Manual Micro

PRACTICA # 1 1.1 OBJETIVO.
NORMAS DE BIOSEGURIDAD.
Al finalizar la prctica el alumno conocer el concepto de normas de bioseguridad, su aplicacin y clasificacin con la finalidad de que sea capaz de utilizarlas tanto en el laboratorio como a nivel industrial. Conocer cuales son las Normas Oficiales Mexicanas que estn regulando el tratamiento de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos. 1.2 INTRODUCCION Los riesgos biolgicos se presentan no solamente al manipular microorganismos en cultivo. La presencia inerte o casual de agentes biolgicos en medios de cultivo, productos sanguneos, tejidos, secreciones u otro tipo de materiales biolgicos, significa un peligro potencial de contaminacin para el trabajador, el laboratorio, el medio ambiente y aun para un experimento posterior. Dentro de un laboratorio, las vas ms frecuentes de exposicin a los microorganismos son los accidentes con objetos punzocortantes (autoinoculantes), la inhalacin de los aerosoles que se producen en las manipulaciones, el contacto de membranas mucosas con material infectado, y la ingestin accidental. Los agentes biolgicos son los microorganismos y endoparsitos humanos susceptibles de originar cualquier tipo de infeccin, alergia o toxicidad. La exposicin laboral a estos agentes se puede considerar bajo dos puntos de vista, definidos por el tipo de actividad que se desarrolle. (Ramn Bordera, 2004:83) En primer lugar, se distinguen aquellas actividades en las que existe la intencin deliberada de manipular agentes biolgicos, por ejemplo, los laboratorios de diagnostico microbiolgico o las industrias en cuyos procesos se utilizan estos agentes y en segundo lugar, se encuentran aquellas actividades en las que no existe la intencin deliberada de manipular, agentes biolgicos pero s puede existir la exposicin debido a la naturaleza del trabajo, por ejemplo, los trabajos en centros de produccin de alimentos, los trabajos agrarios o en los que exista contacto con animales y/o sus productos, los trabajos sanitarios o los trabajos en unidades de eliminacin de residuos y de tratamiento de aguas residuales. (Ramn Bordera, 2004:83) Hoy en da, la experiencia acumulada a lo largo de ms de un siglo, ha permitido determinar cules son las reglas a seguir para minimizar nuestra exposicin a los agentes biolgicos dentro de un laboratorio. En la actualidad concebimos las reglas de seguridad biolgica: a) como un conjunto de prcticas correctas a seguir estrictamente en el laboratorio de acuerdo con el microorganismo manejado-; b) como el buen diseo y uso de la infraestructura del laboratorio y c)
como una gua que nos permite entrenar al personal que trabaja en los laboratorios, todo lo anterior con el fin de prevenir el riesgo y el desastre biolgicos. 1.3 CLASIFICACIN DE LOS RIEGOS BIOLGICOS. La clasificacin del riesgo biolgico asociado a cada agente depende de factores mltiples, como son: su grado de patogenicidad, su va de transmisin, su estabilidad, la posibilidad de prevenir o de tratar la infeccin provocada, las consecuencia epidemiolgicas ligadas a sta, el tipo y complejidad de manipulaciones que se realiza con el agente biolgico, etc. Los agentes biolgicos se pueden clasificar segn su peligrosidad en cuatro grupos, atendiendo a cuatro caractersticas: La capacidad del agente de provocar enfermedad en el hombre y la gravedad de la misma. La peligrosidad para los trabajos expuestos. La capacidad de contagio de la enfermedad causada entre un grupo humano. La existencia de tratamiento adecuado para la enfermedad (Ramn Bordera, 2004:84). As pues, de acuerdo con sus caractersticas, los agentes biolgicos se encuentran agrupados en los siguientes niveles de riesgo biolgico: Nivel 1: Agentes que presentan un riesgo de infeccin mnimo, tanto para el trabajador como para la comunidad. No existe enfermedad causada por ellos, o ha sido raramente descrita. Los microorganismos se clasifican generalmente como raramente patgenos. Nivel 2: Agentes que presentan un riesgo moderado para el trabajador (la enfermedad resulta de autoinoculaciones, ingestiones o exposiciones de membranas mucosas, o bien debido a inmunodepresin). Su diseminacin en el medio es poco probable y existe tratamiento preventivo contra la infeccin generada. Nivel 3: Agentes que producen enfermedad seria o potencialmente letal como resultado de su infeccin. Presentan un riesgo de transmisin elevado para el trabajador, pero bajo para la comunidad. Los agentes son patgenos estrictos. Nivel 4: Agentes que presentan un riesgo de infeccin elevado y frecuentemente mortal, tanto para el trabajador como para la comunidad. Se transmiten por va area. Generalmente no se dispone de tratamiento contra la infeccin.
1. 2. 3. 4.
Nivel 5: Agentes que significan un riesgo para el medio ambiente. El peligro es mayor para el medio ambiente que para el hombre. Su entrada a muchos pases esta prohibida por leyes fitozoosanitarias. 1.3.1 PRESCRIPCIONES OPERATIVAS DE SEGURIDAD BIOLGICA. Para cada uno de los cuatro niveles de riesgo biolgico mencionados, se han definido reglas que permiten al trabajador manipular los agentes patgenos en condiciones de seguridad. Estas reglas corresponden a cuatro niveles de seguridad biolgica. Para cada nivel de seguridad biolgica, se presentan cuatro elementos de reglamentacin, dos de los cuales se refieren a la infraestructura del laboratorio y los dos restantes describen las buenas practicas de laboratorio. Nota: El uso de volmenes superiores a 10lt se considera en las normas internacionales, como de gran escala, y queda regulado por lineamientos divididos en tres niveles que implican condiciones adicionales a las aqu descritas. Recientemente el Centro de Control y Prevencin de Enfermedades (CDC) y el Instituto Nacional de Salud (NIH) de E.U.A. publicaron lineamientos para el manejo seguro y efectivo de muestras biolgicamente peligrosas. La Sociedad Amricana de Microbiologa (ASM) adapt estos lineamientos y estableci algunos criterios de seguridad para los cuatro tipos de laboratorios clasificados por la OMS: Tipo 1, manejo de microorganismos de virulencia baja o de ninguna virulencia para los adultos sanos normales. (E. Boquet et a., 1998:111). Tipo 2, manejo de microorganismos patgenos para los humanos y que significan un peligro potencial moderado para el personal. (E. Boquet et a., 1998:111). Tipo 3, manejo de microorganismos altamente infecciosos que pueden causar enfermedades humanas generalizadas graves. (E. Boquet et a., 1998:111). Tipo 4, manejo de microorganismos de alto riesgo que pueden causar enfermedades que amenacen la vida y que, por lo tanto, requieren de un edificio aislado. (E. Boquet et a., 1998:111). 1.3.1.1 SEGURIDAD BIOLGICA NIVEL 1 (SBN 1) Instalaciones de laboratorio. SBN 1.1 El laboratorio debe contar con un lavamanos
SBN 1.2 El laboratorio debe estar diseado de tal manera que pueda limpiarse con facilidad. Los pisos de mosaico no son apropiados ya que impedir la descontaminacin despus de cualquier derrame o salpicadura. SBN1.3 Las mesas de trabajo deben ser impermeables al agua y resistentes a solventes orgnicos, cidos, lcalis y al calor moderado. SBN 1.4 Los equipos de laboratorio deben estar espaciados con fin de facilitar el acceso a las operaciones de limpieza, dicho acceso tampoco deber estar obstaculizado por materiales o cajas. Equipo especial para confinamiento. Batas, cofias y uniformes. Deben ser utilizados todo el tiempo dentro del laboratorio y esterilizados antes de ser enviados a las lavanderas Procedimiento estndares en SBN 1. SB 1.5 EL acceso al laboratorio debe ser controlado por el responsable del mismo. SB 1.6 Todos los trabajadores deben lavarse las manos despus de manipular material biolgico o animales, as como antes de salir del laboratorio. SB 1.7 No se permite comer, beber, fumar ni maquillarse dentro del rea de trabajo. Los alimentos deben de ser almacenados en lugares asignados nicamente para este propsito. SB 1.8 El pipeteo debe ser realizado con instrumentos mecnicos (propipeta, pipeta automtica) y nunca por medio de la boca. SB 1.9 Se debe tratar de reducir al mximo la produccin de aerosoles, evitando: agitaciones y pipeteo brusco, introduccin de asas de cultivo calientes dentro de medios de cultivo, etc. SB 1.10 Las reas de trabajo deben ser descontaminadas una vez al da, as como despus de cualquier derrame de material biolgico. SB 1.11 Los desechos slidos o lquidos con material biolgico deben ser descontaminados por medio de un procedimiento apropiado entes de ser eliminados (esterilizacin con autoclave o inmersin en desinfectante) SB 1.12 Es necesario el uso de batas con el fin de evitar contaminacin de ropa de calle. Est prohibido el uso de prendas de laboratorio en lugares como: oficinas administrativas, salas de reuniones o biblioteca. SB 1.13 Debe existir un programa de fumigacin peridica. 1.3.1.2 SEGURIDAD BIOLGICA NIVEL 2 (SBN 2) Instalaciones de laboratorio Los puntos 2.1 al 2.4 aplican de la misma manera que para el nivel de seguridad biolgica SBN1
SB 2.5 Si el laboratorio tiene ventanas abiertas, stas deben estar cubiertas con mosquiteros. SB 2.6 Debe contarse con un mtodo para la descontaminacin de desechos cerca del laboratorio (como autoclave o incinerador) Equipo especial para confinamiento SB 2.7 Gabinetes de seguridad biolgica. Todo procedimiento con potencial para crear aerosoles debe ser ejecutado dentro de gabinetes de seguridad biolgica. SB 2.8 La centrifugacin de grandes volmenes puede ser realizada fuera de gabinetes de seguridad, siempre que se usen rotores con canastillas hermticamente selladas o botellas de centrfuga con tapn de rosca, mismos que sern abiertos nicamente dentro del gabinete de seguridad. SB 2.9 Proteccin facial. Utilizada para prevenir el contacto con salpicaduras, cuando los microorganismos sean manipulados fuera del gabinete de seguridad. SB 2.10 Batas, cofias y uniformes. Deben ser utilizados todo el tiempo dentro del laboratorio y esterilizados antes de ser enviados a las lavanderas. SB 2.12 Guantes. Deben ser empleados al manipular animales infectados y cuando exista la posibilidad de contacto con materiales infectados, o con superficies o equipo contaminado. Procedimientos estndares en SBN 2 Aplican de la misma manera que para el nivel de seguridad biolgica SBN1 Procedimientos especficos en SBN 2 SB 2.21 Cuando se requiera precauciones especiales dentro del laboratorio, a causa del tipo de manipulacin que se realiza debe colocarse en la puerta de entrada un aviso con el smbolo internacional de riesgo biolgico y que indique el tipo de manipulacin, el microorganismo, el nombre del responsable del experimento y los requerimientos para entrar al laboratorio. SB 2.22 No se permite la presencia de animales o de plantas no relacionadas con el trabajo dentro del laboratorio. SB 2.23 Cuando ocurra la contaminacin de algn material o equipo de laboratorio, ste debe ser descontaminado de inmediato. SB 2.24 Un manual de bioseguridad debe ser seguido por el personal. Los miembros del laboratorio debern estar prevenidos sobre los riegos particulares a los que se exponen y seguir las instrucciones sobre las prcticas de laboratorio. En este manual no se describirn los niveles 3 y 4 para evitar una informacin demasiado amplia y debido a que en el laboratorio de Microbiologa Industrial no se trabajara con este tipo de microorganismos.
1.4 EMERGENCIA MDICA Procedimientos inmediatos: Mantenga la calma Iniciar medidas salvavidas si se requiere Llamar a los servicios de emergencia No mover a la persona lesionada a menos que est fuera de peligro Mantenga a la persona daada caliente 1.5 INCIDENTE MAYOR Procedimientos inmediatos: Atienda a la persona daada o contaminada y remuvala de la exposicin Alerte a la gente para evacuar el rea. Llame a los servicios de emergencia: Derrame de radiacin Derrame qumico Derrame biolgico Dao personal Incendios
Cierre las puertas del rea afectada Si tiene conocimiento personal del incidente asista al personal de emergencia. 1.6 DERRAME BIOLGICO Notas y precauciones: Derrame biolgico fuera de los gabinetes de seguridad biolgica genera aerosoles que pueden dispersarse en el aire a travs del laboratorio. Estos derrames son muy serios si se involucra microorganismos que requieren contenedores nivel 3 (BSL-3), ya que muchos de estos agentes tienen potencial de transmitirse por aerosoles. Para reducir el riesgo de inhalacin en tales accidentes, los ocupantes deben sostener la respiracin y salir inmediatamente. Al laboratorio no se debe volver a entrar pasados 30 min., despus de descontaminar y limpiar el derrame. Durante este tiempo los aerosoles deben ser removidos del laboratorio por el sistema de extraccin. Un equipo de proteccin apropiado es particularmente importante en la descontaminacin en derrames que involucran microorganismos que requieren contencin BLS-2 o BLS-3. Este equipo incluye bata de laboratorio con mangas largas, guantes disponibles, cubiertas para zapatos disponibles, proteccin a la cara completa o parcial con lentes. El uso de este equipo puede prevenir el
contacto con superficies contaminadas y proteger las mucosas y ojos de la exposicin de material salpicado. Derrames que involucran un microorganismo que requiere contencin BSL-1 Usar guantes protectores Remojar toallas de papel en desinfectante y colocarlas sobre el rea derramada Colocar las toallas en bolsas de plstico disponibles Limpiar el rea con toallas frescas empapadas en desinfectante Derrames que involucran a microorganismos que requieren contencin BSL-2 Alertar a la gente del rea inmediata al derrame. Ponerse un equipo protector. Cubrir el derrame con toallas de papel u otro material absorbente Cuidadosamente verter un preparado fresco 1:10 de blanqueador comercial alrededor de los bordos del derrame y dentro del derrame. Evitar salpicar. Dejar un periodo de 20 minutos en contacto con el derrame Usar toallas de papel para levantar el derrame, trabajando desde el bordo hacia el centro Limpiar el rea del derrame con toallas frescas humedecidas en desinfectante Colocar las toallas de papel en bolsas de plstico y descontaminar en una autoclave. Derrames que involucran a microorganismos que requieren contencin BLS-3 Atender a las personas daadas o contaminadas y removerlas de la exposicin Alertar a la gente para evacuar el laboratorio Cerrar las puertas del rea afectada Llamar al telfono de emergencias en Derrames biolgicos Si se tiene conocimiento del incidente asistir al personal de emergencias
Derrames que involucran a microorganismos que requieren contencin BLS-4 Se debe de hacer lo mismo que para BLS-3
1.7 EVALUACIN DEL RIESGO. Para que un microorganismo pueda llegar a ocasionar una enfermedad se requiere que reuna las condiciones siguientes: 1. Que exista el ambiente propicio. 2. Que estn vivos. 3. Que sean virulentos (que sean capaces de provocar una enfermedad infecciosa). 4. Que se encuentren en una cantidad o dosis suficiente. 5. Que encuentren una va de ingreso al cuerpo de los individuos expuestos. 6. Que los individuos infectados tengan debilitados sus mecanismos de defensa habituales para combatir a los agentes infecciosos (por ej. fiebre, inflamacin, clulas fagocitarias o que devoran a los microbios y anticuerpos) (Torres-Rojas et al., 2006). Para evaluar el riesgo de exposicin a los diferentes agentes qumicos, fsicos y biolgicos es necesario conocer los valores del nivel de presencia del agente en el medio ambiente de trabajo y el tiempo de exposicin del trabajador a los mismos y comparar este dato con otro, llamado criterio de valoracin o valor lmite. Si este valor lmite es superado, la salud de los trabajadores puede encontrarse en peligro (Ramn Borderia., 2004:84). 1.8 TRATAMIENTO DE RESIDUOS BIOLGICO-INFECCIOSOS De acuerdo con lo establecido en la Norma Oficial Mexicana NOM-087SEMARNAT-SSA1-2002, son considerados como residuos biolgico-infecciosos todos los cultivos y cepas generadas en el laboratorio. 3.1 Agente biolgico-infeccioso: Cualquier microorganismo capaz de producir enfermedades cuando est presente en concentraciones suficientes (inculo), en un ambiente propicio (supervivencia), en un hospedero susceptible y en presencia de una va de entrada. Los materiales o residuos peligrosos biolgico-infecciosos generados en el laboratorio de microbiologa industrial de la carrera de Qumica Industrial en la FES-Cuautitlan, sern tratados mediante mtodos fsicos o qumicos, de conformidad con el punto No. 6.5 de la Norma Oficial Mexicana NOM-087SEMARNAT-SSA1-2002. 1. Los mtodos utilizados para el tratamiento de residuos peligrosos biolgicoinfecciosos deben garantizar la eliminacin de microorganismos patgenos y no patgenos. 2. El tratamiento deber realizarse dentro de las instalaciones del laboratorio designado para esta materia en esta Facultad o en instalaciones especficas fuera del mismo. 6. Los tratamientos recomendados para cada tipo de residuo biolgico-infeccioso sern de acuerdo a la tabla 1.
Tabla1. Tratamiento de los residuos biolgico Infecciosos. TIPO DE RESIDUO ESTADO FSICO Residuos de cultivos y cepas de agentes Slido infecciosos: los cultivos generados en los procedimientos de diagnstico e investigacin y los generados en la Liquido produccin, as como los utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes biolgico-infecciosos. El material que ha estado en contacto con Slidos muestras biolgicas durante el diagnstico deber desinfectarse o esterilizarse antes de Liquido ser dispuesto como residuo municipal.
TRATAMIENTO Incineracin esterilizacin Esterilizacin
Desinfeccin o esterilizacin Esterilizacin
Los cdigos para identificar los residuos peligrosos biolgico-infecciosos generados en el laboratorio, sern los indicados en las Normas Oficiales Mexicanas NOM-052-ECOL-1993 y NOM-053-ECOL-1993, anotando la clave S.S y el tipo de residuo cuando no exista el cdigo de algn residuo, la cantidad de los residuos generados (gramos, kilogramos, etc) y la clave CRETIB para los residuos biolgico infecciosos ser la letra B. 1.9 CONCLUSIONES __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
PRACTICA # 2. MICROSCOPIA 2.1 OBJETIVO. Al concluir la prctica el alumno conocer las partes y funciones de los componentes de un Microscopio compuesto para darle el uso adecuado a este instrumento. Podr definir el trmino de magnificacin total, poder de resolucin, distancia de trabajo y apertura numrica. 2.2 INTRODUCCIN Desde la primera observacin de microbios por el holands Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723) en 1680, el microscopio ha asumido un papel central en la microbiologa (Susan G. Kelley et al., 1991:1). La microbiologa sostiene como base fundamental la necesidad de un microscopio para observar los organismos involucrados en un estudio de investigacin o de diagnstico. Existen muchos tipos de microscopios: ptico, contraste de fases, interferencia, electrnico, fluorescencia y otros que difieren desde su manera de construccin como en los detalles de operacin (Susan G. Kelley et. al., 1991:2). 2.3 MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO. El microscopio ordinario se denomina de campo claro por que forma una imagen oscura frente a un fondo claro. Este microscopio (Figura 1) est formado por un cuerpo o soporte de metal compacto, compuesto por una base y un brazo, donde se fija el resto de las partes. En la base hay una fuente de luz, espejo o iluminador elctrico. En el brazo hay dos dispositivos para enfocar, de ajuste fino y grueso, que pueden mover la platina o el portaobjetivos para enfocar la imagen. La platina est situada hacia la mitad del brazo, donde se colocan los portaobjetos, sujetados con pinzas sencillas o con pinzas de platina mecnica. Una platina mecnica permite mover el portaobjetos lentamente durante la observacin, utilizando los dispositivos de control de la platina. El condensador se monta dentro o por debajo de la platina y enfoca un cono de luz sobre el portaobjetos. La parte curvada superior del brazo soporta el conjunto del cuerpo del microscopio, al que se ajustan un portaobjetivos y uno o ms oculares. El portaobjetivos sostiene de tres a cinco objetivos con lentes con poder de aumento diferente. Idealmente un microscopio debe ser parafocal, es decir, que mantenga la imagen enfocada al cambiar el objetivo (Lansing M. Prescott et al., 2000:19).
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Figura 1. Componentes de un Microscopio ptico de luz 1) Base, 2) Control de intensidad de luz, 3) Condensador 4) Control del diafragma de apertura del condensador, 5) Tornillo de centradi del condensador, 6) Oculares, 7) Anillo de control de la fuente del diafragma, 8) Lente de campo, 9) Tornillo macromtrico (enfoque), 10) Tornillo micromtrico (ajuste), 11) Escala de distancia interpupilar, 12) Objetivos, 13) Interruptor, 14) Revolver, 15) Sujetador de portaobjetos 16) Platina, 17) Desplazador de la platina en el eje X, 18) Desplazador de la platina en el eje Y. (Kathy Barrer, 1998:410)
Las partes del microscopio pueden clasificarse en: a) b) c) d) Sistema Sistema Sistema Sistema de soporte: Pie, Brazo, Revolver, Portaobjetitos, Platina. ptico de iluminacin de ajuste
Para entender el funcionamiento de un microscopio es necesario conocer los siguientes trminos: MAGNIFICACIN: La magnificacin resulta del uso de uno o ms lentes. Los lentes oculares magnifican la imagen real produciendo una imagen virtual vista por el ojo. La magnificacin de un lente se expresa usualmente en dimetro del incremento aparente en tamao o poder, 10X es entonces 10 veces el tamao incrementado o se dice que tiene un poder de 10 (Susan G. Kelley etal., 1991:2) APERTURA NUMRICA: Esta relacionada con el poder de resolucin de los lentes. La cantidad mxima de luz entrante a un lente es una funcin del ndice ms bajo de refraccin del material entre el objeto y los lentes y se expresa como: NA = n sen Donde n es el ndice de refraccin entre el objetivo y los lentes y es el ngulo entre el extremo del rayo y el eje de la luz entrante al objetivo. (Figura 2) (Susan G. Kelley etal., 1991:2)
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La apertura numrica (n sen) resulta un poco difcil de comprender. Theta se define como la mitad del ngulo del cono de la luz que entra en un objetivo. El ndice de refraccin del aire es de 1.0. Como sen no puede ser superior a 1 (el mximo de es 900 y el seno de 900 es 1.0), ninguna lente que funcione en el aire puede tener una apertura numrica superior a 1.0 (Figura 2). La nica forma de incrementar por arriba de 1.0 y conseguir, con ello, una resolucin mayor, es aumentando el ndice de refraccin con aceite de inmersin, un lquido incoloro con el mismo ndice de refraccin del vidrio (Lansing M. Prescott et al., 2000:20).
Figura 2. Principio de la apertura numrica, donde a y b representan los rayos de luz, y c, la fuente luminosa (Susan G. Kelley et al., 1991:2)
De esta manera, para poder entender cmo funciona un microscopio ptico, es preciso entender la forma en que las lentes desvan y enfocan la luz para formar imgenes. Cuando un rayo de luz pasa de un medio a otro se produce refraccin, es decir, el rayo se desva entre la interfase. El ndice de refraccin es una medida de la intensidad con que una sustancia disminuye la velocidad de la luz; la direccin y la magnitud de la desviacin se determinan por los ndices de refraccin de los dos medios que forman la interfase (Lansing M. Prescott et al., 2000:18). Las lentes actan como un conjunto de prismas que funcionan como una unidad. Cuando la fuente de luz est alejada, de forma que los rayos de luz inciden paralelos sobre la lente, una lente convexa enfocar estos rayos en un punto especfico, el punto focal. La distancia entre el centro de la lente y el punto focal se denomina distancia focal (Lansing M. Prescott et al., 2000:18).
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La distancia de trabajo es el espacio ente el objetivo y la muestra, disminuye cuando la distancia focal disminuye Figura 3. (Harry W. Seeley et al., 1991:1) El poder de resolucin o capacidad de distinguir dos objetos cercanos como entidades diferentes depende de la calidad de las lentes. As, como el mismo aumento total, los objetos pueden estar no resueltos, parcialmente resueltos o resueltos. As una resolucin de 0.2 m es mejor que una resolucin de 1 m. (Lansing M. Prescott et al., 2000:20, Cook., 2006: 300). El lmite de resolucin o distancia mnima a la cual dos objetos pueden estar separados para ser percibidos como objetos distintos depende de la longitud de onda de la luz usada. El aumento total (AT) que se puede alcanzar en un microscopio compuesto depende de la combinacin del ocular y objetivo que se utilice segn la relacin: AT= A. del objetivo * A. del ocular Los objetivos ms usados en un microscopio ptico son de 10X, 40X, 44X y 95 o 100X. Usando un ocular 10X, la magnificacin total ser de 100X, 400X y 9501000X (Harry W. Seeley et al., 1991:1).
Figura 3. El principio de disminucin de refraccin de la luz por aceite de inmersin. A: Cinco rayos de una fuente P hacia un objeto pasan a travs del porta objetos hacia el aire entre el porta objetos y el lente. Slo dos rayos pueden entrar al objetivo. B: El espacio del aire es remplazado por aceite con el mismo ndice de refraccin del vidrio. Ms rayos de la fuente P pueden pasar ahora hacia el lente sin desviarse. El NA es entonces incrementado por el factor n, el ndice de refraccin del aceite. C: Comparacin de las aperturas anulares de un objetivo seco fuerte y un objetivo de aceite de inmersin (Harry W. Seeley et al., 1991:3, Bancroft et al., 2008:38).
2.3.1 CUIDADOS DEL MICROSCOPIO
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1.- El microscopio compuesto debe transportarse sujetndolo firmemente del brazo y de la base pie. 2.- Colocar cuidadosamente el microscopio en la mesa de trabajo asegurndose que no existan vibraciones en ella. 3.- Limpiar cuidadosamente el microscopio en el siguiente orden: a) Sistema mecnico.- con un trapo que no desprenda pelusa. b) Sistema ptico.- Ocular, Objetivos y Condensador, con papel seda. 2.3.2 MANEJO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO 1.- Iluminacin del campo visual Conectar el microscopio a la fuente de corriente elctrica y encienda la lmpara. Abrir o cerrar el diafragma para mejorar el enfoque de la muestra. Subir o bajar el condensador hasta observar, a travs del ocular, un disco luminoso uniforme. 2.- Colocar cuidadosamente la preparacin sobre la platina, sujetar con las pinzas. 3.- Enfoque de la preparacin. Utilizando el objetivo de menor aumento, y con ayuda del tornillo macromtrico, enfoque cuidadosamente la preparacin. Ajustar el enfoque moviendo lentamente el tornillo micromtrico. Repetir el enfoque de su preparacin utilizando el objetivo de 40X y despus el de mayor aumento. Para enfocar el objetivo de 100X coloque cuidadosamente una pequea gota de aceite de inmersin sobre su preparacin sin tocar la punta del gotero. 4.- Examinar las preparaciones proporcionadas 5. RETIRAR CUIDADOSAMENTE SU PREPARACIN, DESCONECTAR Y LIMPIAR LAS PARTES DEL MICROSCOPIO DE ACUERDO AL PUNTO (1) CUIDADOS DEL MICROSCOPIO. 2.4 DISCUSIN __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
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__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2.5 CONCLUSIONES __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ PRCTICA # 3. TINCIONES 3.1 OBJETIVO. Al finalizar la prctica el alumno podr aplicar una tcnica de tincin simple o diferencial para la identificacin de diferentes microorganismos, conocer la metodologa de preparacin de la muestra, as mismo identificara estructuras celulares en base al fundamento de cada colorante. Al finalizar la prctica el alumno podr realizar diversas tinciones diferenciales, para distinguir a las bacterias en base a sus caractersticas morfolgicas. 3.2 INTRODUCCIN Aunque el microscopio revelo a Leeuwenhoek un mundo nuevo de animaculos, este trabajo permaneci invisible funcionalmente hasta que las tcnicas de tincin se desarrollaron para distinguir los organismos del ambiente (Susan G. Kelley et al., 1991:105) Los numerosos tipos de colorantes utilizados para teir microorganismos poseen dos caractersticas en comn: 1) todos poseen grupos cromforos (portador del color), grupos con enlaces dobles conjugados que dan color, 2) y un auxocromo (aumentador del color) parte de la molcula que puede unirse a las clulas mediante enlaces inicos, covalentes o hidrfobos (Lansing M. Prescott et al., 2000:26). Los colorantes se han clasificado en cidos y bsicos, dependiendo si el grupo cromforo es un anin o un catin (Susan G. Kelley et al., 1991:105). Los colorantes cidos, como la eosina, rosa de bengala y fucsina cida, son aminocidos o poseen grupos cargados negativamente, como carboxilos (-COOH) e hidroxilos fenlicos (-OH). Los colorantes cidos, debido a su carga negativa, se unen a estructuras cargadas positivamente (Lansing M. Prescott et al., 2000:26)
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Los colorantes bsicos, como el azul de metileno, fucsina bsica, cristal violeta (violeta de genciana), safranina, verde de malaquita, son catinicos o tienen grupos cargados positivamente (normalmente alguna forma de nitrgeno pentavalente) y se comercializan generalmente como sales de cloruro. Los colorantes bsicos se unen a molculas cargadas negativamente, como cidos nucleicos y muchas protenas. Como las superficies de las bacterias estn cargadas negativamente, estos colorantes se emplean a menudo en bacteriologa (Lansing M. Prescott et al., 2000:26, Lois Beishier, 1996: 212). Los componentes aninicos incluyen los grupos fosfato de los cidos nucleicos, los grupos sulfato de los glucosaminoglucanos y los grupos carboxilo de las protenas, estos ltimos se pueden ionizar cargando la superficie de la bacteria negativamente (Lois Beishier, 1996:212). La capacidad que poseen estos grupos aninicos de reaccionar con un colorante bsico se denomina basfilia. Se dice que los componentes tisulares que se colorean con la hematoxilina exhiben basofilia. La reaccin de los grupos aninicos vara con el pH. En consecuencia: A un pH alto (alrededor de 10), los tres grupos estn ionizados y disponibles para reaccionar con el colorante bsico por medio de uniones electrostticas. A un pH ligeramente cido o neutro, se ionizan los grupos sulfato y fosfato, que quedan disponibles para reaccionar con el colorante bsico por medio de uniones electrostticas. A un pH bajo (menor de 4), slo los grupos sulfato permanecen ionizados para reaccionar con las anilinas bsicas. Se pueden usar las tinciones con colorantes bsicos a pH controlados para centrar el estudio en grupos aninicos especficos, y dado que estos aniones especficos predominan en ciertas macromolculas, la tincin sirve como un indicador de estas macromolculas Colorantes cidos. La reaccin de los grupos catinicos con un colorante cido se denomina cidofilia. Las reacciones de los componentes celulares y tisulares con colorantes cidos no son tan especficas ni precisas como las reacciones con colorantes bsicos. Los colorantes cidos tales como la fucsina y eosina tienen una fuerte afinidad por las porciones bsicas de las clulas, entre ellos los componentes del citoplasma que son alcalinos (Lois Beishier, 1996:212). Si bien la unin electrosttica constituye el principal factor en la unin primaria del colorante con el tejido, no es el nico y por lo tanto los colorantes cidos a veces se emplean combinados para colorear en forma selectiva distintos componentes de los tejidos.
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3.3 TINCIN DIFERENCIAL Los mtodos de tincin diferencial clasifican a las bacterias en grupos diferentes segn sus propiedades de tincin. Una tincin simple trabaja debido a que las clulas bacterianas difieren qumicamente de su alrededor y de esta manera se pueden teir para contrastar con el medio ambiente. (Harry W. Seeley et al., 1991:65). 3.3.1 TINCIN DE GRAM Los microorganismos difieren qumica y fsicamente unos de otros y por ello pueden reaccionar de manera diferente a un procedimiento de tincin. Este es el principio bsico de una tincin diferencial. (Susan G. Kelley et al., 1991:113, Harry W. Seeley et al., 1991:65). Uno de los principales problemas para identificar a los microorganismos fue su tamao y falta de coloracin al microscopio. El problema fue resuelto por Hans Christian Gram, patlogo dans que en 1884 introdujo un colorante de contraste despus de la decoloracin (Lansing M. Prescott et al., 2000:26). Las bacterias teidas por esta coloracin se dividen en dos grupos: las que retienen el violeta de genciana o cristal violeta o Gram positivas (Figura 5) y las que se decoloran con el decolorante y se tien con el colorante de contraste (generalmente de color rojo como la safranina o la fucsina bsica aunque puede usarse verde de malaquita para los observadores daltnicos) o Gram negativas (Figura 6). La diferente afinidad tintorial se debe a las diferencias en la estructura de la pared celular. Las bacterias Gram positivas tienen una pared compuesta principalmente de una capa de peptidoglicano relativamente gruesa (20-80nm). En cambio, las Gram negativas tienen una capa de peptidoglicano delgada (510nm) adems de una membrana externa constituida de fosfolpidos y lipopolisacarido. (Lansing M. Prescott et al., 2000:33). La diferenciacin de Gram se basa en la aplicacin de una serie de cuatro reactivos qumicos: colorante primario, mordiente, decoloracin y un colorante de contraste. (Susan G. Kelley et al., 1991:113) Durante la tincin de Gram, ambos grupos de bacterias se tien con el colorante primario (cristal violeta) y mordiente (Yodo) que aumenta la unin entre el cristal violeta y su sustrato formando un complejo. El complejo colorante-mordiente es atrapado dentro de la clula por las Gram positivas, por la deshidratacin y la porosidad reducida de la gruesa pared la solucin decolorante de alcohol-acetona no puede extraer el complejo. En cambio, en las Gram negativas la delgada capa de peptidoglicano no impide la extraccin del complejo colorante-mordiente en la decoloracin. El colorante secundario (safranina) es aplicado y tomado
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solamente por los organismos que previamente se decoloraron (las Gram negativas) (Susan G. Kelley et al., 1991:113, Lois Beishir, 1996:218)
Figura 5. Morfologa de un bacilo gram negativo (tincin de gram).
Figura 6. Morfologa de un coco gram positivo (tincin de gram).
Recuerde, la diferenciacin entre una bacteria gram positiva y una negativa esta basada en la velocidad de la cual las bacterias liberan el cristal violeta, un gran nmero de factores pueden influir en el resultado de la tincin de Gram entre ellos: * Una inapropiada fijacin con calor, si el frotis se calienta demasiado las paredes celulares pueden sufrir ruptura, causando que las bacteria gram positivas liberen el cristal violeta (Lois Beishir, 1996:218). * La densidad celular del frotis. Un frotis demasiado grueso no se decolora lo suficientemente rpido comparado con una frotis de densidad ordinaria (Lois Beishir, 1996:218). * La concentracin y tiempo de preparacin de los colorantes (Lois Beishir, 1996:218) * La fuerza de aplicacin de los lavados, la cantidad de agua presente en el frotis cuando se agrega el lugol (Lois Beishir, 1996:218) * La naturaleza, concentracin y cantidad de decolorante aplicado (Lois Beishir, 1996:218) * La edad del cultivo bacteriano, cultivos de no ms de 24 horas son apropiados para leer una tincin de gram, cultivos ms viejos estn relacionados con la integridad y permeabilidad de la membrana (Lois Beishir, 1996:218)
3.3.1.1 MATERIAL Cultivos de 18-24 horas de E.coli, Staphylococcus aureus, C. albicans. 3 Porta objetos por equipo
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1 tren de tincin de Gram 1 frasco gotero con Cristal violeta con 5mL por equipo 1 frasco gotero con lugol con 5mL por equipo 1 frasco gotero con Safranina con 5mL por equipo 1 frasco gotero con Alcohol-acetona con 5mL por equipo 1 Microscopio ptico por equipo 2 Mecheros por equipo Desinfectante por equipo 1 Tubo con agua destilada estril por equipo Papel seda por equipo 1 asa bacteriolgica individual 1 frasco gotero con 3mL de aceite de inmersin por grupo 3.3.1.2 METODOLOGA 1. Limpie los oculares y objetivos del microscopio 2. Desengrase los portaobjetos a utilizar limpindolos con alcohol varias veces. 1.- METODOLOGA PARA LA TINICIN DE GRAM 1.- Etiquete su portaobjetos con la(s) muestra(s) de las cepas que utilizara. 2.- Coloque una gota de agua estril por muestra en un portaobjetos limpio. 3.- Con el asa bacteriolgica previamente flameada tome un pequeo inoculo de la cepa(s) proporcionada(s) y mezcle con el agua del portaobjetos. 4.- Fije el frotis con calor. 5.- Reesterilice al asa bacteriolgica utilizada. 6.- Cubra el frotis con la solucin de cristal violeta y djelo durante un minuto, escurra el colorante y lave el frotis con un chorro de agua. 7.- Cubra el frotis con lugol y djelo actuar durante un minuto, escurra y lave al chorro de agua. 8.- Decolore el frotis con solucin de alcohol-acetona durante 5 a 15 segundos, siguiendo las instrucciones del profesor, lavar con agua corriente. 9.-Cubra el frotis con safranina y djela actuar durante un minuto, escurra y enjugue con agua corriente. 10.- Deje secar al aire el frotis. 11.- Observe la(s) preparaciones al microscopio, utilizando los diferentes objetivos. Al visualizar con el objetivo de 100X agregu previamente una gota de aceite de inmersin. 12.- Realice el mismo procedimiento con cada una de las cepas proporcionadas.
3.3.1.3 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre: _________________________ Fecha: ______ Materia:______________
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Organismo____________ _____________ Morfologa_____________ Morfologa_____________ Objetivo_______________ Objetivo_______________ Tincin________________ Tincin________________
Organismo________________ Morfologa________________ Objetivo__________________ Tincin___________________
Organismo
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3.3.1.4 DISCUSIN __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 3.3.1.5 CONCLUSIONES __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
3.3.2. TINCION NEGATIVA La cpsula bacteriana es un limo excretado, habitualmente un polisacrido soluble en agua no inica, aunque en el caso de Bacillus antharacis consiste en un polipptido del cido D glutmico (Lansing M. Prescott et al., 2000:59, Lois Beishir, 1996:228). El glucocalix es el trmino general que define cualquier red de polisacridos que se extiende desde la superficie de las bacterias y otras clulas. Las clulas encapsuladas forman colonias lisas y mucoides, mientras que las clulas no capsuladas producen colonias rugosas (Lansing M. Prescott et al., 2000:59). A lo largo del avance en la microbiologa, se han desarrollado numerosos mtodos de tincin para estudiar estructuras bacterianas especficas en el microscopio ptico. Uno de los ms sencillos es la tincin negativa, tcnica que revela la presencia de cpsulas difusas alrededor de muchas bacterias (Figura 7). Debido a que la capsula comnmente aparece como zonas sin teir en clulas teidas, se puede confundir con artefactos sin teir presentes en el frotis (Harry W. Seeley et al., 1991:71)
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Figura 7. Tincin de capsula de Klebsiella pneumoniae (Robert A Pollack etal., 2005:Atlas5) 3.3.2.1 MATERIAL Cultivos de 18-24 horas de Klebsiella pneumoniae, E. coli y Staphylococcus aureus. 1 Asa bacteriolgica individual 3 Portaobjetos por equipo 3 Cubreobjetos por equipo 2 Mecheros por equipo 1 frasco gotero de tinta china por equipo 1 microscopio ptico por equipo 1 Tubo de agua estril con 10mL por equipo Papel ceda por equipo Desinfectante por equipo 3.3.2.2 METODOLOGA 1.- Coloque una gota de tinta china en un portaobjetos limpio. 2.- Con el asa bacteriolgica previamente flameada, ponga una pequea cantidad de muestra de la bacteria. 3.- Flamee nuevamente el asa utilizada 4.- Realice un frotis homogenizando la muestra de la bacteria con la tinta. 5.- Coloque un cubreobjetos. 6.- Observe al microscopio, primero con el objetivo de 10X, y cambie de objetivo una vez enfocado al de 40X 7.- Para observar en el objetivo de 100X panga una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin antes de utilizar el objetivo 8.- Realice sus anotaciones 9.- Limpie el microscopio al finalizar la prctica. NOTA: La cpsula se observara como un halo transparente, en tanto el fondo del frotis se observara negro.
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3.3.2.3 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre: _________________________ Fecha: ____________ Materia: __________________
Organismo____________ Organismo_____________ Morfologa_____________ Morfologa_____________ Objetivo_______________ Objetivo_______________ Tincin________________ Tincin________________
3.3.2.4 DISCUSIN __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
3.3.2.5 CONCLUSIONES. __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
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__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 3.3.3.- TINCION DE ESPORAS (Schafer y Fulton). Diversas bacterias gram positivas pueden formar una estructura especial inactiva, de resistencia a altas temperaturas, radiacin, desecacin y agentes qumicos como desinfectantes denominada endospora (Lois Beishir, 1996:234). La espora est a menudo rodeada por una capa delicada y delgada, denominada exosporio. La cubierta de la espora se encuentra debajo del exosporio y est compuesta por varias capas de protenas, pudiendo ser bastante gruesa. El crtex, que puede ocupar tanto como la mitad del volumen celular, descansa debajo de la cubierta de la espora. La pared celular de la espora se encuentra debajo del crtex. El protoplasto contiene las estructuras celulares normales como ribosomas y un nucleoide. An no se ha determinado por qu la endospora es tan resistente al calor y a otros agentes letales. Aproximadamente el 15% del peso seco de la espora consiste en cido dipicolnico, que forma complejos con iones calcio. Desde hace mucho tiempo se ha credo que el cido dipicolnico era responsable directo de la resistencia al calor de las esporas, pero recientemente se han aislado mutantes termorresistentes que carecen de cido dipicolnico. Las esporas se observan de la manera ms simple como cuerpos refringentes intracelulares, o bien liberadas de la sustancia vegetativa de la clula. A diferencia de la clula vegetativa que la produce, la espora es muy resistente y pueden sobrevivir largos periodos de tiempo, esporas viables se han aislado de hasta 3,000 aos de edad de archeobacterias (Lois Beishir, 1996:234), los principales microorganismos esporulado son Clostridium y Bacillus (Lois Beishir, 1996:234, Harry W. Seelet etal., 1991:71). Dado que las endoesporas resisten tinciones y los procesos de decoloracin, este mtodo de tincin usa estas caractersticas para la observacin en el microscopio, la tincin de verde de malaquita utiliza el colorante caliente, una tincin intensa que no es removida de la endospora por los lavados siguientes, usando safranina como contraste, de esta manera la endospora se tie de verde y la bacteria de rojo (Harry W. Seelet etal., 1991:71). Figura 8
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Figura 8. Tincin de Espora de Bacillus subtilis (Espora en verde y bacteria roja)
3.3.3.1 MATERIAL Cultivos de 18-24 horas de E.coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtillis 1 Asa bacteriolgica individual 3 Portaobjetos por equipo 2 Mecheros por equipo 1 microscopio ptico por equipo 1 Tubo de agua estril por equipo Papel seda por equipo Desinfectante por equipo 1 frasco gotero con aceite de inmersin por grupo 1 frasco con 50mL de verde de malaquita por grupo 1 frasco gotero con 10mL de safranina por grupo 3.3.3.2 METODOLOGA 1. Coloque en un porta objetos limpio una gota de agua estril. 2. Con el asa bacteriolgica previamente flameada, ponga una pequea cantidad de muestra de la bacteria 3. Flamee nuevamente el asa bacteriolgica utilizada 4. Realice un frotis. 5. Fije con calor 6. Cubra el frotis con Verde de Malaquita durante 10min. 7. Lave con agua corriente por 30 seg. 8. Agregu safranina durante 2 min. 9. Lave con agua corriente deje secar el frotis y observe al microscopio, primero con el objetivo de 10X, y cambie de objetivo una vez enfocado al de 40X 10. Para observar en el objetivo de 100X panga una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin antes de utilizar el objetivo. 11. Realice sus anotaciones 12. Limpie el microscopio al finalizar la prctica. NOTA: Las esporas se teirn de color verde dentro de las clulas y el resto de la clula se observara roja.
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Si su muestra esta en medio lquido coloque una gota de la suspensin, realice un frotis, fije con calor y prosiga como la indica el paso 5.
3.3.3.3 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre:_________________________ Fecha:____________ Materia:__________________
Organismo____________ Organismo________________ Organismo_____________ Morfologa_____________ Morfologa________________ Morfologa_____________ Objetivo_______________ Objetivo__________________ Objetivo_______________ Tincin________________ Tincin___________________ Tincin________________ 3.3.3.4 DISCUSIN __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________
3.3.3.5 CONCLUSIONES __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
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__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ ____________________________________________
3.3.4. TINCION ACIDO-ALCOHOL RESISTENTE (Ziehl-Neelsen) La tincin de Ziehl-Neelsen es un tipo de coloracin diferencial que fue desarrollado inicialmente por Paul Ehrlich en 1882 para poner de manifiesto la presencia de bacilos causantes de tuberculosis en muestras clnicas de pacientes con est enfermedad (Lois Beishir, 1996:252). La tcnica de tincin de Ziehl-Neelsen en la cual el reactivo primario es carbolfucsina es ms estable que el reactivo de Erlichs y aprovecha las cualidades peculiares de las bacterias Mycobacterium y Nocardia que no son decolorados por soluciones de alcohol cido al 3% (Lois Beishir, 1996:252) (Figura 9). Las bacterias que resisten la decoloracin por alcohol cido, se denominan bacilos cido alcohol resistente (BAAR). Los gneros mencionados presentan en su estructura un alto contenido de cidos grasos de cadena muy larga constituidos en ceras y cidos miclicos y nocrdicos, respectivamente. Estas ceras parecen jugar un papel muy importante en la respuesta da las bacterias a la coloracin. Se ha postulado que el alto contenido de cidos grasos interviene decisivamente en la coloracin ya que al calentar la preparacin con el colorante primario hasta emisin de vapores, por un lado se favorece la fusin de ceras, y por otro lado, aumenta la energa cintica de las molculas, ambos fenmenos facilitan la penetracin del colorante a la clula, al suspender el calentamiento y lavar con agua fra se provoca la solidificacin de las ceras de modo que el colorante ya no puede salir. Puesto que el proceso de decoloracin es muy enrgico, cualquier bacteria que no contenga abundantes lpidos como los de Mycobacterium y Nocardia perder fcilmente el colorante primario durante la decoloracin y tomar a su vez el colorante de contraste.
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Figura 9. Tincin cido alcohol resistente de Mycobacterium smegmatis (Robert A Pollack etal., 2005:Atlas3) 3.3.4.1 MATERIAL Cultivos de 18-24 horas de Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatis y Escherichia coli. 3 Porta objetos 1 frasco gotero con 5mL de Fucsina bsica fenicada por equipo 1 frasco gotero con 5mL de Azul de metileno Loeffer por equipo 1 frasco gotero de alcohol-cido con 5mL por equipo 1 Microscopio ptico por equipo 1 asa bacteriolgica individual 2 Mecheros por equipo Desinfectante por equipo 1 Tubo con 10mL de agua destilada estril por equipo 1 frasco gotero con 3mL de aceite de inmersin por grupo 3.3.4.2 METODOLOGA. 1.- Etiquete su cubreobjetos con la(s) muestra(s) de las cepas que utilizara 2.- Coloque una gota de agua estril por muestra en un portaobjetos limpio. 3.- Con el asa bacteriolgica previamente flameada tome un pequeo inoculo de la cepa(s) proporcionada(s) y mezcle con el agua del portaobjetos. 4.- Fije el frotis con calor. 5.- Reesterilize al asa bacteriolgica utilizada. 6.- Cubra el frotis con fucsina fenicada caliente durante 5-10min (utilizar un trozo de papel filtro sobre el frotis), evitando la evaporacin. (Figura 10)
Figura 10. Tincin Ziehl-Neelsen
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7.- Aplique alcohol-cido durante algunos segundos. 8.- Lave con agua corriente por 30 seg. 9.- Aplique azul de metileno durante 1 min. 10.- Lave con agua corriente y deje secar al aire el frotis. 11.- Observe la(s) preparaciones al microscopio, utilizando los diferentes objetivos. Al visualizar con el objetivo de 100X agregu previamente una gota de aceite de inmersin. 12.- Realice el mismo procedimiento con cada una de las cepas proporcionadas. 13.- Realice sus anotaciones 14.- Limpie el microscopio al finalizar la prctica.
3.3.4.3 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre: _________________________ Fecha: ____________ Materia: __________________
NOTA: Las bacterias cido-alcohol resistentes presentaran una coloracin roja, en tanto las bacterias negativas a seta tincin presentaran la coloracin del colorante de contraste. 3.3.4.3 DISCUSIN __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
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__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
3.3.4.5 CONCLUSIONES __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
3.3.5 TINCION DE FLAGELOS El areglo y forma de los falgelos en clulas bacterianas son de considerable importancia taxonmica y juegan unpapel importante en la quimiotaxiss y fototaxis. Las especies bacterianas difieren a menudo claramente por sus modelos de distribucin de flagelos. Las bacterias montricas tienen un solo flagelo; si se sita al final se denomina flagelo polar. Las bacterias anftricas tienen un nico flagelo en cada polo. Por el contrario, las bacterias loftricas poseen un grupo de flagelos en uno o ambos extremos. (Susan G. Kelley et al., 1991:133). Los flagelos se distribuyen uniformemente sobre toda la superficie en las bacterias pertricas (Lansing M. Prescott et al., 2000:60). Estudios con el microscopio electrnico de transmisicin han demostrado que el flagelo est compuesto por 3 partes: 1) la parte ms larga y manifiesta es el filamento, que se extiende desde la superficie celular hasta la punta. 2) El cuerpo basal est embebido en la clula y 3) el gancho, un segmento curvado y corto, une al filamento al cuerpo basal y acta como acoplamiento flexible. El filamento es un cilindro rgido y hueco constituido por la polimerizacin de una protena sencilla, denominada flagelina (Lansing M. Prescott et al., 2000:61). Esta tcnica de tincin utiliza un colorante y un mordiente los cuales bajo condiciones adecuadas de electrolitos, forman un complejo que permite que el flagelo se observe ms grueso y pueda ser visualizado en el microscopio (Susan G. Kelley et al., 1991:133). Figura 11.
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Figura 11. Bacilo con flagelo montrico .
3.3.5.1 MATERIAL Cultivos de 18-24 horas de Bacillus subtilis, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosas. 3 Porta objetos por equipo 1 frasco gotero con 5mL de Fucsina bsica por equipo 1 frasco gotero con 5mL de Azul de metileno Loeffer por equipo 1 frasco gotero con 5mL de alcohol-cido por equipo 1 Microscopio ptico por equipo 2 Mecheros por equipo Desinfectante por equipo 1 Tubo con 10mL de agua destilada estril por equipo 1 frasco gotero con 3mL de aceite de inmersin por grupo 1 asa bacteriolgica individual
3.3.5.2 METODOLOGA. 1.- Etiquete su cubreobjetos con la(s) muestra(s) de las cepas que utilizara 2.- Coloque una gota de agua estril por muestra en un portaobjetos limpio. 3.- Con el asa bacteriolgica previamente flameada tome un pequeo inoculo de la cepa(s) proporcionada(s) y mezcle con el agua del portaobjetos. 4.- Fije el frotis con calor. 5.- Reesterilize al asa bacteriolgica utilizada. 6.- Cubra el frotis con fucsina bsica 8.- Lave con agua corriente por 30 seg. 9.- Aplique azul de metileno durante 1 min. 10.- Lave con agua corriente y deje secar al aire el frotis. 11.- Observe la(s) preparaciones al microscopio, utilizando los diferentes objetivos. Al visualizar con el objetivo de 100X agregu previamente una gota de aceite de inmersin. 12.- Realice el mismo procedimiento con cada una de las cepas proporcionadas. 13.- Realice sus anotaciones 14.- Limpie el microscopio al finalizar la prctica. 3.3.5.3 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre: _________________________ Fecha: ____________ Materia: __________________
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Tipo de flagelos observados________________, microorganismo que los presento: ___________ 3.3.5.4 DISCUSIN __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 3.3.5.5 CONCLUSIONES __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
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PRCTICA # 4 DESINFECCIN. 4.1 OBJETIVO Al finalizar la prctica el alumno conocer al trmino de desinfeccin as como la clasificacin de los desinfectantes. Podr conocer cuales son los desinfectantes mas eficientes y la forma de evaluar su efectividad. 4.2 INTRODUCCIN. La desinfeccin puede definirse como: Aquel proceso, encaminado a la eliminacin de grmenes por alteracin de su estructura o su metabolismo, con objetote impedir su transmisicin al medio ambiente. (Mara J. Garca et al., 1997:43) En una primera clasificacin, basada en la naturaleza del proceso por el que se consigue la desinfeccin, puede haberse de 2 mtodos generales de desinfeccin: Fsicos Qumicos. De entre los mtodos fsicos, los basados en el empleo de calor (pasteurizacin, tindalizacin, etc) y radiaciones ultravioleta como agentes desinfectantes son los ms utilizados, por su fcil aplicacin y aceptable rendimiento. (Mara J. Garca et al., 1997:43) 4.5 MTODOS QUMICOS. Se definen como: Aquellos mtodos de desinfeccin que utilizan sustancias qumicas de naturaleza y propiedades muy diversas para conseguir la eliminacin de los grmenes. (Mara J. Garca et al., 1997:45). 4.6 CLASIFICACIN GENERAL DE LOS DESINFECTANTES. La clasificacin puede hacerse de acuerdo a la funcin de su potencia (tabal 2), a la estructura qumica (tabal 3), su espectro de accin, su mecanismo de accin, etc. (Mara J. Garca et al., 1997:48) Tabla 2. Clasificacin de desinfectantes en funcin a su potencia (Mara J. Garca et al., 1997:48) ALTA MEDIA BAJA
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CAPACES DE INACTIVAR:
- Formas vegetativas de bacteria y hongos - Micobacterias - Virus - Esporas -Aldehdos -Glutaraldehdo fenolico
- Formas vegetativas de bacteria y hongos - Micobacterias - Virus lipdicos - Derivados clorados - Derivados yodados -Alcohol Fenol/derivados
- Formas vegetativas de bacteria y hongos
GRUPO QUMICO AL QUE PERTENECEN
- Compuestos de amonio cuaternario - Metales pesados - Compuestos oxidantes
Tabla 3. Clasificacin de los desinfectantes de acuerdo a su estructura qumica (Mara J. Garca et al., 1997:49) PRODUCTO QUMICO Alcohol etlico Alcoholes Alcohol isoproplico Biguabidas Clorhexidina Cloramina T Derivados clorados Hipoclorito de Sodio Cloruro de benzalconio Detergentes catinicos* Cetrimida Cloruro de cetilpiridino xido de etileno Gases Propiolactona Perxido de hidrgeno Sustancias oxidantes Permanganato de potasio Formaldehdo 40% Glutaraldehdo Aldehdos Asociaciones de aldehdos Paraformaldehdo Colorantes Violeta de genciana Povidona yodada Tintura de yodo Derivados Yodados Solucin de lugol Alcohol yodado Fenoles Fenoles derivados Derivados fenlicos Metales pesados Nitrato de plata Sulfadiazina argntica Mercurocromo ESTRUCTURA
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Thiomersal Compuestos de amonio cuaternario MATERIAL METODOLOGA 4.9 DISCUSIN __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 4.10 CONCLUSIONES __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
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PRACTICA # 5 5.1 OBJETIVO
ESTERILIZACIN.
Al finalizar la prctica el alumno conocer al trmino de esterilizacin as como las condiciones mnimas para realizar correctamente este procedimiento en autoclave y as poder utilizarla como medio de eliminacin de microorganismos en el material utilizado. 5.2 INTRODUCCIN La esterilizacin se define como el proceso por el cual se libera a cualquier objeto, superficie o medio por remocin o muerte de todos los microorganismos que se encuentran contaminndolo, ya sea en estado vegetativo o esporulado (M. Breach, 1976:9, Harry W. Seeley et al. 1991:50) Los agentes esterilizantes en general se clasifican de la siguiente manera (tabla 4): Tabla 4. Sistemas y mtodos de esterilizacin (Mara J. Garca et al., 1997:88, M. Breach, 1976:10) Agente Sistema de Mtodo esterilizacin FSICO Calor hmedo Autoclave Calor seco Incineracin y flameado Estufa Pasteur, horno Poupinell Ionizantes (rayos gama y electrones de alta energa) No ionizantes (rayos UV e infrarrojos) Congelacin Bujas (tierra de diatomeas, porcelana) Lamina de asbestos Discos de membrana xido de etileno Formaldehdo - proppiolactona
Radiaciones
Fro Filtracin
QUMICO
Gases
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Lquidos
MECNICO
Ondas
Aldehdos (Glutaraldehdo, formaldehdo) Alcoholes Colorantes (anilina, compuestos acridnicos) Halgenos (cloro y yodo) Sales metlicas (mercuriales, cobre y plata) Fenoles Snicas Supersnicas
5.3 ESTERILIZACIN POR AGENTES FSICOS 5.3.1 CALOR HMEDO La esterilizacin por calor, es el mtodo ms utilizado. Uno de los factores que ms influye cuando se esteriliza con calor es la presencia o ausencia de humedad, ya que ser la que determine la temperatura exacta a la cual se matar a los microorganismos involucrados. La accin mortal del vapor se deriva del calor latente que se libera cuando se condensa sobre una superficie enfriada y se eleva la temperatura de dicha rea. Los microorganismos mueren por coagulacin de sus protenas. La destruccin de esporas es similar, el vapor se condensa sobre las paredes de ellas y aumenta su contenido de agua provocando hidrlisis y ruptura de las protenas bacterianas. La destruccin de esporas es similar, el vapor se condensa sobre las paredes de ellas y aumenta su contenido de agua provocando hidrlisis y ruptura de las protenas bacterianas (M. Breach, 1976:13). 5.3.2 VAPOR BAJO PRESION La esterilizacin con vapor bajo presin se realiza a temperatura que flucten entre 108 y 1470C y presin de 15lb, durante 15, 30 o 45 min, dependiendo del propsito que se persiga (M. Breach, 1976:16). El principio de esterilizacin por vapor es que el agua hierve cuando su presin de vapor iguala a la atmsfera que lo rodea. (M. Breach, 1976:16). Si se contina calentando el agua en ebullicin bajo presin, absorber calor en forma latente hasta que se evapore, este vapor se refiere como fase limtrofe y tiene la misma temperatura que el agua en ebullicin de la cual se ha formado. El calor absorbido se llama calor latente del vapor y a 100 0C es equivalente a 244.89kcal. Esto se compara con los 45.4kcla de calor sensible que es necesario
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para aumentar la temperatura del agua a los mismos 100 0C. El calor latente destruye cualquier microorganismo presente al coagular sus protenas (M. Breach, 1976:17). Antes de que la esterilizacin se lleve a cabo se debe retirar el aire de la autoclave (Figura 12). Si existe aire presente la temperatura de la mezcla airevapor ser ms baja que la del vapor puro a la misma presin. Cuando la temperatura del punto de escape llega a 100 0C se considera que todo el aire ha sido retirado y se puede cerrar la vlvula, aumentando as la presin del vapor requerida para la esterilizacin.
Figura 12. Autoclave
Para lograr un buen proceso de esterilizado se deben considerar los siguientes trminos: a) Tiempo de generacin de calor o tiempo de calentamiento (Tc). Es el tiempo necesario para que el calor penetre cada material y ser siempre mayor que el tiempo requerido para que la autoclave llegue a la temperatura de esterilizacin. (Mara J. Garca et al., 1997:91) b) Tiempo de retencin o tiempo de exposicin (Te). Tiempo necesario para asegurar que todos los microorganismos mueran a la temperatura empleada. El material con pH bajo o alto se esteriliza con mayor rapidez que los que tienen pH neutro (REFERENCIA). Durante este proceso la temperatura y la presin permanecen constantes, el tiempo puede variar dependiendo del tipo de autoclave (Mara J. Garca et al., 1997:91) c) Descenso o desvalorizacin (Td). Es la etapa en la que despus de esterilizarse el material, la presin desciende hasta 0.3 atmsferas durante el periodo denominado tiempo de descenso (Mara J. Garca et al., 1997:91). d) Tiempo de seguridad o tiempo de secado (Ts). Se agrega tiempo como factor de seguridad que es generalmente la mitad del tiempo de retencin y el periodo
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total constituye el tiempo o ciclo de esterilizacin. En esta etapa se elimina el vapor del interior del autoclave y la presin se iguala a la atmosfrica, la duracin aproximada es de 10min, en este tiempo permite que el aparato se acondicione y permita su apertura (Mara J. Garca et al., 1997:91). 5.3.3 VAPOR DE PESION ATMOSFERICA (Tindalizacin). Se emplea en medios de cultivo de fcil descomposicin. Se utiliza una atmsfera de calor libre, en vaporizador de Koch o Arnodl. El vaporizador consiste en un gabinete de cobre estaado, con paredes forradas, la tapa tiene forma cnica para drenar mejor el vapor condensado y se ajusta una canastilla perforada dentro del vaporizador, suspendida sobre el nivel del agua para que el material a esterilizar rodeado de vapor. 5.3.4 CALOR SECO En una atmsfera seca, completamente libre de humedad, las bacterias son ms recientes al calor y mueren cuando ocurre la oxidacin de los constituyentes de la clula, la temperatura es mucho ms alta que con calor hmedo. El tipo convencional de esterilizador de aire caliente, con los elementos trmicos instalados en las paredes de la cmara de esterilizacin debe contar con un abanico para asegurar la distribucin uniforme del aire caliente (M. Breach., 1976: 32) Con este sistema se pueden esterilizar material de vidrio, porcelana, grasas, aceites, parafina y soluciones no acuosas de sustancias termoestbles (Harry W. Seeley qt al., 1991:51, Mara J. Garca et al., 1997:94, M. Breach, 1976:32). 5.3.4.1 ETAPAS DEL PROCESO O CICLO DE ESTERILIZACIN a) Calentamiento. Es la etapa desde la conexin hasta que se alcanza en el termmetro la temperatura de esterilizacin en un tiempo determinado de calentamiento (Tca) (Mara J. Garca et al., 1997:95) b) Compensacin. Es la etapa hasta que la temperatura se alcanza en toda la carga (Tco) (Mara J. Garca et al., 1997:95) c) Esterilizacin. Es la etapa de destruccin de toda forma de vida. El tiempo que se estima oportuno es el denominado tiempo de esterilizacin (Te). (Mara J. Garca et al., 1997:96) d) Seguridad. Etapa que se aade para asegurar que la destruccin de toda clase de microorganismos y sus formas de resistencia ha sido completa. (Mara J. Garca et al., 1997:96) e) Enfriamiento: Desde que cesa la entrada de aire caliente hasta que se alcanza una temperatura que permite, sin peligro, la apertura de la estufa. (Mara J. Garca et al., 1997:96)
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5.3.4.2 Flameado. Para este propsito se utiliza el mechero de Bunsen para esterilizar asas de platino, puntas de pinzas y esptulas esto debe hacerse directamente sobre la flama roja del mechero (M. Breach, 1976:31) 5.3.4.3 Incineracin. Consiste en calcinar residuos de animales, excretas, materiales de desecho en un lugar adecuado, los plsticos como el cloruro de polivinilo (CPV) y el polietileno son rpidamente destruidos de esta manera aunque no se recomienda cuando la carga es muy grande ya que las cajas petri, jeringas y recipientes para muestras, cuando se incineran producen un denso humo negro, lo que constituye un problema de contaminacin del ambiente (M. Breach, 1976:31). Un modo satisfactorio para disponer de grandes cantidades de material de poliestireno es por esterilizacin en autoclave (M. Breach, 1976:32) 5.3.5 FILTRACIN Es el principal mtodo de esterilizacin de lquidos que contienen componentes termolabiles tales como las vitaminas, protenas del suero y antibiticos. Los dispositivos de tierra de diatomeas, fibras de asbesto entre otros han sido sustituidos por membranas de policarbonato o acetato de celulosa. El tamao de poro ms convencional para esterilizacin es de 0.45m, aunque se microbilogos marinos han encontrado que bacterias marinas pueden atravesar este tamao de poro por lo usan membranas con tamao de poro de 0.2m (3 pag 53, 54). 5.4 ESTERILIZACIN POR RADIACIONES 5.4.1 RADIACIONES IONIZANTES Las radiaciones ionizantes al incidir sobre el material le aportan energa necesaria para ocasionar a nivel atmico la excitacin de electrones que acceden a rbitas superiores y su posterior liberacin del tomo dando lugar a iones con carga positiva (cationes), igual al nmero de electrones desprendidos (Mara J. Garca et al., 1997:97). Las radiaciones ionizantes electromagnticas son de longitud de onda corta, tales como los rayos X, gama y csmicos. Son altamente letales y actan ionizando molcula a su paso. Su poder de penetracin es extremadamente alto y su uso debe ser utilizando proteccin con plomo (M. Breach, 1976:32) 5.4.1.1 RADIACINES GAMMA
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Se han utilizado para la esterilizacin de grandes cantidades de material que incluyen jeringas, hisopos, cajas Petri, catteres, materias prima para alimentos de animales, etc (M. Breach, 1976:47). Se usan dos fuentes de radiaciones gamma, el cobalto 60 y el cesio 137, ambos productos de reacciones atmicas. (M. Breach, 1976:47) 5.4.2 RADIACIN NO IONIZANTE. Son radiaciones electromagnticas, con longitudes de onda ms largas que la luz visible y en gran medida son absorbidos como calor (M. Breach, 1976:43) 5.4.2.1 RADIACIONES ULTRAVIOLETA
5.4.2.2 Radiacin infrarrojo Es conveniente para esterilizar grandes cantidades de jeringas en un lapso de tiempo corto (M. Breach, 1976:44) 5.5 ESTERILIZACIN POR AGENTES QUMICOS Los agentes qumicos se emplean principalmente para reducir una poblacin microbiana, lo que puede o no resultar en una esterilizacin completa, es por ello que el trmino desinfeccin qumica describa mejor estos procedimientos y el agente qumico usado se le llame desinfectante (M. Breach, 1976:51) Las formas de actuar de los agentes qumicos se han clasificado en cuatro. 1) Coagulacin de protenas: Se provoca la precipitacin y coagulacin de las protenas, haciendo que dejen de funcionar y la muerte de la clula. (M. Breach, 1976:51) 2) Ruptura de la membrana celular Las sustancias que se concentran en la membrana celular y que son absorbidas por la clula pueden alterar las propiedades fsicas y qumicas de la membrana interfiriendo con su funcionamiento normal. Provocando la inhibicin o muerte de la clula. (M. Breach, 1976:51) 3) Remocin de los grupos sulfhidrilo libres: Muchas de las protenas enzimticas de una clula contienen cisteina y cadenas laterales que terminan en SH (grupos sulfidrlo). Estas protenas no pueden funcionar a menos que los grupos sulfhidrilos permanezcan reducidos y libres, si los grupos son fijados le ocurre un dao generalizado a la clula (M. Breach, 1976:51) 5.5.1 GASES
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La reciente proliferacin de material de plstico desechable como jeringas, cajas petri, bolsas de plstico, material de filtracin desechable y muchos materiales ms han favorecido que el desarrollo de un tipo de esterilizacin de materiales labiles al calor surja como lo es la autoclave gaseosa. (Figura Harry W. Seeley et al., 1991:51). El xido de etileno es el gas ms comnmente utilizado en tales instrumentos (Harry W. Seeley et al., 1991:51). El xido de etileno es muy txico para partculas virales, bacterias y clulas fngicas as como para la mayora de estructuras resistentes al calor, aunque este gas es en si explosivo si re realiza una mezcla de 10% de gas con 90% de dixido de carbono son agentes desinfectantes altamente efectivos y no son flamables ni explosivos (Harry W. Seeley et al., 1991:51). 5.6 MATERIAL 10 Tubos de ensaye de 16 X 150mm con tapn de rosca por equipo 3 Pipetas graduadas de 1mL por equipo 3 Pipetas graduadas de 5mL por equipo 3 Pipetas graduadas de 10mL por equipo 10 Cajas petri de vidrio por equipo. 1 Matraz Erlen-Meyer de 100mL por equipo 1 Matraz Erlen-Meyer de 250mL por equipo 1 Matraz Erlen-Meyer de 500mL por equipo 1 Matraz Erlen-Meyer de 1Lt por equipo 1 Bote de lata mediano forrado con papel por equipo 10 Aplicadores de madera por equipo Algodn por equipo Toallas de papel por equipo 1 Frasco de vidrio mediano con tapa de rosca (limpio) por equipo 2 Pliego de papel destraza por equipo 5.7 REACTIVOS Cloruro de Sodio Agua destilada 5.8 METODOLOGA TUBOS DE ENSAYE DE 16 X 150mm CON TAPON DE ROSCA 1. Colocar 9.0 ml de Solucin Salina al 0.9% en cada uno de los tubos de ensaye 2. Tapar cada tubo con el tapn sin que quede apretado para permitir la entrada de aire caliente al tubo y permita la esterilizacin de la solucin.
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3.
Colocar los tubos en el interior de un bote de lata y protegerlos con papel destraza. PIPETAS
1.
Colocar en la parte final de cada pipeta un filtro de algodn, de tal manera que el aire pase libremente a travs de l. 2. Flamear el extremo de la pipeta para quemar el exceso de algodn. 3. Envolver cada pipeta en papel, de acuerdo a las instrucciones del asesor. 4. Marcar el volumen de cada pipeta en su respectiva envoltura, as como la direccin en la que se encuentra la punta de la misma. (Figura 13)
Figura 13. Preparacin de pipetas para su esterilizacin
CAJAS PETRI 1. 2. 3. Envolver en papel grupos de 1 y 2 cajas petri limpias. Colocar las cajas Petri con la tapa hacia abajo. Anotar en la envoltura el nmero de cajas y la fecha de preparacin. MATRACES
1.
A cada matraz colocarle perfectamente un tapn de algodn, siguiendo las instrucciones del asesor. 2. A cada matraz colocarle un gorro de papel, anotando en l la fecha de preparacin. Como se muestra en la figura 14 a) y b) respectivamente.
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Figura 14. Preparacin de matraces Erlen-Meyer para su esterilizacin. La imagen a) muestra la colocacin de un tapn de algodn en la boca del matraz, b) La boca del matraz el tapn de algodn deben ser cubiertos por un gorro de papel indicando la fecha de esterilizacin.
ISOPOS 1. A los aplicadores de madera agregar algodn en una de las puntas siguiendo las instrucciones de su asesor 2. Una vez realizado esto a los 10 aplicadores de madera de forma individual deber envolverlos en papel destraza. Las tollas de papel deber colocarlas en el frasco de vidrio sin cerrar de manera hermtica la tapa permitiendo con esto su correcta esterilizacin. PROCEDIMIENTO PARA ESTERILIZAR USANDO EL AUTOCLAVE. 1. 2. 3. 4. 5. Verificar que la autoclave tenga suficiente agua destilada en su interior, en caso de lo contrario agregar agua hasta la marca de lmite mximo. Una vez colocado todo el material a esterilizar cerrar el autoclave teniendo cuidado de asegurarse que la tapa Apretar los tornillos de la tapa del autoclave teniendo en cuenta que debern apretarse uno frente al otro. Asegurarse que la vlvula de seguridad del autoclave este abierta. Una vez perfectamente cerrada deber permitir la liberacin de aire fro que pueda estar en la autoclave esto dejando escapar vapor por 5 minutos aproximadamente antes de cerrar la vlvula de seguridad. Cerrar la vlvula de seguridad y permitir que la presin interna de la autoclave llegu a 15 lb y 121C. Dejar 15min a esta presin y temperatura para permitir la correcta esterilizacin de material. Pasado el tiempo permitir enfriar la autoclave antes de abrir (hasta 3lb de presin) Cuidadosamente abrir la autoclave y sacar el material
6. 7. 8. 9.
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10.
Apretar las roscas de los tubos con solucin salina y dejar enfriar antes de guardarlos en el refrigerador (estos tubos se utilizaran en prcticas posteriores). 11. Lavar la autoclave y secarla con un trapo que no desprenda pelusa. 5.9 RESULTADOS Y OBSERVACIONES __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 5.10 DISCUSIN Y CONCLUSIONES __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ PRACTICA # 6 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO. 6.1. OBJETIVO Conocer los requerimientos mnimos que una bacteria necesita para desarrollarse adecuadamente, as como la clasificacin de medios que existe para el aislamiento microbiano. 6.2 INTRODUCCION
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La gran diversidad de medios de cultivo usados en microbiologa vara de acuerdo a las necesidades. Los medios complejos contiene todos los ingredientes para el crecimiento de un microorganismo, pero estn en forma cruda, esto es, no todos los componentes del medio se conoce la cantidad exacta, muchos componentes en un medio complejo son cidos o digestiones enzimticas de varias tejidos de las plantas, carne, casena y clulas de levaduras que proporcionan fuentes ricas de polipptidos, amino cidos, vitaminas o minerales. Ejemplo de estos componentes se medios son peptonas o tristonas, las cuales son hidrolizados enzimticos de protena animal, o extracto de levaduras, los cuales son autorizados de levadura ricos en complejo B. Algunos carbohidratos estn usualmente presentes en estos digeridos crudos, pero muchos medios complejos son suplementados con azcar, usualmente glucosa (Harry W. Seeley e al., 1991:47). El anlisis de la composicin de la clula microbiana revela que ms del 95% del peso seco de la clula esta constituido por unos pocos elementos: carbono, oxigeno, hidrgeno, nitrgeno, azufre, fsforo, potasio, calcio, magnesio, y hierro. Estos se denominan macroelementos o macronutrientes, por que los microorganismos los captan en cantidades relativamente grandes. Los seis primeros (C,O,H,N,P,S) son componentes de los hidratos de carbono, lpidos, protenas y cidos nucleicos, los cuatro macroelelmentos restantes se encuentran dentro de la clula en forma de cationes y desempean diferentes funciones. Por ejemplo, el potasio es necesario para la actividad de varias enzimas, entre ellas algunas que participan en la sntesis de algunas protenas. El calcio contribuye, entre otras funciones, a la termorresistencia de las endosporas. El magnesio acta como cofactor de muchas enzimas, forma complejos con el ATP y estabiliza los ribosomas y las membranas celulares. El hierro forma parte de los citocromos y es cofactor de enzimas y de protenas transportadoras de electrones. Todos los microorganismos precisan de varios oligoelementos (denominados tambin microelementos), adems de los macroelementos. La mayora de las clulas necesitan los oligoelementos (magnesio, cinc, cobalto, molibdeno, nquel y cobre). Sin embargo, las clulas precisan de cantidades tan pequeas que contaminantes presentes en el agua, en los recipientes para el cultivo y en los componentes habituales del medio son a menudo adecuados para el crecimiento. Medios definidos (holidicos) proporcionan los nutrientes requeridos para el crecimiento en la forma de qumicos relativamente puros de concentracin conocida. Estos varan de acuerdo a las necesidades del microorganismo. Los componentes esenciales de un medio de crecimiento heterotrofotos no fastidiosos tales como Escherichia coli, son sales inorgnicas y fuentes de nitrgeno y carbono. Un medio adecuado para E. coli pueden ser compuestos de NH4Cl, MgSO4, KH2PO4, Na2HPO4 y glucosa. Otros elementos esenciales tales
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como el hierro, manganeso y cobre son usualmente presentes como contaminantes de los qumicos, la glucosa proporciona energa y una fuente de carbono y el cloruro de amonio es la fuente de nitrgeno. Un hetertrofo ms fastidioso, con capacidad limitada de sntesis, pude requerir la adicin de varias vitaminas, aminocidos, purinas y pirimidinas (Harry W. Seeley e al., 1991:47). 6.3 Medios sintticos o definidos. Algunos microorganismos, particularmente los auttrofos crecen en medios sencillos, que contienen CO2 como fuente de carbono, nitratos o amonio como fuente de nitrgeno, sulfatos y diversos minerales. Esta clase de medios en que se conocen todos los componentes se denominan medios definidos. 6.4 Medios complejos Los medios que contienen algunos ingredientes cuya composicin qumica se desconoce se denominan medios complejos. Estos medios son muy tiles, pues un nico medio complejo puede ser suficiente para satisfacer las necesidades nutricionales de diversos microorganismos. Los medios complejos contienen componentes como peptonas, extracto de carne y de levadura. Las peptonas son hidrolizados de protena obtenidos de la digestin proteoltica parcial de carne, casena harina de soya, gelatina y otras fuentes proteolticas. Sirven como fuente de carbono, energa y nitrgeno. El extracto de levadura es una fuente excelente de vitaminas del complejo B y de compuestos nitrgeno y carbono. Tres medios complejos utilizados comnmente son: 1) caldo nutritivo, 2) caldo soja triptonado, y 3) agar Mac-Conkey. El medio de cultivo usualmente se esteriliza por calor en autoclave a 121 0C bajo 15 libras de presin por 15 a 30 minutos (Harry W. Seeley e al., 1991:47). 6.5 La medicin del pH El nmero de iones de hidrgeno (H+) en una solucin acuosa depende de fuerza de disociacin del cido presente. El pH es una funcin logartmica, definida por la ecuacin pH=log 1/(H+) = -log(H+). De esta manera un pH de 7 (pH 7) representa una concentracin de iones hidrgeno de 1X10 -7. Esto es la concentracin de iones hidrgeno para el agua pura a 25 0C e indica neutralidad en la escala de pH (Harry W. Seeley e al., 1991:47). Una solucin que esta por arriba de 7 es ms alcalina (tiene una concentracin de hidrgeno ms baja) que el agua. Una solucin con pH ms bajo de 7 es ms cida que el agua. Por ejemplo, una solucin 0.000001N de HCl tiene 10 -6moles de (H+) por litro o un pH de 6.0. Debido a que la escala de pH es logartmica, una unidad de pH representa diez veces mucho ms iones hidrgeno que la siguiente
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unidad ms alta. Por ejemplo, 0.1 N HCl tiene 10 -1 (H+) o un pH de 1, mientras que una solucin 0.01N de HCl tiene 10 -2 (H+) o pH de 2 (Harry W. Seeley e al., 1991:47). El pH de muchos medios de cultivo debe ser cercano a la neutralidad para el crecimiento bacteriano ptimo, el ajuste del pH en un medio de cultivo debe ser determinado potenciomtricamente o colorimtricamente (Harry W. Seeley e al., 1991:48). El mtodo potenciomtrico para determinar el pH debe ser medido entre la diferencia de potencial de la solucin problema y el estndar (Harry W. Seeley e al., 1991:48). El mtodo colorimtrico de determinacin de pH usa varios indicadores en solucin o en papel pH, el color de la solucin o del papel corresponden a un pH particular, tales indicadores son compuestos que existen en solucin como un sistema aceptor-donador en el cual el donador y el aceptor difieren en color. El rango total del pH es cubierto por combinacin de varios indicadores, los cuales difieren en los valores de pK (tabla 5) (Harry W. Seeley e al., 1991:48). Tabla 5. Indicadores ms comnmente usados en microbiologa (Harry W. Seeley e al., 1991:48) Indicador Azul de timol (T.B.) Azul de bromofenol (B.P.B.) Verde de bromocresol (B.C.G.) Rojo de metilo (M.R.) Rojo de clorpenol (C.P.R.) Prpura de Bromocresol (B.C.P.) Azul de bromotimol (B.T.B.) Rojo de fenol (P.R.) Prurpura de metacresol (M.C.P.) Azul de timol (T.B.) Fenolftaleina Cresolftaleina 6.6 MATERIAL 100mL de HCl 1 Frasco de Hidrxido de sodio 1 Frasco de agar nutritivo 1 Frasco de agar PDA 1 Frasco de agar McConkey 1 Frasco de agar Sangre Color cido Rojo Amarillo Amarillo Rojo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Descolorido descolorido Color alcalino Amarillo Azul Azul Amarillo Rojo Prpura Azul Rojo Prpura Azul Rojo Rojo Rango de pH 1.2-2.8 3.0-4.6 3.8-5.4 4.4-6.0 5.0-6.6 5.4-7.0 6.0-7.6 6.8-8.4 7.4-9.0 8.2-9.8 8.0-9.6 8.2-9.8
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1 Frasco de agar Cetrimida 1 Frasco de agar Salmonella-Shigela 1 Frascco de agar Eosina-azul de metileno Cajas Petri desechables 4 Esptulas 1 Probeta de 100mL por grupo 1 Probeta de 250mL por grupo 2 vasos de precipitado de 100mL 5 Pipetas graduadas de 5 Ml por equipo 5 Pipetas graduadas de 10 mL por equipo 1 Matraz Erlen-Meyer de 100mL por equipo 1 Matraz Erlen-Meyer de 250mL por equipo 1 Matraz Erlen-Meyer de 500mL por equipo 1 Matraz Erlen-Meyer de 1Lt por grupo 1 Asa bacteriolgica individual 1 termmetro de mercurio 6.7 EQUIPO 2 1 1 1 1 1 1 1 Mecheros por equipo Parrilla con agitacin por equipo Bao mara por grupo pHmetro por grupo Autoclave por grupo Balanza analtica por grupo Balanza granataria por grupo Incubadora por grupo
6.8 METODOLOGA. PARTE 1 Cada vez que se desea preparar un medio de cultivo para su esterilizacin se deben seguir los siguientes pasos: 1. Revisar la etiqueta del frasco de cultivo y verificar la fecha de caducidad, el nmero de lote, las instrucciones de su preparacin (cantidad de agua en la que hay que disolverse, pH, indicador si es que cuenta con l, ingredientes y temperatura de esterilizacin). 2. Verificar que el contenido del frasco no esta grumoso o hecho piedra, de ser as el medio ya no se debe utilizar pues ya se ha hidratado.
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3. Pesar nicamente la cantidad de medio correspondiente al volumen que se va ha preparar, esto puede hacerse en un vaso de precipitado o en un pedazo de papel limpio. 4. Depositar lo pesado en un matraz Erlen-Meyer el cual debe ser de una capacidad por lo menos de 100 mL mayor al volumen a preparar, agregar el 80% del volumen que se va a preparar y calentar con agitacin cuidadosamente hasta disolver el polvo Nota el agar no se disuelve hasta que el medio es calentado por arriba de 100 0C. 5. Medir el pH del medio (slo hasta que se encuentre disuelto) usando un pHmetro y ajustar el pH con NaOH 1 M o HCl 1 M dependiendo del pH que tenga el medio 6. Una vez ajustado se debe agregar el volumen de agua restante, cerrar el matraz sin apretar demasiado la tapa para permitir la entrada de aire caliente de la esterilizacin. NOTA. Si el medio preparado es lquido debe servirse directamente en los tubos o matraces (etiquetados previamente) que se van ha utilizar yuna vez servidos proceder a esterilizar. 7. El medio se debe esterilizar en una autoclave siguiendo el procedimiento de esterilizacin. 8. Despus de esterilizar el medio, agite suavemente para dispersar el agar uniformemente y enfriar a una temperatura de 45 0C, en caso de tratarse de tubos o matraces dejar enfriar a una temperatura de 50 oC aproximadamente y cerrar perfectamente para su almacn y uso posterior. 9. Una vez enfriado, aspticamente servir en cajas, aproximadamente 15mL por caja (Figura 15). Si se forman burbujas en la superficie del agar, remueva la tapa y rpidamente flamee la superficie con el mechero invertido pata eliminar las burbujas. 10. Incube un lote al azar del 5% de las cajas y tubos preparados y marcados previamente por 48horas a 300C. 11. En la siguiente seccin de laboratorio, observa tus cajas para verificar si existe o no contaminacin. 12.Si no existe contaminacin se pueden ocupar para sembrar un cultivo puro.
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Figura 15. Forma de servir el medio de cultivo. 6.9 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre: _________________________ Fecha: ____________ Materia: __________________ Composicin del medio de cultivo
Clculos PARTE 2. Sembrar las colonias proporcionadas por el profesor en cada una de las cajas de agar preparadas. Cepas. E. coli Sthapylococcus sp Streptococcus sp. Candida sp. Salmonella sp. Dejar incubando durante 24 horas a 370C. Anotar sus resultados.
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6.10 DISCUSIN __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 6.11 CONCLUSIONES __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
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PRACTICA # 7 TCNICAS DE AISLAMNIENTO MICROBIANO 7.1 OBJETIVO Al concluir la prctica, el alumno ser capaz de describir la importancia de una tcnica asptica, transferir un cultivo a un caldo usando la tcnica apropiada de asepsia as como manejar las tcnicas ms comunes de aislamiento bacteriano e identificar las caractersticas de morfologa colonial. 7.2 INTRODUCCIN En la naturaleza, los microorganismos existen como poblaciones mezcladas de diferentes tipos. El conocimiento de los microorganismos ha sido a travs del estudio de especies aisladas, crecimiento en ambientes libres de contaminacin por otros microorganismos. Tales tcnicas no se requieren para estudiar plantas y animales, estas son nicas para el estudio de los microorganismos en el mundo (Harry W. Seeley e al., 1991:27). Como todas las formas de vida los microorganismos necesitan nutrientes y un medio ambiente favorable. El medio de cultivo debe contener nutrientes esenciales para el crecimiento de un cultivo microbiano, este debe proporcionar las condiciones favorables alrededor del crecimiento: el pH, presin osmtica, oxgeno atmosfrico y otros factores (Harry W. Seeley e al., 1991: 27). Muchos de los estudios de un laboratorio deben hacerse con cultivos puros, esto es; con una sola especie de un microorganismo, para ello se debe tener la capacidad para esterilizar un medio de cultivo y mantenerlo en condiciones de esterilidad (libre de formas de vida) y se debe tener la capacidad de de inocular un medio estril con un cultivo puro (axenico). Este ltimo procedimiento es referido como una tcnica asptica (Harry W. Seeley e al., 1991:27). El crecimiento puede ser a travs de un incremento en el tamao celular o un incremento en el nmero celular conduciendo a un incremento generalizado de la biomasa. La manera ms fcil de medir este crecimiento es determinando el nmero de clulas en un momento dado (Susan G. Kelley et al., 1991:159). Las bacterias tienen patones de crecimiento en un cultivo lquido, las cuales pueden ser separadas en distintas fases (Figura 16). Cuando las bacterias son inoculadas hacia el medio, no crece inmediatamente: este perodo se denomina fase de latencia, la masa celular se incrementa cuando la bacteria se adapta al nuevo ambiente y sintetiza los componentes necesarios (Kathy Barrer, 1998:251).
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Una vez adaptado, el cultivo entra a la fase de crecimiento exponencial, tambin conocida como fase logartmica, llamada as por que es un incremento exponencial en el nmero de clulas (Kathy Barrer, 1998:251). Cambios en el ambiente fsico y qumico pueden ser la seal para que el microorganismo entre al inicio de la fase estacionaria, aunque no hay un incremento en el nmero de clulas, las bacterias en esta etapa requieren una fuente de energa disponible para mantenerse viables, cuando la fuente de energa es totalmente depletada entran a la etapa de muerte, donde el nmero de clulas disminuye durante este periodo (Kathy Barrer, 1998:251).
Figura 16. Curva de crecimiento de una bacteria en medio lquido. La fase de crecimiento pueden ser considerada desde la fase de siembra de los cultivos para experimentos hasta su almacenamiento (Kathy Barrer, 1998:250).
7.3 AISLAMIENTO MICROBIANO POR EL MTODO DE ESTRA CRUZADA Una colonia es una isla en un medio slido o semislido, una clona derivada de una sola bacteria. Las colonias aisladas son obtenidas por dilucin de una bacteria nica o una colonia sola puede ser manualmente picked sin tocar otra colonia ((Kathy Barrer, 1998:259) 7.4 MATERIAL Cultivos de 18 a 24 hrs de E. coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtillus y Alcaligenes faecalis. 2 mecheros por equipo 1 Asa bacteriolgica individual Desinfectante por equipo 3 porta objetos por equipo 1 tubo de agua estril por equipo 1 trenes de tincin de gram por equipo
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1 Frascos goteros con 10mL de safrafina 1 Frascos goteros con 10mL de alcohol-acetona 1 Frascos goteros con 10mL de Cristal violeta 1 Frascos goteros con 10mL de lugol Cajas petri con los medios de cultivo preparados la sesin anterior de laboratorio. 1 Microscopio ptico por equipo 7.5 METODOLOGA Realizar una tincin de gram por cada microorganismo proporcionado siguiendo la metodologa proporcionada en 3.3.1.2 1. TNICA DE DILUCIN (Figura 17) a) Esterilizar el asa bacteriolgica por flameado. b) Enfriar el asa bacteriolgica junto al mechero. c) Tomar una asada de la muestra y colocarla en los bordes de la placa haciendo estras continuas hacia el centro de la caja (seguir las instrucciones del asesor). d) Nuevamente esterilizar el asa y enfriarla. e) Hacer una segunda serie de estras tomando la porcin final de la estra anterior. Esterilice el asa y enfri. f) Este ltimo paso hacerlo 2 veces ms g) Incubar las placas a 370C durante 24 horas. h) Contabilizar (SI ES POSIBLE) el nmero de colonias aisladas que crecieron en cada caja.
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i)
Figura 17. Tcnica de dilucin en placa
2. TCNICA DE ASILAMIENTO POR EL MTODO EUROPEO (Figura 18). 1. Esterilizar el asa bacteriolgica por flameo. 2. Enfriar el asa bacteriolgica junto al mechero 3. Tomar una colonia pura y hacer una estra de un extremo del agar al otro. 4. Esterilizar el asa bacteriolgica y permitir enfriar cerca del mechero o introducindola en un punto del agar donde no existan bacterias sembradas) 5. Realizar varias estras de un extremo al otro del agar tomando como punto de inoculo la estra inicial (No se necesita tomar ms muestra para seguir trabajando). 6. Esterilizar el asa bacteriolgica cada vez que se realice una estra 7. Incubar a 37C por 24-48 horas
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Figura 18. Tcnica de dilucin mtodo europeo
3. TCNICA DE SEMBRADO MASIVO (Figura 19) a) b) c) muestra d) Esterilizar el asa bacteriolgica por flameado. Enfriar el asa bacteriolgica junto al mechero. Tomar una asada de la colonia pura y estriar todo el agar con la sin necesidad de flamear el asa. Incubar a 37oC durante 24-48 horas.
Figura 19. Tcnica de sembrado masivo.
7.6 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre: _________________________ Fecha: ____________ Materia: __________________
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Organismo____________ Organismo_____________ Tipo de sembrado_______ sembrado_______ Nmero de colonias_____ colonias_____
Organismo________________ Tipo de sembrado__________ Nmero de colonias ________ Tipo de Nmero de
Organismo____________ Organismo_____________ Tipo de sembrado_______ sembrado_______ Nmero de colonias_____ colonias______
Organismo________________ Tipo de sembrado__________ Tipo de Nmero de
Nmero de colonias ________
Organismo____________ Organismo_____________ Tipo de sembrado_______ sembrado_______ Nmero de colonias_____ colonias______
Organismo________________ Tipo de sembrado__________ Nmero de colonias ________ Tipo de Nmero de
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Organismo____________ Organismo________________ Organismo_____________ Tipo de sembrado_______ Tipo de sembrado__________ sembrado_______ Nmero de colonias_____ Nmero de colonias ________ colonias______
Tipo de Nmero de
7.7 DISCUSION __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
7.8 CONCLUSIONES __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
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PRACTICA # 8 MORFOLOGIA COLONIAL 7.1 OBJETIVO El alumno ser capaz de reconocer, nombrar y describir los patrones de crecimiento de diferentes bacterias en un medio de cultivo. 8.2 INTRODUCCIN Cuando se examinan los microorganismos asociados o presentes en un animal, planta, suelo, agua o alimento, se encuentra una gran variedad, raramente se encontrara un solo tipo de microorganismo. Si lo que se quiere es trabajar con un cultivo puro, se deben obtener colonias separadas o aisladas. Una observacin cuidadosa de las colonias asiladas muestra que su apariencia vara de una a otra. Una colonia microbiana esta constituida por individuos de la misma especie provenientes de una clula o de un grupo de ellas. Por definicin un buen aislamiento en placa es aquel que nos da colonias aisladas, con una distancia que permita distinguir y describir la morfologa colonial que incluye: 1. Tamao. Se describe en milmetros y puede variar desde colonias extremadamente pequeas que midan apenas una fraccin de milmetro hasta aquellas que llegan a medir 10 mm o ms. Algunas especies bacterianas pueden extenderse en toda la superficie de la caja. 2. Color. Las colonias pueden tener variados colores, debido a pigmentos propios o absorcin de algunas sustancias del medio. 3. Forma. Puede ser puntiforme, circular o irregular. Las colonias puntiformes son tan pequeas que no se les pueden distinguir el resto de sus caractersticas. 4. Bordes. Pueden ser enteros o mostrar irregularidades como lbulos, filamentos, proyecciones como dientes de sierra o enrollados. 5. Elevacin. La colonia puede ser plana o elevada, esta ltima a su vez puede ser convexa, pulvinada, umbonada, crateriforme o umbilicada. 6. Superficie. Puede ser lisa, rugosa o granular. 7. Aspecto. Puede ser hmedo o seco. 8. Luz reflejada. Puede ser brillante o mate 9. Luz transmitida. Puede ser transparente, translcida u opaca. 10. Produccin de pigmentos. Algunas bacterias producen pigmento soluble en agua, que pueden difundir al medio de cultivo. 11. Consistencia. Dura o suave, est ltima puede ser butirosa, mucoide o friable. Esta caracterstica se determina tocando la colonia con el asa y por lo tanto debe ser la ltima en describirse. El estudio de la morfologa de una colonia aislada puede darse en tres aspectos generales: 2. Forma de la colonia
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3. 4.
Margen de la colonia Elevacin de la colonia (Figura 20) (Lois Beishir, 1996:116)
Forma
Elevacin
Borde
Figura 20. Caractersticas de crecimiento de una colonia aislada (Lois Beishir, 1996:116)
8.3 MATERIAL Las cajas cultivadas en la prctica anterior. 2 Microscopios estereoscpicos 2 mecheros por equipo 8.4 METODOLOGA Distinguir de 3 colonias aisladas cada una de las caractersticas de morfologa colonial que se indican a continuacin. 1.- Tamao: medir el dimetro en milmetros. 2.- Forma: puntiforme, circular o irregular. 3.- Color 4.- Elevacin Plana, convexa, pulvinada, umbonada. 5.- Superficie: lisa, rugosa, granular. 6.- Aspecto: hmeda, seca. 7.- Bordes: enteros, irregulares, filamentosos. 8.- Luz reflejada: brillante mate. 9.- Luz trasmitida: opaca, translcida, transparente. 10.- Consistencia: suave (butirosa, mucoide) dura.
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8.5 OBSERVACIONES Y RESULATDOS. Nombre: _________________________ Fecha: ____________ Materia: __________________ Caractersticas de la colonia: __________________________________________ __________________________________________ __________________________________________ Medio de cultivo: ____________________________ Escherichia coli
Caractersticas de la colonia: __________________________________________ __________________________________________ __________________________________________ Medio de cultivo:____________________________ Alcaligenes faecalis.
Caractersticas de la colonia: __________________________________________ __________________________________________ __________________________________________ Medio de cultivo:____________________________ Staphylococcus aureus.
Caractersticas de la colonia: __________________________________________ __________________________________________ __________________________________________ Medio de cultivo: ____________________________ Bacillus subtilis.
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Tabla 6. Resultados de la morfologa colonial Crecimiento en agar Microorganis Forma de la mo colonia E. coli Margen de la colonia Tamao de la colonia (mm) Produccin de pigmento (color)
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S. aureus
B. subtilus
8.6 DISCUSIN __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 8.7 CONCLUSIONES __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ _____
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PRACTICA # 9 MEDICION DEL CRECIMIENTO BACTERIANO 9.1 OBJETIVO Al finalizar la prctica el estudiante ser capaz de hacer una dilucin cuantitativa para conteo bacteriano en placa, as como calcular el nmero de bacterias por mililitro de una muestra usando un espectrofotmetro para determinar la densidad ptica de una serie de diluciones bacterianas. 9.2 INTRODUCCIN No slo es importante ver a los microbios, tambin es necesario conocer el nmero o la masa celular. Para determinar la cantidad presente en una muestra, para ello existen un gran nmero de tcnicas disponibles, entre ellas se encuentran: El nmero ms probable (MPN), conteo directo en microscopio, contadores celulares automticos, conteo en placa y otros mtodos indirectos (Susan G. Kelley et al., 1991:149). Por esta razn en esta prctica nicamente hablaremos de las tcnicas ms comunes para conteo bacteriano (MPN, conteo directo y conteo por espectrofotometra). El inicio de un cultivo bacteriano, un nmero de clulas (el inocul) son transferidas (inoculacin) hacia un medio estril (Harry W. Seeley et al., 1991:27).
9.2.1 SIEMBRA EN PROFUNDIDAD O CONTEO EN PLACA. La siembra en profundidad, que se emplea ampliamente con bacterias y hongos, puede tambin generar colonias aisladas. La muestra original se diluye varias veces para reducir la poblacin microbiana lo suficiente, con el fin de obtener colonias separadas cuando se siembren. (fig. ) A continuacin se mezclan volmenes pequeos de varias muestras diluidas con agar lquido, que se ha enfriado hasta aproximadamente 450C, y la mezcla se vierte inmediatamente en placas de cultivo estril. Despus de endurecer el agar, cada clula se fija a un lugar y forma una colonia individual. El nmero de colonias equivale al nmero de microorganismos viables en la muestra diluida. Las tcnicas de siembra en placa son sencillas, sensibles y se utilizan ampliamente para contar bacterias y otros microorganismos en muestras como alimentos, agua y suelo. Sin embargo se pueden tener varios problemas. Se pueden obtener recuentos bajos si no se separan las agrupaciones de clulas y no se dispersan bien los microorganismos, como no es posible estar totalmente seguro de que cada colonia proceda de una clula individual, los resultados suelen expresarse en unidades formadoras de colonias (UFC), En lugar de
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nmero de microorganismo. Las muestras deben producir entre 25 y 250 colonias para obtener resultados significativos, excepto si se trata de muestras estriles en donde el crecimiento debe ser nulo. 9.2.1.1 MATERIAL 5 Tubos con 10mL de solucin salina fisiolgica por equipo 5 pipetas de 1mL por equipo 2 Mecheros por equipo 1 Frasco de Agar nutritivo o Agar estndar por grupo Desinfectante por equipo 1 Autoclave por grupo 1 Matraz Erlen-Meyer de 1L. por grupo 1 Balanza analtica por grupo 1 Esptula por equipo 1 Probeta de 500mL por grupo 10 Cajas petri desechables por equipo 1 Bao Mara por grupo 1 incubadora por grupo 9.2.1.2 METODOLOGA AISLAMIENTO POR EL METODO DE DILUCIONES a) Marcar una serie de 5 tubos (16 x 150 mm con Solucin Salina al 0.9% estril) de 1 al 5. b) Al primer tubo adicionar 0.5mL del inculo. c) Efectuar diluciones decimales de cada muestra (Figura 21). Tomando 0.5mL del tubo anterior al cual se va a realizar la dilucin. d) Homogenizar cada tubo antes de transferir el volumen correspondiente al siguiente tubo. e) El tubo nmero 5 permanecer sin modificaciones y servir de blanco o control de esterilidad. f) Introducir las pipetas utilizadas a un recipiente ex profeso. g) Colocar 0.5mL de cada dilucin y 0.5mL de la muestra original en cada una de las cajas Petri estriles, previamente marcadas con la dilucin correspondiente. h) Aadir a cada caja 15ml de Agar nutritivo estril y fundido enfriando a aproximadamente a 450C. i) Dejar solidificar el medio. j) Identificar cada placa con la informacin necesaria: numero de equipo, fecha, hora, microorganismo. k) Incubar las placas a 370C durante 24 hrs. l) Contabilizar las colonias que crecieron en cada placa, segn las indicaciones del profesor.
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Figura 21. Siembra en profundidad.
9.2.3.4 RESULATDOS Y OBSERVACIONES Nombre: _________________________ Fecha: ____________ Materia: __________________ Tabla 7. Resultados conteo en placa Dilucin counted Muestra 1 Muestra 2
Nmero de colonias
Plate count por mL de la muestra original
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9.2.4 MEDICION POR ESPECTROFOTOMETRA. Existen tcnicas ms sensibles y rpidas que se basan en la capacidad de las clulas microbianas de dispersar la luz que incide sobre stas. Como el tamao de las clulas microbianas en una poblacin es casi constante, el grado de dispersin es proporcional a la concentracin de las clulas presentes. Cuando la concentracin de las bacterias alcanza casi 10 millones de clulas por ml. el medio aparece ligeramente turbio. Un incremento de la poblacin produce un incremento de la turbidez y una disminucin de la luz transmitida a travs del medio. Se puede medir el grado de dispersin de la luz con un espectrofotmetro y prcticamente se observa una relacin lineal con la concentracin bacteriana hasta cierto nivel de absorbancia (Kathy Barrer, 1998:270). El mtodo ptico de medicin del crecimiento depende de la interrupcin y la desviacin de luz por el tamao coloidal de las clulas bacterianas. La cantidad de luz que se pierde es inversamente proporcional a la concentracin celular o directamente proporcional a la absorbancia (densidad ptica). La luz que se pierde puede ser determinada por medicin de la cantidad difractada o reflejada (nefelometr) o la cantidad de luz transmitida (turbidimetra), as pues el nmero bacteriano es directamente proporcional a la absorbancia e inversamente proporcional al % de transmitancia (Susan G. Kelley et al., 1991:150, Harry W. Seeley et al., 1991:93). Absorbancia = log 100 log%T 9.2.4.1 Material 1 2 5 1 6 2 Tubo 0.5 del nefelmetro de Mc Farlan Espectrofotmetros por grupo pipetas estriles de 5mL por equipo Propipeta por equipo tubos de caldo nutritivo con 5mL cada uno por equipo mecheros por equipo
9.2.4.2 METODOLOGA 1. Hacer una serie de 5 diluciones en los tubos con agar nutritivo (marcados del 1 al 5) dejando 1 tubo sin inocular como blanco para calibrar el espectrofotmetro. a) Transferir 5mL del cultivo orinal de E. coli al tubo nmero 1 de caldo nutritivo y mezclar perfectamente. Haciendo este tubo la dilucin 1:2. b) Transferir 5mL del tubo nmero 1 al tubo marcado con el nmero 2, mezclar perfectamente. Haciendo este tubo la dilucin 1:4.
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c) Transferir 5mL de la dilucin 1:4 (tubo 2) a otro tubo de caldo nutritivo (tubo 3), mezclar perfectamente y este tubo ser la dilucin 1:8 d) Transferir 5mL de la dilucin 1:8 (tubo 3) hacia otro tubo de caldo nutritivo (tubo 4), mezclar perfectamente y este tubo ser la dilucin 1:16 e) Transferir 5mL de la dilucin 1:16 (tubo 4) hacia otro tubo de caldo nutritivo (tubo 5), mezclar perfectamente y este tubo ser la dilucin 1:32 f) De este ultimo tubo tome 5mL y deschelos en un frasco con desinfectante. 2. Usando el espectrofotmetro (figura 22), ajuste a una longitud de onda de 525nm. a) Ajuste a 0% de Transmitancia. b) Con el tubo blanco ajuste a 0% de absorbancia c) Lea cada uno de los tubos incluyendo el tubo sin diluir y anote la absorbancia obtenida d) Lea un tubo 0.5 del nefelometro de Mc Farlan y realice los clculos para obtener la concentracin por mililitro en cada uno de sus tubos, grafique los datos y disctalos.
Figura 22. Medicin bacterian por espectrofotometra.
9.2.4.3 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre: _________________________ Fecha: ____________ Materia: __________________ CALCLOS
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Densidad ptica vs Concentracin bacteriana Dilucin Absorbancia Estndar (0.5) ___________ Sin diluir ___________ 1:2 ___________ 1:4 ___________ 1:8 ___________ 1:16 ___________ 1:32 ___________ GRAFIQUE.
bacterias por mL ______________ ______________ ______________ ______________ ______________ ______________ ______________
9.3 DISCUSIN __________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ __________________________ 9.4 CONCLUSIONES __________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ __________________________
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PRACTICA # 10 METABOLISMO: FERMENTACIN DE AZCARES 10.1 OBJETIVO El alumno conocer las diversas rutas de utilizacin de los carbohidratos por las bacterias en base a la produccin de metabolitos secundarios tales como: cidos, aminas o gas. Poniendo de manifiesto a las enzimas presentes en los microorganismos con la finalidad de poder definir la especie bacteriana con la que se este trabajando. Al concluir la prctica, el alumno ser capaz de determinar la capacidad de un organismo para degradar los hidratos de carbono especficos presentes en cada medio. 10.2 INTRODUCCIN. Fermentacin es el trmino aplicado ordinariamente a la ruptura anaerbica de los carbohidratos. El propsito de la fermentacin es generar energa disponible para la utilizacin por el microorganismo, algunos carbohidratos son fuente rica en energa almacenada. El que un carbohidrato pueda ser degradado o no por un microorganismo depende de la presencia de protenas transportadoras llamadas permeasas y de endoenzimas denominadas carbohidrasas. Los productos finales de la fermentacin pueden variar de un organismo a otro dependiendo de la ruta metablica involucrada. Adems, los productos finales son usualmente cidos de varios tipos o cidos y gas (Susan G. Kelley et al., 1991:197) La habilidad de fermentar puede ser determinada por inoculacin de un organismo hacia el tubo de fermentacin que contiene un caldo nutritivo que soportara el crecimiento del organismo, una fuente de carbohidrato definida (de inters), un indicador de pH y una campana de Durham invertida para colectar gas. El propsito de esta campana es atrapar el gas que se genera, si este es generado como producto final del metabolismo (Susan G. Kelley et al., 1991:197). Si el organismo no es capaz de degradar el carbohidrato especfico, puede haber crecimiento debido a la utilizacin de los nutrientes presentes en el caldo y en este caso el pH no cambiara o se podr observar un pH ms bsico. (Susan G. Kelley et al., 1991:198). Algunos organismos pueden tomar aminocidos del caldo y convertirlos en molculas similares a carbohidratos llamadas alfa ceto-cidos. Esta conversin resulta en la formacin de amonio (NH3) el cual causa que el medio se alcalinice. El indicador prpura de bromocesol puede virar aun color prpura profundo,
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cuando se utiliza rojo de fenol este indicador vira a un color magenta profundo (Susan G. Kelley et al., 1991:198).
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10.3 MATERIAL 1. 2. 3. 4. Cultivos de 18 a 24 hrs de E. coli, Staphylococcus aureus,Pseudomonas sp . 5 tubos de caldo rojo de fenol- glucosa, estriles. 5 tubos de caldo rojo de fenol- sacarosa, estriles 5 tubos de caldo rojo de fenol- lactosa, estriles 10.4 METODOLOGA. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Realice una tincin de Gram a cada una de las cepas proporcionadas. Inocule la serie de tres carbohidratos con cada una de las cepas. Mantenga un tubo sin inocular como control negativo. Incubar todos los tubos a 370C. Leer los tubos a las 24, 48, 72 hrs y a los 7 das. Durante cada periodo de lectura comparar los tubos inoculados contra el control para determinar si existe crecimiento o bien si existe produccin de cido o gas. 7. Anota tus resultados en la tabla.
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10.5 RESULATDOS Y OBSEVACIONES Tabla 8. Resultados de fermentacin de azcares. ORGANISMO TIEMPO 24 horas 48 horas Control negativo 72 horas 7 das 24 horas Escherichia coli Gram: 48 horas 72 horas 7 das 24 horas Staphylococcus aureus Gram: 48 horas 72 horas 7 das 24 horas Pseudomonas sp. Gram: 48 horas 72 horas 7 das NC = no hay cambio AG = cido y gas A = cido Alc. = Alcalino 10.6 DISCUSIN __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ CARBOHIDRATO PR-GLUCOSA PR-SACAROSA PR-LACTOSA
10.7 CONCLUSIONES
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__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
PRCTICA 11 PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS PRIMARIAS. CATALASA Y OXIDASA. 11.1 OBJETIVOS Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de: 1. Conocer cules son las pruebas bioqumicas primarias y secundarias, as como su utilidad en la identificacin de bacterias. 2. Escribir la ecuacin general de la reaccin de catalasa y de manera general la ecuacin de oxidasa. 3. Describir el fundamento de las pruebas bioqumicas secundarias. 4. Nombrar y reconocer los reactivos utilizados en las pruebas bioqumicas primarias y secundarias. 11.2 INTRODUCCIN La catalasa y la oxidasa son enzimas que juegan un papel importante en los pasos terminales de la cadena de transporte de electrones. Cuando los electrones son transportados al oxgeno se forma perxido de hidrgeno (H 2O2). La catalasa degrada el perxido formado a oxgeno y agua. La generacin de oxgeno es muy vigorosa y puede ser observada como formacin de burbujas, esta es la base de la prueba de Catalasa. Esta enzima se encuentra en anaerobios obligados, la falta de la catalasa es la razn de que el oxgeno sea txico para estos microorganismos. (Susan G. Kelley et al., 1991:211) La enzima oxidasa es sintetizada por muchos organismos aerobios los cuales tienen citocromos del tipo c. Esta enzima adems oxida ciertas aminas para formar productos coloreados, algunos grupos de bacterias no tienen la enzima y la presencia o ausencia es su xito taxonmico (Susan G. Kelley et al., 1991:211). Prueba de la citocromo oxidasa Los citocromos oxidasa son hemoprotenas que contienen hierro y actan como el ltimo eslabn de la cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones al
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oxgeno, con la formacin de agua. En este sistema se encuentra en las bacterias aerobias y anaerobias facultativas. El sistema citocromo en general slo se encuentra en organismo aerbicos, lo que los hace capaces de utilizar el oxgeno como un aceptor de hidrgeno final para reducir el oxgeno molecular en perxido de hidrgeno, el ltimo enlace de la cadena respiratoria aerbica. La prueba de reactivos como el diclorhidrato de p-fenilendiamina, acta como aceptor artificial de electrones, sustituyendo al oxgeno. La p-fenilendiamnina es incolora en estado reducido, pero en presencia de citocromo oxidasa y oxgeno atmosfrico se oxida formando azul de indofenol. Produccin de oxidacin-fermentativa Las bacterias utilizan los carbohidratos por dos procesos; oxidacin y fermentacin. Algunas bacterias son capaces de metabolizar un carbohidratos (manifiesta por la produccin de cido) slo en condiciones aerbicas; otras producen cido tanto en condiciones aerbicas como anaerbicas. La fermentacin es un proceso anaerbico y los fermentadores bacterianos de un carbohidrato son por lo general anaerbicos facultativos. La diferencia principal entre el metabolismo fermantativo y el metabolismo oxidativo de un carbohidrato depende de los requerimientos de oxgeno atmosfrico y de la fosforilacin inicial. La fermentacin es un proceso anaerbico que requiere la fosforilacin inicial de la glucosa previamente a su degradacin, mientras que la oxidacin en ausencia de compuestos inorgnicos como nitrato y sulfato es un proceso estrictamente aerbico que comprende la oxidacin directa de una molcula de glucosa no fosforilada inicialmente. 11.2.1 MATERIAL A. Prueba de Catalasa Cultivos de 18 a 24 horas de Enterococcus faecalis y Staphylococcus aureus Agar Soya trpticaseina 1 frasco de Perxido de hidrgeno 3% con 10mL por grupo B. Prueba de oxidasa Cultivos de 18 a 24 horas de Pseudomonas sp. y E. coli Discos de papel filtro de 5 a 10cm de dimetro Aplicadores estriles Solucin acuosa al 1% de tetrametil-p-felieldiamina (reactivo de Kovacs)
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11.2.2 METODOLOGA PARTE A 11.2.2.1 CATALASA 1. Con un palillo estril coloque una pequea muestra del organismo a estudiar en un porta objetos. 2. Coloque el aplicador utilizado en un frasco de vidrio con desinfectante 3. Agregue una gota de peroxido de hidrgeno y observe 11.2.2.2 OXIDASA 1. Con un palillo estril coloque una pequea muestra del organismo a estudiar en un disco de papel filtro estril. 2. Coloque el aplicador utilizado en un frasco de vidrio con desinfectante 3. Agregue una gota de reactivo de Kovacs y observe.
11.2.3 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Tabla 9. Resultados de las pruebas de oxidasa y catalasa. PRODUCCIN DE OXIDASA + Pseudomonas sp. Escherichia coli Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus PRODUCCIN DE CATALASA + -
11.2.4 DISCUSION __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
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__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 11.2.5 CONCLUSIONES __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ 11.3 PARTE B PRUEBAS BIOQUMICAS SECUNDARIAS 11.3.1 INDOL El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de m.o. La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo del reactivo de Kovacs descrito ms adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano. 11.3.1.1 Procedimiento Inocular la el medio MIO o caldo triptofano con el m.o. en estudio e incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo. 11.3.1.2 Interpretacin El desarrollo de un color rojo intenso en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de aadir el reactivo indica la presencia de indol y un resultado de la prueba positiva. 11.3.1.3 Controles Escherichia coli: positivo Klebsiella pneumoniae: negativo (mayora de las cepas)
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11.3.2 ROJO DE METILO - VOGES-PROSKAUER (RM VP) Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentacin cido-mixta y la fermentacin del 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H 2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixta. El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia 11.3.2.1 Procedimiento Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del m.o. en estudio. Incubar a 35C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin transferir 1 mL del caldo a un tubo limpio para VP. En el caldo restante revelar RM agregando unas 4 - 8 gotas del indicador rojo de metilo. Para revelar VP agregar 0,6 ml (10 gotas) de alfa-naftol al 5% y 1 gota de KOH al 40%. Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. 11.3.2.2 Interpretacin La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica que la produccin de cido es suficiente para producir el viraje del indicador y el m.o. ferment la glucosa por la va de cido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo. La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15 minutos, que indica la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona. 11.3.2.3 Controles RM positivo, VP negativo: Escherichia coli RM negativo, VP positivo: Enterobacter aerogenes
11.3.3 UTILIZACIN DE CITRATO
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La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de enterobacterias. 11.3.3.1 Principio La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6. 11.3.3.2 Procedimiento Se inocula la superficie del agar inclinado con una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a 35C durante 4 das. 11.3.3.3 Interpretacin El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no de un viraje del indicador al azul. 11.3.3.4 Controles Positivo: Klebsiella spp. Negativo: E.coli 11.3.4 DESCARBOXILACIN DE LISINA Y ORNITINA La descarboxilacin de aminocidos es llevada a cabo por descarboxilasas y se forman aminas y CO2. Cada descarboxilasa es especfica para un aminocido y la reaccin es completa e irreversible. Los aminocidos ensayados habitualmente para la identificacin son lisina, ornitina y arginina. 11.3.4.1 Principio El caldo descarboxilasa de Moeller es el medio base ms comnmente usado para la determinacin de las descarboxilasas en enterobacterias. Se prepara un tubo con el medio conteniendo el aminocido a ensayar y un tubo control con medio base sin aminocido. Se cubren con una capa de aceite mineral (vaselina lquida) para hacer el medio anaerobio de manera que ocurra la fermentacin de la glucosa que contiene. Durante las primeras etapas de la incubacin en ambos tubos se observar viraje del indicador de pH del medio al cido, por la fermentacin de la glucosa. Luego, si el aminocido es descarboxilado, se forman aminas que provocan un retorno al color original del medio o un viraje al alcalino. Caldo Lisina o Ornitina de Moeller: Preparar igual al medio base y agregar 10 g del aminocido (1% de concentracin final de la forma levo, utilizar el doble si se
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usa la forma dl del aminocido ya que solo la levo es activa). Agregar aceite mineral para formar una capa de 1 cm de espesor. Es posible utilizar para esta prueba bioqumica los medio de LIA y MIO los cuales tambin permiten la identificacin de la descarboxilacin de los aminocidos. 11.3.4.2 Procedimiento Inocular con un cultivo puro de 24 horas un tubo de base de Moeller con el aminocido a estudiar (lisina u ornitina) y un tubo de la base (control sin aminocido). Incubar a 35C durante 18 a 24 horas. 11.3.4.3 Interpretacin El ensayo puede ser ledo si en el tubo control se observa crecimiento y viraje del indicador al amarillo indicando que se dio la fermentacin de la glucosa y un descenso de pH que permite la activacin de las descarboxilasas. El retorno al color azul-violeta en el tubo que contiene el aminocido indica una reaccin positiva debida a la liberacin de aminas por descarboxilacin. 11.3.4.4 Controles Descarboxilacin de lisina positiva: Enterobacter aerogenes Descarboxilacin de lisina negativa: Enterobacter cloacae Descarboxilacin de ornitina positiva: Serratia spp Descarboxilacin de ornitina negativa: Klebsiella spp.
11.3.5 FENILALANINA DESAMINASA La fenilalanina es un aminocido que por desaminacin oxidativa forma un cetocido, el cido fenilpirvico. Slo los gneros Proteus y Providencia poseen la fenilalanina desaminasa, lo que permite diferenciarlas del resto de las Enterobacterias. 11.3.5.1 Principio La prueba de la fenilalanina se basa en la deteccin del cido fenilpirvico luego del desarrollo del m.o. en un medio que contiene fenilalanina. Para eso se agrega cloruro frrico que forma un complejo de color verde con el cido fenilpirvico. El medio de cultivo no puede contener extractos de carne o peptonas por su contenido variable en fenilalanina. 11.3.5.2 Procedimiento Inocular el agar en pico de flauta con un cultivo puro de 24 horas e incubar a 35C durante 18-24 horas. Luego de transcurrido el perodo de incubacin,
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agregar 4 o 5 gotas de reactivo de cloruro frrico, directamente sobre la superficie del agar. 11.3.5.3 Interpretacin La aparicin inmediata de un color verde intenso indica la presencia de cido fenilpirvico y una prueba positiva. 11.3.5.4 Controles Positivo: Proteus Negativo: Escherichia coli
11.3.6 TSI (TRIPLE SUGAR IRON) El agar triple azcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambin permite la deteccin de la produccin de H2S. Es un medio til para la identificacin de enterobacterias. 11.3.6.1 Principio El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan dos cmaras de reaccin dentro del mismo tubo. La porcin inclinada (pico) expuesta en toda su superficie al oxgeno es aerobia y la porcin inferior (fondo) est protegida del aire y es relativamente anaerobia. Al crecer un m.o. en el TSI, el pico tiende a virar al pH alcalino (color rojo por el rojo fenol) por la produccin de aminas, debido a la utilizacin aerobia de las peptonas. En el fondo del tubo -donde no hay oxgeno- la degradacin de peptonas es menor y no se generan aminas, de manera que se pueden detectar la produccin de pequeas cantidades de cido (color amarillo por el rojo fenol). Si se inoculan m.o. no fermentadores no se formarn cidos, pero por la produccin de aminas en el pico, todo el medio quedar rojo. La glucosa en el TSI est en una proporcin 10 veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el TSI es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de cido producida por fermentacin ser baja (porque la cantidad de glucosa inicial es baja). En las primeras horas (10 a 16 hs) de incubacin se producir viraje del indicador al amarillo en todo el tubo (pico y fondo), pero al continuar la incubacin, el pico del tubo retornar al rojo por la produccin de aminas debida a la degradacin aerobia de las peptonas antes descrita. Si el m.o. fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de estos azcares son 10 veces mayores a la glucosa, se producir gran cantidad de cido
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(que no puede ser neutralizado por la produccin de aminas en la superficie), por lo tanto todo el tubo (pico y fondo) virar al color amarillo (cido). La produccin de H2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitacin del sulfuro ferroso (negro). Como esta reaccin se da preferencialmente en medio cido, un ennegrecimiento del fondo del tubo (que puede cubrir todo el fondo del tubo y enmascarar el color amarillo) se lee como fermentacin de algunos de los azcares del medio. Adems puede observarse la produccin de gas (H2 y CO2), ya sea como burbujas en el fondo del tubo, por ruptura del agar o desplazamiento del mismo hacia la superficie. 11.3.6.2 Procedimiento Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35 C durante 18-24 hs, pero no ms de 24 hs. 11.3.6.3 Interpretacin y Controles Para el TSI siempre se informa el resultado en el siguiente orden: pico, fondo, produccin de gas y H2S. Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc/gas-/H2S-) No hay fermentacin de azcares. Caracterstica de bacterias no fermentadoras como Ej. Pseudomonas sp Pico alcalino/fondo cido (Alc/A/gas-/ H2S-) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay produccin de gas ni de H2S. Ej. Shigella spp. Pico alcalino/fondo cido (Alc/A/gas-/ H2S+) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay produccin de gas, si de H2S. Ej. Salmmonella typhi. Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/gas+/H 2S+) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin de gas y produccin de cido sulfhdrico. Ej. Salmonella spp. (la mayora de las especies de Salmonella). Pico cido/fondo cido (A/A) Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H2S o no. E.coli (A/A/H2S -)
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A estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas. Ej. A/A/gas+/H2S-.
11.3.7 LIA (LYSINE IRON AGAR) Este ensayo permite diferenciar los m.o. que producen descarboxilacin o desaminacin de la lisina. Se puede detectar adems la produccin de H 2S. Es muy utilizado en las tcnicas de bsqueda de Salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias de aspecto similar en los medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo. 11.3.7.1 Principio Durante las primeras etapas de la incubacin el fondo virar el indicador de pH del medio al cido (amarillo) por la fermentacin de glucosa. Luego, si el aminocido es descarboxilado se formarn aminas que provocan un retorno al color original del medio o hacia un viraje al bsico (color violeta). En la desaminacin se produce un cido carboxlico y NH 3 y se visualiza en la superficie la aparicin de un color rojo intenso. La produccin de H 2S a partir de tiosulfato se visualiza por la precipitacin de sulfuro ferroso de color negro. 11.3.7.2 Interpretacin y controles pico alcalino/fondo alcalino/H2S +, descarboxilacin de lisina positiva. Ej.: Salmonella choleraesuis. pico rojo/fondo cido/H2S-, desaminacin de lisina positiva, descarboxilacin de lisina negativa. Ej.: Proteus mirabilis. pico alcalino/fondo cido/H2S- descarboxilacin de lisina negativa. Ej. E. coli pico alcalino/fondo cido/H2S+ descarboxilacin de lisina negativa, produccin de H2S. Ej. Citrobacter freundii.
11.3.8 PRODUCCIN DE PIGMENTOS PARA PSEUDOMONAS SP. La capacidad para producir pigmentos como pioverdina (fluorescena) y piocianina es una caracterstica importante para la identificacin de especies de Pseudomonas. Algunas de ellas elaboran slo fluorescena (ej. Ps. fluorescens) y otras ambos pigmentos (ej. Ps. aeruginosa). La piocianina solamente es producida por Ps. aeruginosa aunque no todas las cepas de esta especie la producen. Se han diseado medios de cultivo que potencian la elaboracin de uno de los pigmentos e inhiben la formacin del otro. 11.3.8.1 Principio El medio King A (o Pseudomonas Agar P) potencia la elaboracin de piocianina mientras que el King B (o Pseudomonas Agar F) potencia la elaboracin de
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fluorescena e inhibe parcialmente la de piocianina. Estos pigmentos son solubles en agua y difunden al medio. La piocianina es un pigmento azul-verde mientras que la fluorescena es amarillo-verdoso y fluoresce cuando es expuesto a la luz UV (*=254 nm). Existen pigmentos amarillo-verdosos producidos por algunas especies de Pseudomonas que no fluorescen. Los medios se reparten en tubos, se esterilizan a 121C durante 15 minutos y se dejan solidificar inclinados. 11.3.8.2 Procedimiento Inocular los tubos por estras. Incubar a 35C durante 24 hs. 11.3.8.3 Interpretacin Observar al UV, la produccin de pigmento azul-verdoso en el medio King A y la de pigmento amarillo-verdoso, en el King B 11.3.8.4 Controles Pseudomonas aeruginosa: King A + P. fluorescens: King A P. fluorescens: King B + P. stutzeri: King B 11.3.9 DNASA - DESOXIRRIBONUCLEASA La actividad desoxirribonucleasa (DNAsa) se ha demostrado fundamentalmente en los gneros Staphylococcus y Serratia y consiste en la propiedad de degradar el ADN a fracciones de menor peso molecular. Esta caracterstica se ha utilizado para identificar las especies de Serratia marcescens y Staphylococcus aureus. Weckman y Catlin demostraron la estrecha correlacin entre la produccin de DNAsa de los cultivos de Staphylococcus aureus con la produccin de coagulasa. 11.3.9.1 Principio Los m.o. DNAsa positivos degradan el DNA cuando son incubados en un medio que lo contiene. Esto puede ser visualizado de diferentes maneras: ya sea inundando las placas crecidas con HCl 0,1 N y observando zonas transparentes alrededor de las estras o incorporando al medio indicadores como azul de toluidina o verde de metilo (viran a rosado cuando el test es positivo). 11.3.9.2 Procedimiento Estriar la superficie de la placa e incubar a 35C durante 18-24 horas. Observar el viraje del indicador a rosado alrededor de las estras. 11.3.9.3 Interpretacin
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Un resultado positivo est dado por el viraje del indicador en la zona de la estra a rosado. 11.3.9.4 Controles Positivo: S.aureus y Serratia marcescens Negativo: S.epidermidis 11.3.10 COAGULASA La coagulasa es una enzima proteica con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibringeno en fibrina, provocando la formacin de un cogulo visible en un sistema analtico adecuado. Se cree que la coagulasa funciona in vivo, produciendo una barrera en el sitio de infeccin estafilocccica. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza ms comnmente para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otros Staphylococcus. 11.3.10.1 Principio La coagulasa se halla presente en dos formas, libre y fija, cada una de las cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de tcnicas de determinacin diferentes: Coagulasa fija (prueba en portaobjetos): la coagulasa fija est unida a la pared celular bacteriana. Los hilos de fibrina formados entre las clulas suspendidas en plasma (que contiene fibringeno) provocan su aglutinacin, indicada por la presencia de agregados visibles en el portaobjetos. Coagulasa libre (prueba en tubo): la coagulasa libre es una enzima extracelular que se halla presente en los filtrados de cultivos. Cuando una suspensin de bacterias productoras de coagulasa se mezcla en partes iguales con plasma en un tubo de ensayo, se forma un cogulo visible como consecuencia de la utilizacin de los factores de coagulacin del plasma de manera similar a cuando se aade trombina. 11.3.10.2 Procedimiento Prueba en portaobjetos Colocar una gota de agua destilada sobre un portaobjetos Emulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de manera de obtener una suspensin cargada homognea. Agregar una gota de plasma reconstituido junto a la gota de la suspensin del m.o. Mezclar bien con el ansa. Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la formacin inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos. Prueba en tubo Colocar aspticamente 0,5 ml de plasma reconstituido en el fondo de un tubo estril.
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Aadir 0,5 ml de cultivo de 24 horas (o suspensin en suero fisiolgico de un cultivo en placa). Mezclar por rotacin el tubo, evitando remover o agitar el contenido. Colocar en bao de agua a 37C y observar cada hora hasta 4 horas y luego a las 24 horas, la formacin de un cogulo visible. 11.3.10.3 Interpretacin Prueba en portaobjetos: una reaccin positiva se detecta usualmente en 15 a 20 segundos por la aparicin de un precipitado granular. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinacin en 2 a 3 minutos. Esta prueba es solo presuntiva y todos los cultivos que den resultados negativos o positivos tardos deben verificarse mediante la prueba en tubos ya que algunas cepas de Staphylococcus aureus no producen coagulasa fija. Prueba en tubos: 1+: pequeos cogulos no organizados. 2+: pequeos cogulos organizados. 3+: gran cogulo organizado. 4+: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando se invierte el tubo. Se consideran positivos los grados 3+ y 4+ 11.3.10.4 Controles Positivo: S.aureus Negativo: S.epidermidis
11.3.11 PRUEBA DE LA BILIS ESCULINA La prueba de la bilis-esculina est basada en la capacidad de ciertas bacterias, particularmente los estreptococos del grupo D, de hidrolizar la esculina en presencia de bilis al 1 o 4%. La esculina es, qumicamente, un derivado de la cumarina (6-b-glucsido-7-hidroxicumarina), que por su estructura pertenece a los glucsidos. Por definicin, stos estn constitudos por dos restos unidos por un puente de oxgeno. En el caso de la esculina, uno de los restos es una glucosa y el otro la 7-hidroxicumarina (que no es un hidrato de carbono, y es denominado aglucona). 11.3.11.1 Principio Las bacterias capaces de desarrollar en bilis y tambin hidrolizar esculina, producen glucosa y esculetina (7,7 dihidroxicumarina) y sta puede visualizarse en un medio con una sal de hierro, por formacin de un complejo marrn oscuro o negro.
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Algunos medios bilis-esculina incluyen tambin azida sdica para inhibir el desarrollo de organismos Gram negativos, transformndose en selectivos para estreptococos. 11.3.11.2 Procedimiento Se estra el organismo en estudio en placas o tubos en pico de flauta del medio bilis-esculina. Se incuba a 37C durante 24 horas.
11.3.11.3 Interpretacin La esculetina difunde hacia el medio de agar por ser hidrosoluble. La reaccin es positiva si se observa un ennegrecimiento difuso del tubo o un halo marrn oscuro o negro alrededor de las colonias en placa. 11.3.11.4 Controles Positivo: streptococo del grupo D Negativo: estreptococo no del grupo D 11.3.12 UREASA Introduccin La urea es una diamida del cido carbnico que puede ser hidrolizada con liberacin de amonaco y dixido de carbono. 11.3.12.1 Principio La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de m.o. que pueden hidrolizar urea de acuerdo a la siguiente reaccin qumica: El amonaco reacciona en solucin para formar carbonato de amonio, producindose alcalinizacin y aumento de pH del medio. El caldo urea y agar urea de Christensen son los dos medios mas comnmente usados en los laboratorios para la deteccin de la ureasa de m.o. 11.3.12.2 Procedimiento Inocular el caldo con una ansada cargada con el cultivo puro del m.o. o estriar la superficie del agar. Incubar a 35C durante 24 hs. 11.3.12.3 Interpretacin Los m.o. que hidrolizan urea rpidamente pueden producir reacciones positivas en 1 a 3 hs. Las especies ms lentas pueden requerir 3 o ms das. Caldo: una coloracin rojiza indica alcalinazacin e hidrlisis de urea Agar: una coloracin rojiza en el medio indica hidrlisis de urea positiva. Los degradadores lentos producen coloracin parcial (generalmente el pico), los
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rpidos producen coloracin en todo el tubo. Si no hay hidrlisis el medio permanece con el colo original (amarillo) y se observa crecimiento. 11.3.12.4 Controles Positivo: Proteus sp Negativo: Escherichia coli
11.4 DISCUSIN __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
11.5 CONCLUSIONES __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
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PRCTICA 12 HONGOS Y LEVADURAS 12.1 OBJETIVO: El alumno conocer la clasificacin taxonmica de los hongos y levaduras para conceptuar el reino al que pertenecen cada uno de ellos as como las partes fundamentales de los mismos, para tener un panorama general del uso industrial de estos microorganismos. Reconocer las estructuras bsicas de los hongos as como identificara sus esporas asexuales. Aprendera cuales son los princiapales usos de estos organismos a nivel industrial 12.2 INTRODUCCIN Los hongos son un grupo complejo de microorganismos eucariontes que pueden ser unicelulares (levaduras) hasta multicelulares (formando micelios). Se han clasificado en un quinto reino dentro del sistema taxonmico. Los hongos son importantes como contaminantes en el laboratorio, pero tambin son importantes a nivel industrial por su uso en la elaboracin de nuevos alimentos, sntesis de antibiticos y productos qumicos (Susan G. Kelley et al., 1991:43). La forma de crecimiento de muchos hongos es una clula tubular llamada hifa la cual crece de el tip y puede formar diversas ramificaciones las cuales son llamadas micelio, una caracterstica morfolgica que los divide es si estn septados o no. (Susan G. Kelley et al., 1991:43). 12.2.1 Clasificacin: Se ha clasificado en base al tipo de reproduccin sexual que realizan (Susan G. Kelley et al., 1991:43) 1. Hongos verdaderos: a) Zigomicota a) Ascomicota b) Basidiomicota c) Quitridiomicetos 2. Mohos acuticos (Oomycota)
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3. Mohos mucosos: Mohos mucosos celulares (Acrasiomycota) Mohos mucosos acelulares (Myxomycota) 12.2.2 Estructura El cuerpo o estructura vegetativa de un hongo se denomina talo. Su complejidad es variable, y va desde las levaduras unicelulares microscpicas y los mohos multicelulares, los bejines o cuescos de lobo macroscpicos, hasta las setas. La clula del hongo suele estar cubierta por una pared celular de quitina. La quitina es un polisacrido resistente pero flexible, que contiene nitrgeno y que consta de residuos de N-acetilglucosamina. Muchos hongos son tienen dos formas morfolgicas, una forma de levadura bajo ciertas condiciones y una forma micelial bajo otras condiciones (Susan G. Kelley et al., 1991:43). Una levadura es un hongo unicelular con un nico ncleo que se reproduce de forma asexual o por gemacin y divisin transversal o por reproduccin sexual a travs de la formacin de esporas. Cada yema que se separa puede crecer y convertirse en una nueva levadura, y algunas se agrupan para formar colonias. En general las levaduras tienen un tamao mayor que las bacterias no tienen flagelo pero contienen la mayora de los restantes organelos de las eucariotas y suelen ser esfricas. 12.2.3 Reproduccin La reproduccin de los hongos puede ser asexual o sexual. La reproduccin asexual se lleva a cabo de varias maneras: a) Una clula progenitora se divide en dos clulas hijas por constriccin en el centro y formacin de una nueva pared celular. b) Las clulas vegetativas somticas pueden formar yemas para producir nuevos organismos. Esto es muy comn en las levaduras. c) El mtodo ms comn de reproduccin asexual es la produccin de esporas. La formacin asexual de esporas ocurre en un hongo individual mediante mitosis y posterior divisin celular. Existen varios tipos de esporas asexuales: Una hifa se puede fragmentar para formar clulas que se comportan como esporas. Estas clulas reciben el nombre de artroconidios o artrosporas. Si las clulas estn rodeadas de una gran pared celular antes de su separacin, se denominan clamidisporas. Si las esporas se desarrollan en un saco (esporangio) en la punta de una hifa, reciben el nombre de esporangiosporas.
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Si las esporas no estn incluidas en un saco sino que se producen en la punta o los costados de la hifa, se denominan conidiosporas. Las esporas producidas por gemacin a partir de una clula progenitora vegetativa se llaman blastosporas
12.3 MATERIAL Cultivos de Asperguillis sp, Penicillus sp, C. albicans y muestra de alimento con hongos. Asa bacteriolgica individual 2 Mechero por equipo Desinfectante por equipo 2 frascos goteros con azul de algodn con 5mL por grupo 2 trenes de tincin de gram por grupo 1 Microscopio ptico por equipo Papel seda 12.4 METODOLOGA 1.- Una semana antes de la prctica se debe dejar un alimento en un ambiente hmedo para favorecer el desarrollo de los hongos. 2.- El da de la prctica se colocara un gota de azul de algodn sobre un porta objetos, con el asa bacteriolgica tomar un poco de muestra y colocarla sobre el azul de algodn (nicamente el hongo). 3.- Cuidadosamente mezclar con el asa bacteriolgica, cubrir con un cubreobjetos y observar al microscopio (nicamente en el objetivo de 10 y 40X). 4.- Para observar levaduras se realizara una tincin de gram en una muestra proporcionada por el asesor y observar al microscopio empezando con el objetivo de menor aumento. 5.- Al utilizar el objetivo de 100X agregar una gota de aceite de inmersin al frotis. 6.- Al finalizar la prctica limpie el microscopio y deje inactivando sus frotis en desinfectante. 12.5 RESULATDOS Y OBSERVACIONES
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Organismo____________ Organismo________________ Organismo_____________ Tipo de muestra________ Tipo de muestra_____________ Tipo de muestra________ Tincin_______________ Tincin____________________ Tincin_______________ Objetivo_______________ Objetivo___________________ Objetivo_______________ Estructura que observo:__________________________________________________________ 12.6 DISCUSIN __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 12.7 CONCLUSIONES __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
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ANEXO 1 PREPARACIN DE REACTIVOS (Susan G. Kelley et al., 1991:545-546). A) cido Alcohol Resistentes (Ziehl-Neelsen) Alcohol cido: A 97mL de Alcohol etlico al 95% agregar 3 mL de HCl concentrado (37%) (v/v). Diluir el cido en el alcohol (Susan G. Kelley et. al., 1991:546, Lois Bershir, 1996:254). Solucin A: Pesar 0.3g de Fucsina bsica y disolver en 10mL de alcohol etlico al 95%. Solucin B: Pesar 5g de Fenol en 95mL de agua desinizada o destilada. Mezclar la solucin A y B y dejar por varios das antes d usar. Filtrar a travs de papel filtro hacia un frasco mbar que sirva como Stock (Susan G. Kelley et. al., 1991:545, Lois Bershir, 1996:254). Azul de Metileno Loefflers. Solucin A: Pesar 0.3g de azul de metileno y disolver en 30mL de alcohol etlico al 95%. Solucin B: Pesar 0.01g de KOH en 100mL de agua desinizada o destilada. Mezclar la solucin A y B y filtrar a travs de papel filtro (Susan G. Kelley et. al., 1991:546, Lois Bershir, 1996:254). B) Tincin de Gram Cristal Violeta. Solucin A (genciana) pesar 2g de violeta de genciana y disolver en 20mL de alcohol etlico al 95%. (Susan G. Kelley et. al., 1991:545, Lois Bershir, 1996:222) Solucin B. Pesar 0.8g de oxalato de amonio en 80mL de agua destilada o desionizada. (G. Kelley et. al., 1991:545, Lois Bershir, 1996:222) Mezclar la solucin A con la solucin B y almacenar 24 horas. Filtrar a travs de papel filtro hacia un frasco mbar que sirva como Stock. (G. Kelley et. al., 1991:545, Lois Bershir, 1996:222) Ioduro: Disolver 2g d KI en 300mL de agua destilada o desionizada, cuando este completamente disuelto, adicionar 1g de I 2. (G. Kelley et. al., 1991:545, Lois Bershir, 1996:222) Alcohol-acetona: Mezclar 80mL de alcohol etlico al 95% con 20mL de acetona. (G. Kelley et. al., 1991:545, Lois Bershir, 1996:223) Safranina: Preparar 10mL de una solucin de Safranina O al 2.5% disuelta en alcohol etlico al 95% y mezclar en 100mL de agua desionizada o destilada. (G. Kelley et. al., 1991:545, Lois Bershir, 1996:223) C) Tincin de Flagelos (Lieffson)
95
Solucin A: Preparar una solucin de cloruro de sodio al 1.5% en agua desionizada o destilada. Solucin B: Preparar una solucin de cido tanico al 30% en agua desionizada o destilada. Solucin C: Prear una solucin de 0.9% de acetato de pararosanilina, 0.3% de hidrocloruro de parasonanilina (o 1.2% de fucsina bsica en alcohol etlico al 95% tincin especial de Flagelos). Dejar por varias horas en el agitador para disolver el colorante. Mezclar 1 parte de la solucin A con 1 parte de solucin B, una vez hecha la mezcla adicionar 1 parte de solucin C. Nota: esto se puede hacer el da de uso para obtener mejores resultados. Esta solucin puede ser almacenada a 4 0C por 1-2 meses.
D)
Tincin de esporas Verde de malaquita (5% acuoso): Disolver 0.5g de verde de malaquita en 100mL de agua destilada o desionizada (Lois Bershir, 1996:237). Safranina (0.5% acuosa): Disolver 0.5g de Safranina O en 100mL de agua destilada o desinizada (Lois Bershir, 1996:237)
E)
Perxido de hidrgeno: A 10mL d perxido de hidrgeno al 30% adicionar agua destilada o desionizada para hacer 100mL. (G. Kelley et. al., 1991:545)
F)
Reactivo de Indol (Kovacs). Pesar 5g de p-dimetilamino benzaldehdo y disolver en 75mL de alcohol amilico o butilalcohol, una vez disuelto agregar 25mL de HCl concentrado. (G. Kelley et. al., 1991:546) Nota: Disolver el reactivo en el alcohol calentando a 37 0C en bao mara, cuando este completamente disuelto adicionar el HCl cuidadosamente con agitacin. (G. Kelley et. al., 1991:546)
G)
Azul de Bromotimol (0.05%). Pesar 0.05g de azul de bromotimol en 8mL de NaOH 0.01N y aforar a 100mL de agua desionizada o destilada. (G. Kelley et. al., 1991:546)
H)
Rojo de metilo:
96
Pesar 0.2g de rojo de metilo y disolver en 500mL de alcohol etlico, una vez disuelto aforar a 500mL con agua destilada o desionizada. Filtrar en caso de ser necesario. I) Identificacin de nitratos: Solucin A: Pesar 0.8g de cido sulfanlico y disolver en 100mL de cido actico 5N (Para preparar el cido se agrega 1 parte de cido actico y 2.5 partes de agua desinonozada o destilada) (G. Kelley et. al., 1991:546) Solucin B: pesar 0.5g de N-Ndimetil-1-naftilamina (dimetil -naftilamina) y disolver en 100mL de cido actico 5N. (G. Kelley et. al., 1991:546) J) Voges-Proskauer: Solucin A (Barritts A): pesar 0.5g de -naftol en 100mL de alcohol etlico al 95%. Solucin B: Pesar 40g de KOH, 0.3g de creatina y disolver en 100mL de agua desionizada o destilada. (G. Kelley et. al., 1991:546)
97
ANEXO 2 Tabla 10 .Mediciones y controles necesarios para el equipo bsico del laboratorio de microbiologa. (E. Boquet Jimnez et al., 1998:77) EQUIPO Procedimiento Periodo Limites de tolerancia (x 1) C
o
Precauciones Limpieza mensual Descongelar cada 6 meses Limpieza y descongelar cada 6 meses Limpieza mensual
Refrigerador
Registrar temperatura Registrar temperatura
Diario
Congelador Incubadora Incubadora (CO2) Bao mara
Diario
(x 1)oC 35 a 370C
Registrar Diario temperatura Registrar temperatura y Diario concentracin de CO2 Registrar temperatura Diario Diario Cada vez que se use
35 a 370C y 5 a Limpieza mensual 10% 36 a 380C x 10C Limpieza mensual Limpieza cada vez que se use Limpieza cada vez que se use Limpieza cada vez que se use y agregar agua Mantenimiento general cada 6 meses Reactivo catalizador despus de usarse y cambio cada 3 meses Inspeccin general y mantenimiento cada 6-12 meses. Limpieza diaria, inspeccin general y
Placa de Registrar calentamient temperatura o Solucin pH (medidor) calibradora Esporas de B. stearot. Limpieza correcta Tira de azul de metileno Comprobar r.p.m.
x 0.1
Autoclave
Microscopio
Sin contaminacin Semanal (No crecimiento) Cada vez que __ se use Cada vez que se use De azul a blanco
Jarra de anaerobios
Centrfuga
Mensual x x0.05 Cada seis 45 a 55 pies/min
Campana de Flujo de aire y seguridad luz
98
meses Medio ambiente Humedad Registrar temperatura Registr de humedad Diario Diario 22 a 300C 30 a 60%
mantenimiento anual Inspeccin general anual Evitar aparatos que la modifiquen
99
13. BIBLIOGRAFA Seguridad para laboratorios biomdicos, Carlos Castellanos, Luz Mara Lpez, Ricardo Rosales, Oralia Ladrn, Pascal Hrion, Aurora V. Osorio, Gabriel Garduo, UNAM, Instituto de investigaciones Biomdicas (1999) 2. - Microbiologia, Lansing M. Prescott, John P. Harley, Donald A. Klein, Mc GrawHill. Interamericana, Madrid (2000), 4ta ed. 3. - Microbiology Techniques, Susan G. Kelley, Frederick J. Post, Publishing Company, Belmont CA 1991 4.- Selected exercises from microbes in action A laboratory manual of Microbiology, Harry W. Seeley, Jr, Paul J. VanDemark and John J. Lee, 4ta ed, W. H. Freeman and Company, New York, 1991. 5.- Curso de capacitacin para el desempeo de funciones de nivel bsico, Ramn Bordera Vidal, Ed. Formacin Alcal y Ciberprevencin. Marzo 2004, Espaa 6.- Tcnicas de descontaminacin, Ma. J. Garca Garca-Saavedra, J. C. Vicente Garca, Ed Paraninfo, Espaa 1997. 7.- Esterilizacin mtodos y control, M. R. Breach, Ed Manual Moderno S.A. 1976 8.- Microbiology in practice A self-Instrumental Laboratory course, Lois Beishir, Ed Library of congress cataloging-Publication Data, 6ta ed, USA 1996. 9.- Mejora contina de la calidad Gua para los laboratorios clnicos de Amrica latina, E. Boquet Jimnez, M. L. Castillo Snchez, A. L. Cceres de Maselli, R. Dybkaer, V. Escutia, C. Franzini, D. M. Jeffers, D. Mazziotta, K. D. McClatchey, M. J. Moqueen, R. Rej, A. Ruz-Argelles, R. I. Sierra-Amor, A. M. Terres-Speziale, H. Tiburcio, C. E. Wilde, Editorial Mdica Panamericana, Mxico D.F. 1998 10. - At the Bench A laboratory Navigator, Kathy Barrer, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1998 11.- Laboratory Exercises in Microbiology, Robert A Pollack, Lorraine Findlay, Walter Mondschein and R. Ronald Modesto, John Wiley and Sons, INC, USA 2005., 2da ED. 12.- Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. 13.- Norma Oficial Mexicana NOM-052-ECOL-1993.
100
13.- Norma Oficial Mexicana NOM-053-ECOL-1993. 14.- Cook, D.J. 2006. Introduction to techniques and applications. 2a Edicin. Editorial Scion. Inglaterra.
101

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PRACTICA # 1 1.1 OBJETIVO.

TRATAMIENTO Incineracin esterilizacin Esterilizacin

Desinfeccin o esterilizacin Esterilizacin

2.3.1 CUIDADOS DEL MICROSCOPIO

Figura 5. Morfologa de un bacilo gram negativo (tincin de gram).

Figura 6. Morfologa de un coco gram positivo (tincin de gram).

3.3.1.3 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre: _________________________ Fecha: ______ Materia:______________

Organismo____________ _____________ Morfologa_____________ Morfologa_____________ Objetivo_______________ Objetivo_______________ Tincin________________ Tincin________________

Organismo________________ Morfologa________________ Objetivo__________________ Tincin___________________

3.3.2.3 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre: _________________________ Fecha: ____________ Materia: __________________

Organismo____________ Organismo_____________ Morfologa_____________ Morfologa_____________ Objetivo_______________ Objetivo_______________ Tincin________________ Tincin________________

Organismo________________ Morfologa________________ Objetivo__________________ Tincin___________________

Figura 8. Tincin de Espora de Bacillus subtilis (Espora en verde y bacteria roja)

3.3.3.3 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre:_________________________ Fecha:____________ Materia:__________________

3.3.3.5 CONCLUSIONES __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

Figura 10. Tincin Ziehl-Neelsen

3.3.4.3 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre: _________________________ Fecha: ____________ Materia: __________________

Organismo____________ Organismo_____________ Morfologa_____________ Morfologa_____________ Objetivo_______________ Objetivo_______________ Tincin________________ Tincin________________

Organismo________________ Morfologa________________ Objetivo__________________ Tincin___________________

Figura 11. Bacilo con flagelo montrico .

Organismo____________ Organismo_____________ Morfologa_____________ Morfologa_____________ Objetivo_______________ Objetivo_______________ Tincin________________ Tincin________________

Organismo________________ Morfologa________________ Objetivo__________________ Tincin___________________

- Formas vegetativas de bacteria y hongos

GRUPO QUMICO AL QUE PERTENECEN

- Compuestos de amonio cuaternario - Metales pesados - Compuestos oxidantes

PRACTICA # 5 5.1 OBJETIVO

Figura 12. Autoclave

Figura 13. Preparacin de pipetas para su esterilizacin

Figura 17. Tcnica de dilucin en placa

Figura 18. Tcnica de dilucin mtodo europeo

Figura 19. Tcnica de sembrado masivo.

7.6 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre: _________________________ Fecha: ____________ Materia: __________________

Organismo____________ Organismo_____________ Tipo de sembrado_______ sembrado_______ Nmero de colonias_____ colonias_____

Organismo________________ Tipo de sembrado__________ Nmero de colonias ________ Tipo de Nmero de

Organismo____________ Organismo_____________ Tipo de sembrado_______ sembrado_______ Nmero de colonias_____ colonias______

Organismo________________ Tipo de sembrado__________ Tipo de Nmero de

Nmero de colonias ________

Organismo____________ Organismo_____________ Tipo de sembrado_______ sembrado_______ Nmero de colonias_____ colonias______

Organismo________________ Tipo de sembrado__________ Nmero de colonias ________ Tipo de Nmero de

Margen de la colonia Elevacin de la colonia (Figura 20) (Lois Beishir, 1996:116)

Caractersticas de la colonia: __________________________________________ __________________________________________ __________________________________________ Medio de cultivo:____________________________ Alcaligenes faecalis.

Caractersticas de la colonia: __________________________________________ __________________________________________ __________________________________________ Medio de cultivo:____________________________ Staphylococcus aureus.

Figura 21. Siembra en profundidad.

Plate count por mL de la muestra original

Figura 22. Medicin bacterian por espectrofotometra.

bacterias por mL ______________ ______________ ______________ ______________ ______________ ______________ ______________

11.3.3 UTILIZACIN DE CITRATO

A estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas. Ej. A/A/gas+/H2S-.

Registrar temperatura Registrar temperatura

Congelador Incubadora Incubadora (CO2) Bao mara

Mensual x x0.05 Cada seis 45 a 55 pies/min

Campana de Flujo de aire y seguridad luz

mantenimiento anual Inspeccin general anual Evitar aparatos que la modifiquen

También podría gustarte

3.3.1.3 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre: _________ Fecha: Materia:

Organismo______ _ Morfologa_ Morfologa_ Objetivo_ Objetivo_ Tincin Tincin______

Organismo Morfologa Objetivo Tincin_____

3.3.2.3 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre: _______ Fecha: Materia:

Organismo______ Organismo_ Morfologa_ Morfologa_ Objetivo_ Objetivo_ Tincin Tincin______

Organismo Morfologa Objetivo Tincin_____

3.3.3.3 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre:_______ Fecha: Materia:

3.3.3.5 CONCLUSIONES

3.3.4.3 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre: _______ Fecha: Materia:

Organismo______ Organismo_ Morfologa_ Morfologa_ Objetivo_ Objetivo_ Tincin Tincin______

Organismo Morfologa Objetivo Tincin_____

Organismo______ Organismo_ Morfologa_ Morfologa_ Objetivo_ Objetivo_ Tincin Tincin______

Organismo Morfologa Objetivo Tincin_____

7.6 RESULTADOS Y OBSERVACIONES Nombre: _______ Fecha: Materia:

Organismo____ Organismo_ Tipo de sembrado_ sembrado___ Nmero de colonias_ colonias___

Organismo______ Tipo de sembrado Nmero de colonias Tipo de Nmero de

Organismo____ Organismo_ Tipo de sembrado_ sembrado___ Nmero de colonias_ colonias____

Organismo______ Tipo de sembrado Tipo de Nmero de

Organismo____ Organismo_ Tipo de sembrado_ sembrado___ Nmero de colonias_ colonias____

Organismo______ Tipo de sembrado Nmero de colonias Tipo de Nmero de

Caractersticas de la colonia: ______________ Medio de cultivo: Alcaligenes faecalis.

Caractersticas de la colonia: ______________ Medio de cultivo: Staphylococcus aureus.

bacterias por mL __