Benemérita Universidad Autónoma de

Puebla

Licenciatura en biotecnología

Materia: Ingeniería genética

Practica 6: CLONACIÓN

Alumna: Angeles Torres Valdetano

Profesora: Itzel Paulina Morales Sandoval

Fecha de entrega: 12 de marzo de 2021

Primavera 2021
Cuestionario
Parte 1
1. ¿Qué volumen de DNA inserto (si tengo un tubo que contiene 10 ul a una
concentración de 10 ng/µl, el tamaño del inserto es de 900 pb) tengo que
colocar en una ligación en una relación 1:3 y 1:5 si la concentración de DNA
vector pUC19 es de 50 ng/ul?

relación 1:3
50 ng x (0.900 kb) x 3
___________________ = 50. 26 ng de inserto
2.686 kb

50.26 ng
Volumen de inserto = ___________________ = 5.026 ul de inserto
10 ng/ul

relación 1:5
50 ng x (0.900 kb) x 5
___________________ = 83. 76 ng de inserto
2.686 kb

83.76 ng
Volumen de inserto = ___________________ = 8.376 ul de inserto
10 ng/ul

2. Recientemente has realizado una clonación de un gen de interés en tu

laboratorio. Tu supervisor te pide subclonarlo en otro vector para la expresión
en levaduras. ¿Cómo llevarías a cabo este experimento?
Cortaría el gen de interés con las mismas enzimas que corte al inicio,
pues mi gen ya tiene los extremos marcados
Se realizaría PCR con los primer modificados (si así lo requiere) para
obtener más copias de mi gen para poder insertarlo en el plásmido
Utilizaría un plásmido de levaduras, los dos que se utilizan más a menudo
en la transformación de las levaduras son el plásmido episomal de
levaduras YEp y el plásmido centrometic de levadura o YCp.
Se haría de nuevo la electroforesis para comprobar que si se cortó
adecuadamente nuestro gen y se realizaría la extracción del gel a
agarosa
Se haría la ligación con la enzima T4 ligasa con las concentraciones
correspondientes
Para la transformación se realizaría la electroporación
Parte 2
1. ¿Qué son las células competentes? ¿Cuáles son las características que presentan?
Las células que recibieron un tratamiento apropiado para llevar a cabo la
introducción del material genético a través de su membrana que entonces
puede amplificar o clonar el ADN se denominan células competentes

2. ¿Serviría el vector para clonar un fragmento de ADN cortado por enzimas de

restricción? ¿Y uno amplificado por una ADN polimerasa de alta fidelidad?
De acuerdo a las especificaciones del vector este es idóneo para clonar
fragmentos que han sido cortados con enzimas de restricción, y si pensamos
que un fragmento fue amplificado con oligonucleótidos o primers que le
permitan poder ingresar al plásmido mediante alguna enzima de restricción
también es posible que se pueda clonar con éxito

3. ¿Cuáles son las causas posibles para la ausencia de colonias blancas en la placa?
Depende varios factores como la pureza del plásmido, la concentración del
mismo, y las condiciones del tratamiento de electroporación, el tipo de método
de selección que se ocupa y de las condiciones de ph, temperatura, salinidad
etc. En pocas palabras se puede deber a varios factores desde el inicio de la
clonación, o que haya una mala proporción de vector: inserto en la ligación o
algún problema en el método de transformación.
Referencias
→ Martirena-Ramírez, A., & Veitía, N. (2013). Factores que influyen en la
transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens en Phaseolus
vulgaris L.. Biotecnología Vegetal, 13(2). Recuperado
de https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/article/view/97/458
→ Pérez L, (2015) Transferencia de material genético II: Trasformación consultado
el 10 de marzo de 2021 en https://slideplayer.es/slide/1131843/
→ Lee-Borges, J, Planas J, (2016) Preparación de células competentes consultado
el 10 de marzo de 2021 en https://slideplayer.es/slide/4133295/
→ Campos A, (2016) Transformación consultado el 10 de marzo de 2021 en
https://slideplayer.es/slide/4848366/
→ https://international.neb.com/products/n3041-puc19-
vector#Product%20Information
→ https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/SD0061#/SD0061