, bandejas de tinción,
alcohol ácido, azul de metileno). Etanol 70 %. Aceite de pinzas, jabón líquido, detergente, papel toalla y vasos de
inmersión. precipitación de 50 mL y 100 mL.
EQUIPOS: Incubadora a 37ºC, mecheros bunsen, autoclave, plancha caliente con agitación, refrigeradora y microscopio óptico.
MUESTRA: Cultivos de Bacillus subtilis.
INSTRUCCIONES:

CAMPO.
4. Desinfectar el área de trabajo y encender el mechero

1. Preparar frotis del cultivo bacteriano.
2. Cubrir el frotis con carbolfucsina (tinción primaria) y ponerlo encima de un vaso de precipitación con agua hirviendo
durante 3 a 5 min para calentarlo con el vapor. Añadir más colorante si es necesario.
3. Enjuagar con agua fría y eliminar el colorante restante.
4. Decolorar el frotis mediante alcohol ácido por 15 a 20 s.
5. Enjuagar con agua de inmediato para detener la decoloración.
6. Aplicar azul de metileno cubriendo el frotis por 1 min (tinción de contraste).
Observará células bacterianas individuales agrupadas o sueltas de color fucsia o rojo si son ácido - resistentes o de color azul si
son ácido -sensibles. Anotar sus observaciones relacionándolas con el procedimiento realizado en su bitácora de laboratorio.
Describir mediante párrafos. Si es necesario, hacer dibujos y tomar fotos. En Resultados solamente van sus datos analizados.
Refiérase a los objetivos e hipótesis para elaborarlos en concordancia.
CONCLUSIONES:
Bacillus subtilis son bacilos ácido – sensibles.
RECOMENDACIONES:
FIRMAS
F:
……………………………………………. F:……………………………………….. F: ………………………………………………

CAMPO.

LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA Laboratorio Multidisciplinario 04, docencia de Microbiología.

TEMA DE LA
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
Como todas las otras formas vivientes, las bacterias requieren nutrientes, agua y un ambiente favorable para desarrollarse. Estas
condiciones deben ser proporcionadas en el laboratorio mediante la elaboración de ambientes artificiales similares a los naturales.
Gran parte de los estudios en microbiología depende de la capacidad de cultivar y mantener microorganismos en el laboratorio y
solo es posible si se dispone de medios de cultivos apropiados. El medio de cultivo es el aporte de nutrientes indispensable para el
crecimiento de los microorganismos. Su composición precisa dependerá del microorganismo a cultivar, porque las necesidades
nutricionales varían ampliamente. Hay microorganismos poco exigentes que se desarrollan bien en medios simples y aquellos
exigentes que requieren sustancias específicas, como sangre o vitaminas, entre otros. Las necesidades básicas de los
microorganismos son sustancias alimenticias como proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos y condiciones fisicoquímicas
como pH, presión osmótica, temperatura, radiación solar y humedad específicos, así como presencia o ausencia de oxígeno.
Esencialmente, los medios de cultivos son de tres tipos: líquidos, sólidos y semisólidos. A los líquidos se los usa en tubos de
ensayo, se los conoce como caldos de cultivo y están compuestos de agua, azúcares y proteínas, principalmente. Los medios
sólidos son utilizados en caja Petri o tubos de ensayo en forma inclinada y están constituidos por caldo de cultivo al cual se le
añade agar-agar, sustancia solidificante, obtenido a partir de algas marinas. El agar químicamente está constituido por galactán,
polímero de galactosa, y no puede ser digerido por las bacterias, salvo excepciones puntuales. El agar cambia a estado líquido a
una temperatura entre 92ºC y 100ºC y se solidifica entre 42ºC y 47ºC. Los medios semisólidos contienen mayor cantidad de agua
y menor de agar-agar. Los medios sólidos se usan para el crecimiento masivo en tubo en la realización de cultivos puros y para el
aislamiento de colonias en caja Petri. Los medios líquidos permiten tener crecimiento rápido y masivo. Los medios semisólidos se
usan para investigar la motilidad bacteriana y la condición anaerobia o aerobia de crecimiento, entre otros. Los medios de cultivo de
los cuales se conocen todos los componentes se denominan medios sintéticos o medios definidos. Se emplean frecuentemente en
investigación, pues a menudo se quiere conocer qué está metabolizando el microorganismo. Los medios con algunos ingredientes
cuya composición química exacta y cantidad se desconocen, se denominan medios complejos, tienen componentes como
peptonas, extractos de carne y extracto de levadura que proveen de fuente de carbono, energía, nitrógeno y factores de
crecimiento. Satisfacen las necesidades nutricionales de diversos microorganismos y se pueden utilizar cuando se desconocen las
necesidades en particular. Los medios enriquecidos contienen sustancias como colorantes, sangre, carbohidratos, aminoácidos,
sales, antibióticos y muchas más que facilitan el desarrollo de microorganismos determinados sobre otros en el mismo cultivo. Los
medios selectivos favorecen el crecimiento de microorganismos particulares inhibiendo a otros; mientras que los medios
diferenciales permiten distinguir grupos distintos de bacterias, por ejemplo, por su color diferente en el mismo medio e, incluso,
habilitan la identificación tentativa por las características observadas. En la preparación de medios de cultivo, se debe trabajar en
condiciones controladas, para lo que se han desarrollado varios procedimientos como la esterilización en autoclave, que destruye
todas las formas de vida presentes, incluyendo esporas y virus. Todo objeto esterilizado está libre completamente de
microorganismos vivos, capaces de reproducirse o latentes. Las endosporas pueden ser destruidas únicamente a temperaturas
mayores a 100ºC, aplicadas bajo condiciones de vapor de agua a alta presión en equipo especializado llamado autoclave. La
autoclave es utilizada para esterilizar los medios de cultivo para microorganismos, soluciones, cristalería de laboratorio,
instrumental quirúrgico, material clínico, cultivos microbianos para desechar y, en general, material contaminado. El autoclave
funciona a 121ºC y 15 lb (1.2 atm) de presión durante 15 a 30 minutos de exposición. Existen sustancias que se degradan a las
condiciones de la autoclave, por ejemplo, antibióticos y vitaminas, que deben ser filtradas en membranas para su esterilización y
posterior adición a los medios.
OBJETIVOS:
1. Aprender técnicas básicas y fundamentales en la preparación de cultivos en el laboratorio microbiológico.
MATERIALES:
REACTIVOS: Extracto de carne, Peptona, Agar, Extracto de INSUMOS: Frascos con tapa azul de 500 mL, vasos de

CAMPO.
levadura, Glucosa, Agar nutriente comercial, SIM comercial, precipitación, papel para pesar, espátulas, agua destilada,
Caldo nutriente comercial, TSA comercial, PDA comercial y agitadores magnéticos, probetas, tubos de ensayo limpios, cajas
BHIA comercial. Petri limpias, gradillas y tubos de ensayo limpios con tapa.
EQUIPOS: Mecheros bunsen, Autoclave, Plancha caliente con agitación, Estufa 180ºC, Refrigeradora. Phmetro. Balanza.
MUESTRA: Ninguna.
INSTRUCCIONES:
Preparación de medios de cultivo comerciales.
1. Obtener el envase con el medio de cultivo sintético comercial correspondiente. Leer toda la información de la etiqueta.
2. Preparar 10 cajas de Agar Nutriente (AN), 10 de agar papa dextrosa (PDA) y 10 de agar BHIA siguiendo las instrucciones de
los recipientes comerciales de los medios. Para cada caja Petri necesitará aproximadamente 30 mL de medio de cultivo. Debe
autoclavar primero el medio en el matraz con el volumen total para luego del proceso de esterilización, dispensarlo en las cajas
Petri previamente esterilizadas, al lado del mechero o en una cámara de flujo laminar. Proceder con el control de calidad
dejándolas al ambiente por 24 horas antes de utilizarlas. Instrucciones:
Leer indicaciones Pesar Volumen de agua
Poner medio pesado en frasco. Mezclar con agua. Debe quedar por la mitad del volumen del frasco.
Calentar Marcar y poner cinta autoclave. Empacar y esterilizar cajas Petri. Esterilizar el medio hecho.
Dispensar en caja Petri. Control de calidad: 24 h al ambiente.

CAMPO.
Dos formas de destapar las cajas Petri al lado del mechero.
3. Prepare 10 tubos de Caldo nutriente, 10 de TSA inclinado y 10 de medio SIM, siguiendo las instrucciones de los recipientes
comerciales. Para cada tubo necesitará aproximadamente 4 mL de medio de cultivo (depende del tamaño de los tubos de ensayo).
Dispensar los medios de cultivo en los tubos antes de llevarlos a la autoclave. Dejar las tapas a medio cerrar y esterilizarlos. Los
tubos deberán dejarse enfriar en forma de pico de flauta o agar inclinado para agar nutriente y en forma vertical para SIM y caldo
nutriente. Proceder con el control de calidad dejándolos al ambiente por 24 horas antes de utilizarlos.
Dispensar el medio en tubos y autoclavar con las tapas flojas,
Dejar verticalmente para enfriar (caldo o semisólido) Inclinar para solidificar (inclinado o pico de flauta)
A TENER EN CUENTA:
Dispensar el medio de cultivo en caja

después de autoclavarlo.
Dispensar el medio de cultivo en

tubos antes de autoclavarlo.

CAMPO.
Preparador de medios de cultivo automático.
Obtendrá medios de cultivo estériles listos para la siembra de bacterias. Después del control de calidad, si observa crecimiento
bacteriano espontáneo en los medios, hay que desecharlos porque están contaminados y no pueden ser utilizados. Proceder a
autoclavarlos antes de empacarlos en la basura roja para su gestión. Anotar sus observaciones relacionándolas con el
procedimiento realizado en su bitácora de laboratorio. Describir mediante párrafos. Si es necesario, hacer dibujos y tomar fotos. En
Resultados solamente van sus datos analizados. Refiérase a los objetivos e hipótesis para elaborarlos en concordancia.
CONCLUSIONES:
Se tienen medios de cultivo en caja Petri y tubo de ensayo (inclinado, semisólido y caldo) listos para la siembra bacteriana.
RECOMENDACIONES:
FIRMAS
F: F: F:
……………………………………………. ………………………………………………. ……………………………………………………

CAMPO.
DEPARTAMENTO: Ciencias de la Vida y la Agricultura

CARRERA:
☐ Ing. Agropecuaria ☒ Ing. Biotecnología
PERÍODO Nov 2020 - Marzo III Malla


TEMA DE LA
SIEMBRAS MICROBIANAS
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
Para estudiar microorganismos, se requiere de una serie de instrumentos básicos de laboratorio y la aplicación de técnicas
específicas. Los microorganismos deben ser transferidos de un recipiente (caja Petri, tubo de ensayo, etc.) a otro, de un cultivo
madre a diversos medios para mantenimiento y estudio o a partir de una muestra a ser analizada. La transferencia se denomina
subcultivo cuando proviene de un cultivo previo. Debe realizarse mediante Buenas Prácticas de Laboratorio o BPL técnica aséptica
en condiciones estériles con el fin de evitar contaminación. El uso de la técnica aséptica asegura que no se introduzcan
microorganismos extraños (del operador o del ambiente) en los materiales de laboratorio y/o cultivos cuando estos son
manipulados de cualquier manera, así como también garantiza que los microorganismos estudiados no contaminen al operador u
otras personas y su aplicación significa que ninguna contaminación permanece latente después de que usted ha trabajado con
microorganismos. Al trabajar a lo largo del tiempo con la técnica aséptica, se vuelve rutina y natural para usted.
Asepsia es la ausencia de microorganismos que causan enfermedad y antisepsia es la utilización de métodos físicos o químicos al
igual que procedimientos ordenados y seguros para inhibir o destruir y evitar microorganismos. Para ejecutar las siembras y
transferencias de microorganismos se utilizan agujas o asas bacteriológicas, hechas de metal inerte como platino, e insertadas en
un manubrio de metal con protector. También se usan aplicadores de algodón esterilizados, palillos de diente de madera
esterilizados, micropipetas con puntas estériles y filtro de algodón, pipetas serológicas estériles y filtro de algodón, dependiendo del
objetivo de la siembra y la naturaleza de la muestra o medio de cultivo. Los microorganismos se cultivan en medios de cultivo
preparados asépticamente en envases de vidrio de laboratorio como tubos de ensayo y cajas Petri, entre otros.
El procedimiento general para una técnica aséptica consiste en:
(1) La desinfección del área de trabajo al ingreso al laboratorio, antes y después de la ejecución de cada procedimiento y a la salida
del laboratorio.
(2) Lavado de manos al ingreso al laboratorio, antes y después de la ejecución de cada procedimiento y a la salida del laboratorio.
(3) Protección personal con mandil limpio y desinfectado semanalmente, guantes, mascarilla, pelo recogido, cofia, gafas, uñas
cortas, sin aretes ni pulseras o anillos, pantalones y zapatos cerrados.
(4) Seguridad de contar con todo el material necesario antes de empezar la ejecución práctica.
(5) No hablar, toser o estornudar mientras realiza los procedimientos. Si es inevitable, hacerlo contra su antebrazo cubierto con el
mandil.
(6) Utilización del mechero y/o cámara de flujo.
(7) Esterilización al rojo vivo en la llama del mechero del asa o aguja bacteriológica.
(8) Esterilización previa de los materiales a usar en cada práctica.
(9) Flameado de las bocas de los tubos de ensayo antes y después de la transferencia de microorganismos.
(10) Apertura y sostenimiento de tapas de tubos de ensayo de acuerdo a técnica estándar.
(11) Apertura y sostenimiento de caja Petri de acuerdo a técnica estándar.
OBJETIVOS:
1. Aprender técnicas BPL de siembra bacteriana.
2. Utilizar los medios de cultivo preparados para realizar cultivos bacterianos.
MATERIALES:
REACTIVOS: Medios de cultivo preparados en la clase INSUMOS: Gradillas, asas bacteriológicas, agujas bacteriológicas,
anterior: Sets de tinción Gram. aceite de inmersión y portaobjetos.
EQUIPOS: Mecheros bunsen, incubadora 37ºC, refrigeradora y microscopio óptico.

CAMPO.
MUESTRA: Cultivos de Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, Escherichia coli y Staphylococcus epidermidis.
INSTRUCCIONES:
1. Utilizar ropa de protección: mandil, guantes, gafas, cabello recogido, zapatos cerrados.
Ejercicio 1: Siembras microbianas en tubo.
a) Caldo:
Esterilizar el asa. Esterilizar el asa.

Tomar AGITAR el
la asa en el
muestra caldo estéril
b) Agar inclinado:
Estriar en zigzag desde el fondo hacia la boca

del tubo, sin repasar.
Dejar un 1 cm libre de siembra en el pico de

flauta.
a) Sembrar en tubo de ensayo con medio líquido.

b) Sembrar en tubo de ensayo con medio sólido inclinado o pico de flauta.
Paso por paso, el procedimiento es el siguiente:
1. Escoja el tubo con cultivo microbiano así como los tubos con caldo y agar inclinado estériles, respectivamente.
2. Marque e identifique los tubos: escriba su nombre, fecha y microorganismo sobre la superficie exterior de vidrio del tubo de
ensayo en un lugar en donde no impida la observación interior.
3. Coja el asa por el manubrio protegido de azul o negro a manera de un lápiz y esterilícela poniéndola inclinada a 45º sobre la
llama azul del mechero hasta que todo el alambre de la punta se torne rojo incandescente. Mantenga el asa al lado de la llama del
mechero y espere a que se enfríe. No la puede soltar ni poner sobre la mesa pues se contaminaría. En la otra mano, debe tener
tanto el cultivo de donde va a sacar la muestra como el tubo a donde va a transferirla. Asegúrese de contar con una gradilla.
4. Siempre al lado de la llama del mechero, destape el cultivo bacteriano usando el dedo meñique de la mano que sostiene el asa.

CAMPO.
Destape el otro tubo con el dedo anular de la misma mano. Las tapas de ambas tubos deben permanecer en los dedos hasta que
tenga que volver a tapar los tubos; nunca deje la tapa sobre la mesa, eso contaminaría al cultivo y la mesa.
5. Pase las bocas de los tubos varias veces por la llama, para destruir cualquier microbio indeseable que pudiera estar pegado al
vidrio y purificar el aire.
6. Introduzca el asa estéril en el tubo con bacterias, sin rozar las paredes del mismo. Extraiga la muestra tocando cuidadosamente
la “nata” bacteriana (no rompa el agar) y transfiérala al otro tubo para realizar la siembra: si es caldo, agite brevemente el asa
dentro de este; si es agar inclinado, deslice el asa en forma de zig zag continuo sobre la superficie por una sola vez, evitando
destruir al agar. Saque el asa del segundo tubo sin tocar las paredes de vidrio.
7. Vuelva a flamear las bocas de los tubos. Tape los dos tubos; cada uno con el tapón respectivo (acordándose de cómo los
destapó).
8. Esterilice el asa y colóquela en un lugar seguro.
Nota: Si le es difícil sostener los dos tubos en su mano, puede hacer la siembra secuencialmente tomando el primer tubo de la
gradilla, luego destaparlo, realizar la toma de muestra, flamear la boca, taparlo y volver a dejarlo en ella, y, acto seguido, proceder
con el segundo tubo también sacándolo de la gradilla, destaparlo, realizar la toma de muestra, sembrar, flamear la boca y
volviéndolo a poner en la gradilla.
9. Ponga a cada tubo con el medio de cultivo recién inoculado bien tapado en un vaso de precipitación e incube a 37ºC por 18 h
para obtener crecimiento bacteriano.
Esta es la técnica básica, que si se sigue correctamente, le garantizará, hasta en un 99%, la pureza de sus cultivos y su propia
seguridad.
No se olvide: trabaje siempre cerca de la llama del mechero y ponga atención en lo que hace.
Ejercicio 2: Inoculación por rayado en caja Petri.
Proceda en secuencia como sigue:

1. Esterilice el asa bacteriológica en la llama del mechero.
2. Al lado de la llama del mechero, tome en su mano libre la caja Petri con cultivo bacteriano y póngala sobre el meñique y el anular
para sostenerla por la base; el dedo medio y el índice cogen la tapa por el borde superior y el pulgar por el borde inferior de
manera que pueden destaparla y taparla en un solo movimiento.
3. Destape la caja y tome una pequeñísima cantidad de muestra con el asa esterilizada, topando levemente la “nata” de bacterias
sin dañar el agar. Tape inmediatamente la caja para evitar contaminación. Tome la otra caja, con el medio estéril en donde va a
sembrar, e inocule deslizando el asa estéril a manera de zig zag (ni laxo ni apretado) sobre toda la superficie disponible, sin llegar
al borde, y en un solo movimiento. No rompa el agar. No pase dos veces sobre la misma línea. Inmediatamente tape la caja Petri.
No descuide el asa bacteriológica cargada con bacterias vivas que debe permanecer al lado de la llama del mechero inmóvil
durante todo el tiempo.
Nota: Si le es difícil destapar y tapar la caja en la mano, al lado de la llama del mechero, sobre la mesa destape primero la caja
Petri con crecimiento bacteriano y tome una pequeñísima cantidad de muestra con el asa esterilizada, topando levemente la “nata”
de bacterias sin dañar el agar. Tape inmediatamente la caja para evitar contaminación. Acto seguido, destape la caja Petri con
medio de cultivo estéril e inocule deslizando el asa estéril a manera de zig zag (ni laxo ni apretado) sobre toda la superficie
disponible, sin llegar al borde, y en un solo movimiento. No rompa el agar. No pase dos veces sobre la misma línea.
Inmediatamente tape la caja Petri. No descuide el asa bacteriológica cargada con bacterias vivas que debe permanecer al lado de
la llama del mechero inmóvil durante todo el tiempo. Tape la caja inmediatamente para evitar contaminación.
4. Selle la caja con parafilm.
5. Incube a 37ºC por 24 h.

CAMPO.
Obtendrá cultivos bacterianos. Observe el crecimiento en cada medio de cultivo y descríbalo. Anotar sus observaciones
relacionándolas con el procedimiento realizado en su bitácora de laboratorio. Describir mediante párrafos. Si es necesario, hacer
dibujos y tomar fotos. En Resultados solamente van sus datos analizados. Refiérase a los objetivos e hipótesis para elaborarlos en
concordancia.
CONCLUSIONES:
Se obtienen cultivos bacterianos.
RECOMENDACIONES:
FIRMAS
F:…………………………………………. F:……………………………………………. F:…………………………………………………


CAMPO.
PERíODO III Malla

ASIGNATURA: Biología de los microorganismos. Marzo – julio 2020 NIVEL:
LECTIVO: Rediseño
DOCENTE: Alma Koch Kaiser NRC: 6926, 6930, 6931. PRÁCTICA N°: 9
LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA Laboratorio multidisciplinario 04, docencia de Microbiología.

TEMA DE LA
AISLAMIENTO DE COLONIAS BACTERIANAS Y CULTIVO PURO
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
En vista de que las bacterias y levaduras son omnipresentes ya que en la naturaleza se encuentran formando comunidades con
diversas especies microbianas, se utilizan diversas técnicas para separarlas unas de otras en forma de colonias y para obtenerlas
en condición pura en cultivo en el laboratorio. Una colonia es la descendencia de una sola célula que perfectamente aislada e
individualizada sobre una superficie sólida, puede ser observada a simple vista y transferida a otro medio de cultivo estéril para
obtener un cultivo de un solo tipo de microorganismo al que se denomina cultivo puro o axénico. El estudio organizado de
cualquier organismo requiere del examen de una cepa a la vez; el método analítico no se puede aplicar cuando se tratan de varias
juntas. En ocasiones, el estudio molecular conduce a la caracterización de los microorganismos, aún en poblaciones mixtas; sin
embargo, la identificación y caracterización bacteriana completa únicamente es dable mediante el aislamiento de la bacteria y la
elaboración de cultivos puros. Al estudiar una bacteria, lo primero que se debe hacer es su separación de los demás
microorganismos de una muestra, ya sea clínica, ambiental (agua, suelo), de alimentos y otras. Para obtener un cultivo puro,
idealmente, se debería aislar una sola célula bacteriana y transferirla a un medio estéril hasta que se divida, produciendo gran
cantidad de bacterias, así se tendría la seguridad de que todas son genéticamente idénticas, excepto si ocurre mutación
espontánea. Sin embargo de que es muy difícil aislar una sola célula, se han desarrollado técnicas que se aproximan al ideal,
aunque sin confianza total de haberlo alcanzado. El método más utilizado para aislar colonias bacterianas es la siembra por
estrías. Con el asa bacteriológica cargada de la menor cantidad posible de muestra, se raya tanta superficie de agar en caja Petri
como sea posible, para que las bacterias, al desprenderse del asa, caigan individualmente, entonces cada una prolifera dando
lugar a una colonia. Algunas veces, las especies bacterianas se pueden identificar basándose en el aspecto que tienen sobre o
dentro de distintos medios de cultivo. La pigmentación, el tamaño y la forma de las colonias o la manera de crecimiento en los
medios líquidos proveen elementos de caracterización. Hay ciertos peligros que pueden presentarse en el momento de hacer el
examen del cultivo: los principales son la contaminación y la variación intra-específica. Ambos problemas se deben evitar para
lograr buenos resultados. Para obviar la contaminación, es indispensable evitar corrientes de aire (ventanas abiertas, sistemas de
calefacción, movimientos de las manos, entre otros); NO CONVERSAR en el momento de siembra; mantener el ORDEN y aplicar
una TÉCNICA ASÉPTICA y cuidadosa. Respecto a las variaciones intra-específicas, se pueden deber a una modificación inducida
por el ambiente, de una característica genéticamente controlada, mutaciones espontáneas no dirigidas y a la adquisición de
material genético nuevo a consecuencia de conjugación u otro proceso que se evitan al manejar los cultivos de acuerdo a
protocolos ya establecidos y mantener las cepas bajo condiciones específicas a largo plazo.
OBJETIVOS:
1. Aislar colonias bacterianas a partir de un cultivo mixto microbiano.
2. Obtener un cultivo puro a partir de una colonia bacteriana aislada en medio de cultivo sólido em caja Petri.
MATERIALES:
REACTIVOS: Cajas Petri con Agar nutriente, TSA, PDA, INSUMOS: Gradillas, asas bacteriológicas, agujas bacteriológicas,
BHIA, EMB. Sets de tinción Gram y etanol 70%. aceite de inmersión, portaobjetos.
EQUIPOS: Mecheros bunsen, incubadora 37ºC, refrigeradora y microscopio.

MUESTRA: Cultivos en tubo de ensayo de Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, Escherichia coli y Staphylococcus
epidermidis.
INSTRUCCIONES:
Ejercicio 1: Agar nutriente, separación mecánica mediante siembra por estrías.
1. Obtenga una muestra pequeña con el asa a partir del cultivo mixto.
2. Reparta el inóculo con el asa, trazando líneas paralelas continuas a manera de zig zag sobre un tercio de la superficie del agar.

CAMPO.
Esterilice el asa.
3. Con el asa estéril fría pase una línea (por una sola vez) sobre el rayado anterior de manera que arrastre bacterias. Dispérselas
sobre otro tercio del agar en zig zag. Esterilice el asa.
4. Repita el procedimiento anterior en el tercio restante de la caja.
5. Selle la caja con parafilm y ponga la caja, en forma invertida (con la tapa hacia abajo), en la cesta, portacajas o funda
correspondiente e incube a 37ºC por 18-24h.
Esterilizar el asa y enfriarla.
Esterilizar el asa y
enfriarla. Arrastrar
bacterias del
segundo zigzag (2).
No topar las líneas

de las estrías con
el asa durante la
siembra.
Ejercicio 2: Separación por combinación de técnicas: separación mecánica y bioquímica.

1. Obtenga una caja de los agares selectivos y/o diferenciales. Márquelas e identifíquelas apropiadamente.
2. Escoja un procedimiento de siembra de los utilizados en la separación mecánica y ejecútelo sobre estos agares.
3. Incube las cajas a 37ºC por 18-24 h.
Ejercicio 3: Obtención de un cultivo puro.
1. Observe detenidamente el crecimiento logrado en el aislamiento de colonias. Identifique si es un cultivo masivo o colonias
separadas.
2. Para obtener un cultivo puro, con el asa esterilizada debe tomar una colonia perfectamente aislada e individualizada y sembrarla
en un tubo con agar nutriente inclinado. Incube a 37ºC por 18-24 h.
Obtendrá colonias aisladas sobre la superficie del agar en caja Petri. A partir de una colonia perfectamente aislada y sembrada en
un tubo de ensayo con medio estéril, logrará un cultivo puro. Observar el crecimiento en cada medio de cultivo y descríbalo. Anotar
sus observaciones relacionándolas con el procedimiento realizado en su bitácora de laboratorio. Describir mediante párrafos. Si es
necesario, hacer dibujos y tomar fotos. En Resultados solamente van sus datos analizados. Refiérase a los objetivos e hipótesis
para elaborarlos en concordancia.
CONCLUSIONES:
Se obtienen cultivos bacterianos, con colonias aisladas y cultivos puros.
RECOMENDACIONES:

CAMPO.

FIRMAS
F: ………………………………………. F: ……………………………………. F:……………………………………………

Nombre: Lic. Alma Koch Kaiser, Mgs. Nombre: Claudia Segovia, PhD. Nombre: Dra. Patricia Jiménez Arias, PhD.
Docente Coordinadora de Área de Conocimiento Coordinador/Jefe de Laboratorio

PERíODO III Malla
LECTIVO: Rediseño
DOCENTE: Alma Koch Kaiser NRC: 6926, 6930, 6931. PRÁCTICA N°: 10

TEMA DE LA
RECUENTO MICROBIANO
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
En estudios microbiológicos se necesita conocer con exactitud el número de microorganismos presentes en una muestra. Los
métodos de recuento bacteriano más utilizados son las medidas indirectas del crecimiento microbiano como la turbidez mediante
espectrofotómetro o medidas directas como el recuento celular en cámara de Neubauer, las que no discriminan entre células vivas
y muertas. La cámara Neubauer es un portaobjetos grueso, cuyo centro está dividido en tres bandas, las dos laterales elevadas
con respecto de la central en 0.1 mm, y la central, grabada con un retículo cuadrangular de dimensiones conocidas, en donde se
cuentan las células mediante observación directa al microscopio compuesto. La dilución de la muestra original y la siembra en caja
Petri es una forma indirecta de contar células viables mediante las colonias resultantes. Frecuentemente las muestras naturales
tienen un número elevado de microorganismos, por lo que se requiere diluirla para poder determinar su cantidad. El método
habitual para la determinación de células viables se basa en contar el número de UFC (unidades formadoras de colonias) por
gramo o mililitro de la muestra original. Cada colonia aislada proviene de una bacteria o de un agregado de ellas por lo que se la
denomina UFC. Las técnicas no detectan a todos los microorganismos presentes en la muestra. El tipo de medio de cultivo, la
temperatura de incubación y las condiciones aerobias o anaerobias, además de otras variables, seleccionan bacterias a contar en
una muestra determinada; por ejemplo, las bacterias mesófilas aerobias, indicadoras de la higiene de manipulación de un producto
alimenticio. Otro método es el recuento por placas Petrifilm que están listas para ser empleadas, contienen nutrientes del Agar
Standard Methods, un agente gelificante soluble en agua fría, y un tinte indicador que facilita el recuento de las colonias después
del periodo de incubación. Son prácticas, confiables y ocupan poco espacio. Determina bacterias y hongos viables en UFC por g o
mL.
OBJETIVOS:
1. Entender el concepto de Unidad Formadora de Colonia (UFC)
2. Calcular el número de UFC/mL de una muestra problema.
MATERIALES:
REACTIVOS: Caja Petri con Agar nutriente, BHIA, tubos de INSUMOS: Gradillas, codos de vidrio estériles, vasos de
ensayo con 9.0 mL de agua peptonada estéril, pipetas precipitación de 100 mL con etanol 70% y Cámaras Neubauer.
estériles de 1 mL y Placas Petrifilm.
EQUIPOS: Mecheros bunsen. Incubadora 37ºC. Refrigeradora. Microscopio.

MUESTRA: Cultivos en caldo de 6 h en tubo de ensayo de Escherichia coli y cultivos de una microalga.
INSTRUCCIONES:
1. RECUENTO EN CÁMARA DE NEUBAUER.

CAMPO.
Cualquier experimento o estudio con células requiere cantidades conocidas. Para cuantificarlas existen distintos métodos. A pesar
de los grandes avances en la ciencia, entre los más utilizados por su sencillez y bajo coste, está la observación microscópica
directa en cámaras de recuento celular. Hay diferentes cámaras de recuento pero el funcionamiento básico es común para todas.
Son portaobjetos especiales con cuadrículas de área conocida y volumen fijo de la suspensión celular en estudio para estimar la
cantidad en la muestra. Habitualmente delimitan una superficie cuadrada de 1 mm de lado, es decir, 1 mm2.
Cámara de Neubauer
(portaobjeto)
El cuadrado grande central (que se puede ver en su totalidad con el objetivo 10X), está dividido en 16 o 25 cuadrados medianos
(con el objetivo 40X se pueden distinguir los cuadrados medianos completamente), cada uno de ellos con cuadrados pequeños en
su interior.
El recuento se puede realizar tanto en el cuadrado grande central como en los de las esquinas, dependiendo del tamaño de las
células en estudio. En este ejemplo se realizará el recuento en el cuadrado central:
1 mm2
1 2 3 4
16 cuadrados
Cuando se coloca la muestra bajo el cubreobjetos, la suspensión celular alcanza una altura de 0,1 mm. Teniendo estos datos en

CAMPO.
cuenta, y si consideramos uno de los cuadrados grandes, el volumen contenido será de: 1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm3 = 10-4 ml.
Con el objetivo 10X del microscopio hay que localizar la zona de recuento. Cuente los cinco cuadrados marcados en rojo en la
cuadrilla. Cambie al objetivo 40X. Se cuentan las células contenidas en los cuadrados elegidos.
Hay que contar todas las células que están dentro de cada cuadrado mediano y aquellas que están tocando los lados superior y
derecho de dicho cuadrado (aunque estén parcialmente fuera). Siguiendo este criterio, en la primera figura se contarían las células
en color verde, y no se contarían las células en color rojo. Si hemos contabilizado N células en uno de los cuadrados grandes (o
sea, en 25 cuadrados medianos), la concentración de nuestra muestra será: N x 10 4 cel/ml. Si para hacer el recuento hemos tenido
que concentrar o diluir la muestra inicial, hemos de tener en cuenta este factor de concentración-dilución (f): N x 10 4 x f cel/ml.
Suspensión celular inicial = suspensión celular diluida x factor de concentración-dilución. La observación microscópica de la cámara
de recuento se la hace con el objetivo 40X.Para cargar la muestra, proceda a colocar el cubreobjetos sobre el portaobjetos
humedecido para que se sellen. A continuación, tome una muestra con un tubo capilar y descargue el contenido de la siguiente
forma:
2. RECUENTO EN PLACA PETRI UFC/ML

1. Tomar 1 mL de la muestra problema y transferirlo al primero de los tubos con 9 mL de solución salina estéril. ESTA ES LA
DILUCIÓN 10-1.
2. Homogenizar totalmente la primera dilución y proseguir de la misma forma hasta la dilución a la 10-5.
3. Transferir con una pipeta estéril 0,1mL de cada dilución a las Cajas Petri con Agar Nutritivo y BHIA. Este inóculo debe
extenderse de forma homogénea por toda la superficie de la placa, para lo cual se utiliza la varilla de vidrio acodada, previamente
esterilizada (impregnándola de alcohol 70 % y pasándola por la llama del mechero, sin sobrecalentarla).
4. Incubar las placas en posición invertida a 37oC durante 24 horas.
5. Después del período de incubación, examinar las placas. No debe haber crecimiento masivo.
1 ml
Fórmula: Número de colonias (rango 30-300) x factor de dilución (positivo de la dilución) x volumen dispensado en la caja Petri.
Unidad: UFC / mL.
Por ejemplo, si en la placa correspondiente a la dilución 10-3 contamos 200 colonias, el UFC /mL sería:
200 x 103 / 0,1 (volumen añadido a la placa) = 2x106 UFC/mL.

CAMPO.
2. RECUENTO POR PETRIFILM UFC/mL (Procedimiento 3M).

1. Coloque la Placa Petrifilm en una superficie plana y nivelada. Levante la película superior.
2. Con la Pipeta perpendicular a la Placa Petrifilm, coloque 1 mL de la muestra en el centro de la película cuadriculada inferior.
3. Libere la película superior dejando que caiga sobre la dilución. No la deslice hacia abajo.
4. Con el lado rugoso hacia abajo, coloque el dispersor o esparcidor sobre la película superior, cubriendo totalmente la muestra.
Presione suavemente el dispersor o esparcidor para distribuir la muestra sobre el área circular. No gire ni deslice el dispersor.
Recuerde distribuir la muestra antes de inocular una siguiente placa. Levante el dispersor o esparcidor. Espere por lo menos 1
minuto a que se solidifique el gel y proceda a la incubación.
5. Incube las placas cara arriba en grupos de no más de 20 piezas. Puede ser necesario humectar el ambiente de la incubadora
con un pequeño recipiente con agua estéril, para minimizar la pérdida de humedad.
6. Las Placas Petrifilm pueden ser contadas en un contador de colonias estándar u otro tipo de lupa con luz.
7. Las colonias pueden ser aisladas para su identificación posterior. Levante la película superior y recoja la colonia del gel.
1 2 3

CAMPO.
5 6
Fórmula: Número de colonias x factor de dilución. Unidad: UFC / mL
Obtendrá colonias aisladas sobre la superficie del agar en caja Petri. Observar el crecimiento en cada medio de cultivo y
descríbalo. Anotar sus observaciones relacionándolas con el procedimiento realizado en su bitácora de laboratorio. Describir
mediante párrafos. Si es necesario, hacer dibujos y tomar fotos. En Resultados solamente van sus datos analizados. Refiérase a
los objetivos e hipótesis para elaborarlos en concordancia . Las colonias aparecerán sobre la superficie del agar. Cada colonia
representa los descendientes de una UFC (unidades formadoras de colonia). Contar únicamente aquellas placas que contengan un
número entre 30 y 300 colonias. Un número menor de 30 colonias por placa puede suponer la presencia de errores debido a
fluctuaciones estadísticas y un número mayor a 300 puede ser excesivo para poder contarlas con exactitud. Calcular con estos
datos el número inicial de UFC/mL de muestras:
CONCLUSIONES:
Se obtiene el número de UFC/mL de muestra original.
RECOMENDACIONES:
FIRMAS
F: …………………………………………. F:………………………………………. F:……………………………………………

Nombre: Lic. Alma Koch Kaiser, Mgr. Nombre: Claudia Segovia, PhD. Nombre: Dra. Patricia Jiménez, PhD.

CAMPO.

PERíODO III Malla
LECTIVO: Rediseño
PRÁCTICA
DOCENTE: Alma Koch Kaiser NRC: 6926, 6930, 6931. 11
N°:
Laboratorio Multidisciplinario 04, docencia de Microbiología.
PRÁCTICA
TEMA DE LA
CONTROL MICROBIANO FÍSICO
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:

CAMPO.
Cuando los microorganismos producen enfermedades, toxinas o metabolitos tóxicos para el ser humano, además de daños en
cultivos, alimentos, infraestructura y enfermedades en animales se aplican procedimientos con el fin de destruir o controlar su
crecimiento. Los métodos físicos se utilizan a menudo para lograr la descontaminación, la desinfección y la esterilización
microbiana. Los factores de control físico son:
OBJETIVOS:
Demostrar la acción de agentes físicos en la destrucción, eliminación y muerte de microorganismos.
MATERIALES:
REACTIVOS: Tubos con caldo nutritivo, tubos con solución INSUMOS: Gradillas, asas bacteriológicas, vasos de precipitación
salina, cajas de agar nutritivo, micropipeta de 100 a 1000 de 250 y 500 mL y varillas de vidrio acodada.
µL, puntas para la micropipeta. Cajas Petri con agar
nutriente, BHIA y EMB.
EQUIPOS: Mecheros bunsen, incubadora 37ºC, refrigeradora, microscopio.

MUESTRA: Cultivos puros en tubo de ensayo de Escherichia coli.
INSTRUCCIONES:
Ejercicio 1: EFECTOS DE LA TEMPERATURA EN EL CRECIMIENTO BACTERIANO.
1. Marcar cada tubo de caldo nutritivo con las siguientes temperaturas 4º, RT (Room Temperature 21ºC), 35º y 50º.
2. Inocular cada tubo con el microorganismo, utilice el asa.
3. Colocar cada tubo en un vaso de precipitación rotulado con cada temperatura e incubarlo a la temperatura pertinente.
4. Repetir el mismo proceso para los tubos con solución salina.
5. Sembrar en agar BHIA y nutriente después de finalizado el tiempo de incubación.

CAMPO.
Ejercicio 2: FILTRACIÓN.
Antes de filtrar el Después de filtrar el

cultivo bacteriano se cultivo bacteriano no
ve crecimiento en la se ve crecimiento en
siembra. la siembra.
1. Proceder a filtrar 1 mL de cultivo líquido de Escherichia coli mediante un filtro milipore acoplado a una jeringuilla, recogiendo el
filtrado en un tibo de ensayo estéril.
2. Sembrar la mitad de una caja Petri con agar EMB antes y después de la filtración.
3. Incubar a 37ºC por 24 h.
Ejercicio 3: INCINERACIÓN.
Antes de incinerar el Después de incinerar

asa cargada con el asa cargada con
muestra bacteriana se muestra bacteriana
ve crecimiento en la no se ve crecimiento
siembra. en la siembra.
1. Dividir una caja Petri con agar EMB en dos mitades.

2. Sembrar una mitad con el cultivo de Escherichia coli siguiendo el procedimiento rutinario.
3. Sembrar la otra mitad del agar EMB con el asa incinerada en la llama luego de haber tomado la muestra en forma regular.
4. Sembrar en agar BHIA y nutriente después de finalizado el tiempo de incubación.
5. Incubar las cajas a 37ºC por 24 h.

CAMPO.
Ejercicio 1: Observar presencia o ausencia de crecimiento de acuerdo con la temperatura de incubación. Ejercicio 2: Observar si
hay crecimiento antes y después de la filtración. El caldo filtrado queda libre de bacterias, es estéril. Ejercicio 3: Observar si hay
crecimiento antes y después de la incineración. El fuego mata a las bacterias.Observar el crecimiento en cada medio de cultivo y
descríbalo. Anotar sus observaciones relacionándolas con el procedimiento realizado en su bitácora de laboratorio. Describir
mediante párrafos. Si es necesario, hacer dibujos y tomar fotos. En Resultados solamente van sus datos analizados. Refiérase a
los objetivos e hipótesis para elaborarlos en concordancia.
CONCLUSIONES:
La temperatura afecta al crecimiento bacteriano y puede ser usada como medio de control de los microorganismos. La filtración
elimina las bacterias del caldo de cultivo, las separa de él, las atrapa en la membrana del filtro dejando el caldo estéril.
RECOMENDACIONES:
FIRMAS
F: ………………………………………. F:…………………………………………. F:………………………………………………

Nombre: Lic. Alma Koch Kaiser, MSc. Nombre: Claudia Segovia, PhD. Nombre: Dra. Patricia Jiménez, PhD.
DEPARTAMENTO: Ciencias de la Vida y la Agricultura CARRERA: ☒ Ing. Agropecuaria ☒ Ing. Biotecnología

PERíODO Marzo – julio III Malla
6926, 6930,
6931.

CAMPO.

TEMA DE LA
CONTROL MICROBIANO QUÍMICO
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
Cuando los microorganismos producen enfermedades, toxinas o metabolitos tóxicos para el ser humano, además de daños en
cultivos, alimentos, infraestructura y enfermedades en animales se aplican procedimientos con el fin de destruir o controlar su
crecimiento. Los métodos QUÍMICOS se utilizan para lograr la descontaminación, la desinfección y la esterilización microbiana.
Conceptos indispensables:
ANTISÉPTICO: (Del griego: anti: contra, y sepsis: putrefacción); es toda sustancia capaz de impedir la proliferación de bacterias, sea
inactivándolas o destruyéndolas.
ASEPSIA: Conjunto de medios usados para impedir la penetración de gérmenes en un local que no los contenga.
BACTERICIDA: Sustancia o proceso que mata bacterias. Es irreversible.
BACTERIOSTÁTICO: Sustancia que inhibe a las bacterias. Detiene su metabolismo y reproducción. Puede ser reversible.
CONSERVACIÓN: Es la acción de preservar un objeto o sustancia de cualquier alteración. Conservación física o química.
CONSERVADOR: Sustancia que previene el desarrollo y multiplicación de microorganismos en un medio. Es análogo a
bacteriostático.
DESINFECTANTE: Agente químico con actividad germicida sobre microorganismos patógenos en superficies inertes. La actividad no
siempre se extiende a las formas esporuladas.
DESINFECTAR: Destruir sólo los microorganismos patógenos y disminuir el total de microbios en una superficie o sustancia inerte.
ESTERILIZAR: Eliminar o destruir todas las formas de seres vivos existentes en un objeto o material.
GERMICIDA: Sustancia capaz de matar las formas vegetativas de gérmenes.
TINDALIZACIÓN: Es el calentamiento repetido entre 60 y 100ºC de una sustancia a esterilizar, a intervalos de tiempo determinados
(generalmente tres días sucesivos). El primer calentamiento destruye sólo las formas vegetativas de la bacteria, no mata las
esporas. Cuando el líquido se enfría, las esporas germinan y al repetirse el calentamiento al segundo intervalo de tiempo, se
destruyen las formas vegetativas de las esporas que no habían muerto en el primer calentamiento. Las esporas que permanecen
viables serán destruidas en el tercer calentamiento.
Algunos de los agentes químicos antimicrobianos son los siguientes:

1- Fenol y compuestos fenólicos:
a. Acido fénico (C6H5OH) al 0,5%, usado como antiséptico para la preservación de sueros y vacunas.
b. Creso (CH3C6H4OH) al 2%: desinfección de pisos, instalaciones sanitarias.
c. Ácido salicílico (HOC6H4COOH) (1:1000): preservación de alimentos.
d. Acido benzoico (C6H5COOH) (1:1000): también se lo usa para preservación de alimentos.
2- Alcoholes:
- Alcohol etílico (CH3CH2OH) al (60%): desinfección de heridas y regiones que se van a operar. El alcohol absoluto es un germicida
débil y el poder óptimo se halla entre 60% y 70%.
3- Alcohol - Iodado:
Es una combinación de yodo con alcohol 70%. Se la debe usar en concentraciones del 2%. Se utiliza como antiséptico de elección
en la preparación pre-quirúrgica de la piel. También se usa para desinfectar material de laboratorio.
4- Cloro y compuestos clorados:
- Hipoclorito de sodio (0,5% al 1%): se inactiva con materia orgánica (ej.: con detergente). No se usa como antiséptico. Puede
utilizarse en material de laboratorio.
5- Metales pesados y sus compuestos:
5.1. Merthiolate (1:10000): se usa para desinfección de la piel (tintura al 1%). Para desinfección de mucosas se usa en solución
acuosa de 1:2000 y 1:20000. También se utiliza como preservativo para productos biológicos como sueros y vacunas.
5.2. Nitrato de plata AgNO3 (1:1000): desinfectante para mucosas con débil irritación.
6- Oxidantes:
6.1. Ozono 13:1000000: Se descompone rápidamente liberando oxígeno naciente:
O3 O2 + O
Se usa para desinfección del aire y del agua. En concentración necesaria ejerce acción tóxica, razón por la cual no se lo puede
emplear en desinfección de locales habitados.

CAMPO.
6.2. Agua oxigenada: H2O2 solución comercial al 3%: se usa para limpieza y desinfección de heridas. Se descompone rápidamente
en presencia de sangre, pus, etc., que contiene catalasa que hace burbujear el agua oxigenada sobre las heridas.
7- Reductores:
- Formalina, (HCHO) al 3-8%: utilizable en la desinfección de instrumental quirúrgico pues no ataca los metales. El inconveniente son
los vapores irritantes. No se presta para la desinfección de manos ya que produce arrugas.
8- Detergentes catiónicos:
- Compuestos de amonio cuaternario, C6H5CH2N-(CH3)2RCL (R: mezcla de alcil radicales C8H17a C18 H37) 1:1000: desinfección de
la piel, mucosas y heridas. Se usa solución 1:2000 - 20000. Siendo un detergente catiónico, su efecto es anulado por los jabones
que son detergentes aniónicos. Se lo usa en cirugía para la desinfección de manos.
BJETIVOS:
Demostrar la acción de agentes químicos en la destrucción, eliminación y muerte de microorganismos.
MATERIALES:
REACTIVOS: Cajas Petri con agar Muller-Hinton y BHIA INSUMOS: Gradillas, asas bacteriológicas, vasos de precipitación
estériles. Cajas Petri con agar nutriente estéril. de 250 y 500 mL, aplicadores de algodón estériles, discos de
antibióticos, discos de papel filtro estériles, pinzas de metal, un vaso
de precipitación con etanol al 70% y desinfectantes comerciales
varios.

MUESTRA: Cultivos puros en tubo de ensayo de Bacillus subtilis, Escherichia coli y Staphylococcus epidermidis.
INSTRUCCIONES:
ANTIBIOGRAMA.
Comparar
diámetros de
halos de
inhibición con
tabla
bibliográfica
para decidir
resistencia o
sensibilidad.
1. Inocular el agar de la caja Petri de agar Muller-Hinton y BHIA con la bacteria con el aplicador de algodón en un zigzag apretado y
luego cruzarlo por encima repitiendo el proceso. Cubrir toda la superficie para que se forme una capa homogénea de bacterias.
2. Con un marcador, dividir la caja Petri (sobre la base de vidrio) en cuatro partes y marcar cada una.
3. Embeber la punta de la piza en etanol 70% y flamear. Enfriar. Tomar un disco de antibiótico o un disco impregnado en
desinfectante, colocarlo en el agar sobre la bacteria y presionar levemente para que el disco se pegue al agar.
4. Incubar a 37ºC por 18 horas.
Medir el diámetro del halo de inhibición de cada desinfectante y antibiótico. Compare con tablas en bibliografía y determine si hay
sensibilidad, mediana sensibilidad o resistencia.
Observar el crecimiento en cada medio de cultivo y descríbalo. Anotar sus observaciones relacionándolas con el procedimiento
realizado en su bitácora de laboratorio. Describir mediante párrafos. Si es necesario, hacer dibujos y tomar fotos. En Resultados

CAMPO.
solamente van sus datos analizados. Refiérase a los objetivos e hipótesis para elaborarlos en concordancia.
CONCLUSIONES:
Se utilizan agentes químicos para el control de microorganismos.
RECOMENDACIONES:
FIRMAS
F: ……………………………………… F: …………………………………………. F: ………………………………………………

Nombre: Lic. Alma Koch Kaiser, MSc. Nombre: Ing. Valeria Ochoa, PhD. Nombre: Dra. Patricia Jiménez, PhD.

ASIGNATURA: Biología de los microorganismos. PERíODO Marzo – julio NIVEL: III Malla

CAMPO.

6926, 6930,
6931.
TEMA DE LA
IDENTIFICACIÓN BACTERIANA DEPENDIENTE DE CULTIVO
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:
En el laboratorio de Microbiología se realiza la identificación bacteriana. En una enfermedad infecciosa, en un proceso industrial o en
un estudio ambiental es necesario conocer cada bacteria, a nivel de género y de especie, con el fin de combatirla apropiadamente,
obtener biomasa o asignarle el hábitat y el nicho ecológico correspondiente y, así saber, qué hace y cómo interactúa en el caso
específico en el que se la estudia.
La taxonomía o ciencia de la clasificación trata del arreglo ordenado de los seres vivos en grupos de acuerdo a sus semejanzas
intrínsecas. La clasificación de los seres vivos se basa en el gran principio unificador de la evolución orgánica. Este concepto
relaciona entre sí todos los seres vivos en un árbol filogenético. La doctrina evolutiva afirma que todas las formas de vida se originan
de otras formas de vida preexistentes. Los organismos más emparentados se encontrarán más cerca entre sí en el árbol evolutivo.
Algunas de las características de los seres vivos se prestan mejor que otras para propósitos taxonómicos. Por ejemplo, la apariencia
de un organismo nos proporciona información sobre su parentesco con otros organismos. Por lo tanto, la morfología de un
microorganismo se puede utilizar como criterio taxonómico. Además, el modo de reproducción y otros factores observables se usan
para reforzar el criterio morfológico.
Desgraciadamente, en el caso de las bacterias, este tipo de clasificación resulta difícil de aplicar, principalmente porque su estructura
es tan simple que solamente da lugar a un mínimo de diferenciación morfológica. Además, sus formas de reproducción son idénticas
o muy similares. En tal sentido, los microbiólogos se han visto forzados a emplear una clasificación de tipo de “claves” en donde para
diferenciar un tipo de bacterias de otro, se emplea un conjunto de características: morfológicas, fisiológicas, serológicas, de tinción,
de cultivo, tomando en cuenta la procedencia de la muestra y otras propias de cada caso. Este tipo de clasificación fue desarrollada
por David Bergey. Actualmente, además, se utiliza la identificación a nivel molecular, mediante el estudio de la composición del DNA,
el RNA y de enzimas específicas.
Toda información referente a la clasificación de las bacterias ha sido compilada en el libro: “Bergey’s Manual of Determinative
Bacteriology, en donde se encuentran clasificadas todas las bacterias conocidas, así como una descripción de todas las
características de cada organismo. Para facilitar al estudiante la localización del organismo que desee identificar, el Manual está
estructurado en forma de “claves”. Una clave es una “pista a seguir”. Deben irse descartando características hasta llegar a la
identificación requerida. Por ejemplo, la tinción Gram por sí sola no proporciona información suficiente para identificar una especie,
pero sí constituye un paso de la clave. Se puede definir la forma de la bacteria: coco, bacilo o espiral, y la reacción de tinción: Gram
positivas o Gram negativas. A partir de esta información se continúa con otras características de la clave.
El proceso general de la identificación bacteriana consiste en:
1. Toma de la muestra: en recipientes estériles, con tiempos limitados hasta su análisis en el laboratorio y bajo condiciones
controladas.
2. Siembra en medios de cultivo de enriquecimiento: con el fin de obtener suficiente número de bacterias a partir de la
muestra original y así contar con la seguridad de encontrar lo que se busca.
3. Aislamiento de colonias.
4. Elaboración de cultivos puros. Preparación de cultivos de trabajo y de reserva.
5. Caracterización morfológica y de tinción.
6. Proliferación bacteriana en medios de cultivo específicos. Determinación de características de cultivo, en medios de cultivo
específicos. Se hace una descripción de la apariencia macroscópica del crecimiento bacteriano sobre los medios de cultivo.
7. Determinación de características fisiológicas, en medios de cultivo específicos. Se hace un estudio de reacciones
enzimáticas de las bacterias, que pueden ser bio-oxidativas, fermentativas, hidrolíticas y exclusivas de cada grupo
bacteriano. A este punto se le conoce como “bioquímica de bacterias”. Actualmente existen los sistemas multitest
miniaturizados que simplifican el proceso y proporcionan resultados rápidos y uniformes, además de abaratar costos por la
mínima cantidad de medios de cultivo utilizada.
8. Determinación serológica, mediante reacciones antígeno – anticuerpo.
9. Determinación molecular, mediante análisis de DNA o RNA o de enzimas específicas para cada tipo bacteriano.
Actualmente existen programas de computadora que facilitan enormemente la identificación bacteriana.
Es preciso hacer una advertencia: el problema más importante en este tipo de trabajo es la CONTAMINACIÓN. De nada le sirve
identificar un contaminante; debe tomar todas las precauciones necesarias. Un contaminante es un microorganismo ajeno a la

CAMPO.
muestra original que se introduce a partir del medio ambiente por descuido en los procedimientos. Recuerde que las bacterias y los
hongos está en todas partes: en el asa bacteriológica (si no la esteriliza), en sus manos, en las mesas, en los lápices, en su saliva,
en el aire y otros.
100X
Colonias
negras
con brillo
verde
metálico
Micrografía
electrónica
OBJETIVOS:
Conocer y practicar con un ejemplo simple el proceso general de identificación bacteriana.
MATERIALES:
REACTIVOS: Bioquímica para Escherichia coli. INSUMOS: Gradillas. Asas bacteriológicas. Parafilm. Toallas, jabón,
Set de tinción Gram. Savlon. lápiz, mandil, guantes, marcador, portaobjetos.

MUESTRA: Cultivos puros en tubo de ensayo de Escherichia coli.
Colonias
INSTRUCCIONES:
1. Utilizar ropa de protección: mandil, guantes, gafas, cabello recogido, zapatos cerrados. rosadas
1. Hacer las tinciones de los cultivos puros respectivos para caracterizar forma, agrupación y tinción.
2. Sembrar en los medios de cultivo específicos de cada bioquímica, de acuerdo a las instrucciones que se le darán y
siguiendo la clave de identificación correspondiente.
3. Incube por 24 horas a 37ºC y observe resultados.
Anotar sus observaciones de acuerdo a las claves correspondientes. Describir mediante párrafos. Si es necesario, hacer tablas o
dibujos y tomar fotos. En Resultados solamente van sus datos analizados. Refiérase a los objetivos e hipótesis para elaborarlos en
concordancia.
CONCLUSIONES:
Los resultados de la bioquímica ejecutada corresponden con la clave de identificación para Escherichia coli.

CAMPO.
RECOMENDACIONES:
FIRMAS
F: ……………………………………. F: ………………………………………. F: ………………………………………………

Nombre: Lic. Alma Koch Kaiser, MSc. Nombre: Claudia Segovia, PhD. Nombre: Dra. Patricia Jiménez, PhD.

Manua de Laboratorio 2021 Ak

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GUIA PARA LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO, TALLER O CÓDIGO DE DOCUMENTO:

DEPARTAMENTO: Ciencias de la Vida y la Agricultura CARRERA: ☐ Ing. Agropecuaria ☒ Ing. Biotecnología

LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA Laboratorio multidisciplinario 04, docencia de Microbiología.

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

DEPARTAMENTO: Ciencias de la Vida y la Agricultura CARRERA: ☐ Ing. Agropecuaria ☒ Ing. Biotecnología

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

F:………………………………………. F: …………………………………………. F:………………………………………………:

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

DEPARTAMENTO: Ciencias de la Vida y la Agricultura CARRERA: ☐ Ing. Agropecuaria ☒ Ing. Biotecnología

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

F: …………………………………………. F:……………………………………………. F:…………………………………………………

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

DEPARTAMENTO: Ciencias de la Vida y la Agricultura CARRERA: ☐ Ing. Agropecuaria ☒ Ing. Biotecnología

LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA Laboratorio Interdisciplinario 04, docencia de Microbiología.

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

Gram positivas (violetas)

F: …………………………………………. F: …………………………………………. F:……………………………………………

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

DEPARTAMENTO: Ciencias de la Vida y la Agricultura CARRERA: ☐ Ing. Agropecuaria ☒ Ing. Biotecnología

LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA Laboratorio Interdisciplinario 04, docencia de Microbiología.

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

Hacer la extensión con un

Teñir con safranina o Observar al microscopio

F:………………………………………. F:………………………………………. F:………………………………………………

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

DEPARTAMENTO: Ciencias de la Vida y la Agricultura CARRERA: ☐ Ing. Agropecuaria ☒ Ing. Biotecnología

LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA Laboratorio Interdisciplinario 04, docencia de Microbiología.

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

4. Desinfectar el área de trabajo y encender el mechero

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

DEPARTAMENTO: Ciencias de la Vida y la Agricultura CARRERA: ☐ Ing. Agropecuaria ☒ Ing. Biotecnología

LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA Laboratorio Multidisciplinario 04, docencia de Microbiología.

CODIGO: FRM 6.3 REV. UPDI: 2019-nov-21

Leer indicaciones Pesar Volumen de agua

Dispensar en caja Petri. Control de calidad: 24 h al ambiente.

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Dos formas de destapar las cajas Petri al lado del mechero.

Dispensar el medio en tubos y autoclavar con las tapas flojas,

Dispensar el medio de cultivo en caja

Dispensar el medio de cultivo en

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Preparador de medios de cultivo automático.

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DEPARTAMENTO: Ciencias de la Vida y la Agricultura

PERÍODO Nov 2020 - Marzo III Malla

LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA Laboratorio Interdisciplinario 04, docencia de Microbiología.

EQUIPOS: Mecheros bunsen, incubadora 37ºC, refrigeradora y microscopio óptico.

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Esterilizar el asa. Esterilizar el asa.

Estriar en zigzag desde el fondo hacia la boca

Dejar un 1 cm libre de siembra en el pico de

a) Sembrar en tubo de ensayo con medio líquido.

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Ejercicio 2: Inoculación por rayado en caja Petri.

Proceda en secuencia como sigue:

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