UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA

CURSO: LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
PRÁCTICA 3: TINCIÓN DE ENDOSPORAS

Integrantes :

Apellidos y Nombres Código

Chipao Lucero, Cristian 20211039

Piñas Bejarano, Alexander Eduardo 20171368

Orozco Vargas , Miguel Angel 20190506

Facultad: Facultad de ciencias

Horario de práctica: Lunes (11:00 a.m -1:00 p.m)

Profesor: Katty Ogata G.

Fecha de la práctica: 13/10/22

Fecha de entrega del informe: 29/11/22

 LA MOLINA - LIMA – PERÚ
2022

I. INTRODUCCIÓN

La tinción ácido-resistente es una tinción diferencial que mide en células teñidas la

resistencia a la decoloración mediante ácido. La propiedad de ácido resistencia en ciertas

micobacterias y actinomicetos está correlacionada con su alto contenido lipídico. Teñir estas

bacterias requiere un tratamiento de alta temperatura y la utilización de colorantes fuertes

afines. El procedimiento consiste en teñir con carbolfucsina caliente, decolorar son una

solución de alcohol-ácido y reteñir con un contrastante. Las bacterias ácido resistentes se

decoloran muy lentamente con la solución de alcohol-ácido en comparación a otros

microorganismos y retienen el color del colorante inicial. Este tipo de coloración es utilizada

en el estudio y diagnóstico de enfermedades causadas por especies ácido-resistentes como los

de la tuberculosis y la lepra, y también para la diferenciación de estructuras resistentes como

las endosporas bacterianas.

OBJETIVOS:

Distinguir a través de dos técnicas de tinción diferencial la presencia de endosporas

bacterianas y diferenciarlas de las estructuras vegetativas normales.

II. REVISIÓN DE LA LITERATURA

Existe una gran variedad de tinción que se usa en la microbiología. Un colorante se puede

definir como la sustancia que da color a las células, tejidos, etc. Las tinciones se pueden

clasificar como simples, cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se utiliza un sólo
colorante (azul de lactofenol o tinta china); tinción diferencial, cuando se visualiza más de un

color porque se utiliza más de un colorante.

La tinción ácido- resistente es una tinción diferencial que se presenta en células teñidas a la

resistencia de la decoloración mediante el ácido, debido a su alto contenido lipídico. Esta

tinción ayuda a un diagnóstico de enfermedades infecciosas causadas por micobacterias

basándose en la demostración de su agente etiológico. La técnica de coloración para bacterias

se conoce desde hace más de un siglo. En 1882, Franz Ziehl fue el primero en usar ácido

carbólico lo que dio un paso más práctico, a su vez en 1883 Friedich Neelson comunicó que

tenía buenos resultados con la fucsina y ácido carboxílico al 5%. El ácido-alcohol (AAR) es

la capacidad que tiene un material biológico de formar complejos ácido-estables con

colorantes aril metánicos. Las estructuras o bacterias así teñidas no son decoloradas al

exponerlas a mezclas de alcohol-ácido o a determinadas concentraciones de ácidos minerales.

Muchas estructuras y bacterias son AAR . Aquí interesan especialmente las micobacterias, la

queratina, los gránulos secretorios de las glándulas sudoríparas, los gránulos de los

mastocitos y los espermatozoides. Las cuatro últimas estructuras mencionadas pueden

originar interpretaciones erróneas de la coloración de Z.N. Los colorantes usados para la

demostración de la AAR son compuestos aniónicos, cuya fórmula estructural se ilustra en la

figura 1. Los tres se usan en soluciones fenoladas (ácido carbólico). Los gérmenes se ven

como bacilos rojos cuando se usa la fucsina, violeta púrpura con el cristal violeta, y con

fluorescencia amarillo-verdosa cuando se usa Auramina O. El mecanismo de la AAR es un

fenómeno doble que requiere la penetración de la fucsina al citoplasma, así como su

interacción química con los ácidos micólicos de los péptidos glicolípidos presentes en la

pared celular de las microbacterias . Esta reacción impide la salida de la fucsina atrapada en

el citoplasma bacilar. Se aseguran así la brillantez y el color rojo intenso de los gérmenes que
resisten la decoloración con alcohol y ácidos (AAR) se pierde cuando se remueve la pared

externa de las micobacterias con alcohol alcalino ( Naranjo et al., 1998)

III. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1.1 Tecnica de Dorner

Materiales

- Cultivos de 48 horas Bacillus sp

- Clostridium sp

- Aceite de inmersión

- Asa de kolle

- Baño de agua a 100°C

- Laminas porta objeto

- Soluciones colorantes: Carbolfucsina y nigrosina

- Tubos con agua destilada esteril

Procedimiento

1. Se hizo una suspensión concentrada del organismo en 2 o 3 gotas de agua destilada

contenida en un tubo pequeño.

2. Se añadió igual volumen de carbolfucsina y se colocó en el tubo en un recipiente con

agua hirviendo por 10 minutos.

3. Se transfiere una gota de la suspensión a una lámina de portaobjetos.

4. Luego se agregó una gota de nigrosina, extendiendo la mezcla con ayuda de otra

lámina hasta obtener una delgada película

5. Se secó la lámina al aire libre. Se examinó la muestra al microscopio con un objetivo

de inmersión.
2.1.2 Técnica de Schaeffer y Fulton

Materiales

- Cultivos de 48 horas Bacillus sp

- Clostridium sp

- Aceite de inmersión

- Asa de kolle

- Mechero de alcohol

- Pinzas

- Laminas porta objeto

- Soluciones colorantes : Carbolfucsina y verde de malaquita

- Soluciones decolorante : Alcohol ácido

Procedimiento

1. Se preparó una muestra fija del microorganismo proporcionado

2. Se agregó a la preparación el colorante carbolfucsina hasta cubrir totalmente

3. Con ayuda de una pinza, Se calentó la lámina con el colorante haciendo pasar

ligeramente por la llama del mechero hasta que se observe el desprendimiento de

vapores. Se mantuvo esta condición por 3 minutos, evitando que el colorante se seque

o entre en ebullición

4. Lave con alcohol ácido hasta que este resulte incoloro

5. Se enjuago con agua destilada

6. Se cubrió con unas gotas de verde de malaquita por dos minutos. Luego se enjuago

7. Se secó la lámina al aire o dentro del papel secante. Se observó con el microscopio y

bajo un objetivo de inmersión

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Resultados

Cuadro 1 :Observación de las muestras de Bacillus sp y clostridium sp bajo el

microscopio

Observación 1 : Tecnica de Dorner

Observación 2 : Técnica de Schaeffer y Fulton

 5.2. Discusión

Como se ve en Resultados, el gráfico de las bacterias Bacillus cereus que formaron

endosporas y fueron sometidas a dos clases de tinción diferencial ácido-resistente: la técnica

de Dörner y la de Schaeffer y Fulton. En ambas técnicas se emplean como colorante primario

a la carbolfucsina, que contiene ácido bórico, fenol, resorcinol, fucsina, acetona, alcohol y

agua; pero la primera lo complementa con calor proveniente de un baño María de 15 minutos

y la segunda somete el portaobjetos con la muestra directamente al calor. El fenol de la

carbolfucsina y el calor suministrado en ambos casos ayuda a que el colorante penetre en las

bacterias, pero la diferencia entre el modo de suministro de calor (directo e indirecto) se

reflejan en el tamaño y volumen de éstas. Después de aplicar la técnica de Dörner, podemos

apreciar que las bacterias son más grandes ya que la parte vegetativa de la célula no se

deshidrató tanto como en la técnica de Schaeffer y Fulton.

Las esperas no se tiñen con las coloraciones convencionales debido a que poseen una pared

muy gruesa. En el caso de la tecnica de Dorner las esperosa se tiñen de color rono y las
celulas bacterianas aparecen casi incoloras contra un fondo gris oscuro por la nigrosina (gil.

2019)

La técnica Schaeffer-Fulton fue diseñada para aislar endospora tiñendo cualquier endospora

presenter verde, y cualesquiera otros organismos bacterianos rojos. Pero en el laboratorio a la

muestra primero se le agrego una capa de carolfucsina y luego se calento evitando que se

evapore la muestra, posteriormente se decolre (alcohol acido), se lava y por ultimo se agrega

el verde malaquita como resultando nos da que la parte vegetativa quede de color verde y las

endospros color rojo ( Naranjo et al., 1998)

V. CONCLUSIONES

- La tinción de Dorner es una tinción diferencial ácido-resistente que permite la

observación de las endosporas dentro de una célula bacteriana en su fase de

esporulación pudiendo apreciarse la endospora de una manera muy nítida y resaltante

debido a que la estructura vegetativa queda incolora, a diferencia de la Técnica de

Schaeffer y Fulton donde no se observaron las endosporas claramente.

- Técnica de Schaeffer y Fulton puede resultar más complicada de realizar por el hecho

de tener que mantener una temperatura constante por tres minutos, pues si no se llega

eso, el tinte no penetra la endospora y si hay excedente de temperatura o tiempo, la

célula se podrá destruir. Sin embargo, cuando no hay errores experimentales la tinción

resulta muy útil pues se ve la diferencia de colores entre la bacteria y su respectiva

endospora.

VI. BIBLIOGRAFÍA

Naranjo P. Rodríguez G. Rodriguez J. Leonor M. (1998) Las tinciones básicas en el

laboratorio de microbiología Vol. 3, Núm. 1 Enero-Marzo 2014 pp 10-18
 Gil M. (2019). Tinción de esporas: fundamento, técnicas y usos. Lifeder. Recuperado
de https://www.lifeder.com/tincion-de-esporas/

VII. ANEXOS

CUESTIONARIO

1. ¿Cuál de los métodos utilizados le permitió observar mejor las endosporas

bacterianas? ¿A qué atribuye la diferencia?

La técnica de Dörner es muy aplicada en los trabajos de observación en endosporas

bacterianas. En esta técnica se emplea la carbolfucsina como colorante de la endospora

llevado a baño maría, donde solo se tiñe la parte de la endospora pero no la zona

vegetativa, para poder lograr verla se recurre a la nigrosina la cual no tiene afinidad con los

componentes celulares, por tanto no penetra al interior de la célula solo se observa

alrededor de ella como una mancha negra inmersa en ella partes incoloras con puntos rojos

que serían las endosporas. La técnica de Scheffer y Fulton se diferencia del método Dörner

en la tinción de la parte vegetativa. La parte vegetativa en éste método resulta teñida, la

endospora es teñida por la carbolfucsina de color rojo, mientras la zona vegetativa se tiñe

gracias a la verde malaquita quien brinda una coloración de azul-verdoso. Toda la célula se

diferencia tanto parte vegetativa y la endospora cada uno con diferente coloración Por lo

tanto al grupo de trabajo le pareció más efectiva la segunda técnica (Scheffer y Fulton)

porque nos permite observar el tamaño de las bacterias, su forma y poder diferenciarlas con

colorantes distintos (carbolfucsina y verde malaquita), además de ser la técnica que mayor

cantidad de grupos de trabajos pudo efectuar satisfactoriamente.

2. ¿Qué efecto producirá el reemplazar el alcohol ácido por otro decolorante como
el alcohol cetona?

En la segunda técnica utilizada, se usó el alcohol ácido como decolorante de carbolfucsina en

la muestra Bacillus sp, con la finalidad de dejar teñidas con el primer colorante a todas

aquellas bacterias con capacidad acido resistente, es decir, resistentes a la decoloración de la

fucsina debido a la alta concentración de ácido micólico en la pared celular. En las bacterias
que no son ácido- alcohol resistentes las paredes carecen de componentes lipídicos y la

carbolfucsina se elimina con facilidad durante la decoloración, lo que deja a las células

incoloras. Si hubiésemos usado la mezcla de alcohol/acetona, el cual es un solvente lipídico y

disolvería la membrana exterior de la pared de la célula (lipídica), no tendría el mismo efecto

puesto que este se debe utilizar tras tratamiento con un colorante básico y la carbolfucsina es

un colorante ácido.

3. ¿Qué otros géneros de bacterias pueden formar endosporas?

Ciertos géneros de bacterias Gram-positivas, tales como Bacillus, Clostridium ,

Sporohalobacter , Anaerobacter y Heliobacterium , pueden formar endosporas. Las

endosporas son estructuras durmientes altamente resistentes cuya función primaria es

sobrevivir cuando las condiciones ambientales son adversas. En casi todos los casos, las

endosporas no forman parte de un proceso reproductivo, aunque Anaerobacter puede formar

hasta siete endosporas a partir de una célula. Las endosporas tienen una base central de

citoplasma que contiene DNA y ribosomas, rodeada por una corteza y protegida por una

cubierta impermeable y rígida. Las endosporas no presentan un metabolismo detectable y

pueden sobrevivir a condiciones físicas y químicas extremas, tales como altos niveles de luz

ultravioleta, rayos gamma, detergentes, desinfectantes, calor, presión y desecación. En este

estado durmiente, las bacterias pueden seguir viviendo durante millones de años, e incluso

pueden sobrevivir en la radiación y vacío del espacio exterior. Las endosporas pueden

también causar enfermedades. Por ejemplo, puede contraerse carbunco por la inhalación de

endosporas de Bacillus anthracis y tétanos por la contaminación de las heridas con

endosporas de Clostridium tetani.

4. Revise otras técnicas de tinción de endosporas y comparelas con las usadas en

este ejercicio. Destaque ventajas y desventajas
Existen diferentes métodos de tinción en donde se puede visualizar las endosporas de una

forma implícita ya que estas no se tiñen tan fácilmente. Por ejemplo si utilizamos un cultivo

viejo y la tinción de Gram, Rodamina-Auramina, Naranja de Acridina, Ziehl-Neelsen,

etcétera. Se observará un espacio sin colorear que sería la endospora y la bacteria coloreada.

Sin embargo, las mejores técnicas para tinción específicamente de endosporas son las usadas

en esta práctica.