Enzimas de restricción

Las enzimas de restricción se encuentran en bacterias (y otros procariontes). Reconocen

secuencias específicas de ADN, llamadas sitios de restricción, y se unen a ellas. Cada enzima de
restricción reconoce solo uno o unos pocos sitios de restricción. Cuando encuentra su secuencia
blanco, la enzima de restricción cortará las dos cadenas de una molécula de ADN. Por lo general,
el corte es en o cerca del sitio de restricción y ocurre en un patrón ordenado y predecible.
Como un ejemplo de cómo una enzima de restricción reconoce y corta en una secuencia de ADN,
veamos a EcoRI, una enzima de restricción de uso común en el laboratorio. EcoRI corta en el
siguiente sitio:

Cuando EcoRI reconoce y corta este sitio, siempre lo hace en un patrón muy específico que
produce extremos sobresalientes de ADN de cadena sencilla:

Una enzima EcoRI se une a un sitio EcoRI en un fragmento de ADN y hace cortes en ambas
cadenas del ADN. El patrón de corte es:
5'-...G|AATTC...-3'
3'-...CTTAA|G...-5'
De esta manera se produce un extremo de 5'-AATT-3' que sobresale en cada extremo del ADN
cortado.
Si otro fragmento de ADN tiene secuencias sobresalientes complementarias (porque también se
cortó con EcoRI, por ejemplo), los extremos pueden unirse por complementariedad de bases.
Por esta razón se dice que las enzimas que dejan extremos de cadena sencilla
producen extremos cohesivos. Los extremos cohesivos son útiles en la clonación porque
mantienen dos fragmentos de ADN juntos para que la ADN ligasa los pueda unir.
No todas las enzimas de restricción producen extremos cohesivos. Algunas producen "extremos
romos", cortes a la mitad de la secuencia blanco que no dejan extremos de cadena sencilla. La
enzima de restricción Sma I es un ejemplo de enzima que corta así:
La enzima Sma I se une aI sitio de restricción de Sma I, que es:
5'-...CCCGGG...-3'
3'-...GGGCCC...5'
La enzima corta en medio de esta secuencia en ambas cadenas y produce extremos romos. Los
sitios de corte son:
5'-...CCC|GGG...-3'
3'-...GGG|CCC...5'

La ADN ligasa puede unir fragmentos romos entre sí. Sin embargo, es más difícil ligar fragmentos
romos (la reacción de ligación es menos eficiente y es más probable que falle) porque no hay
secuencias sobresalientes de cadena sencilla que sostengan a las moléculas de ADN en su
posición.

Construcción de un plásmido recombinante

Vamos a ver cómo la digestión con enzimas de restricción y la ligación pueden utilizarse para
insertar un gen en un plásmido. Supongamos que tenemos un gen blanco, flanqueado por los
sitios que reconoce EcoRI, y un plásmido que contiene un solo sitio de EcoRI:

Comenzamos con un gen blanco y un plásmido circular. El gen blanco tiene dos sitios de
restricción para EcoRI cerca de sus extremos. El plásmido tiene un sitio para EcoRI justo
después de un promotor que estimula la expresión en bacterias. La secuencia de los sitios
de EcoRI es:

5´-GAATTC-3´
3´-CTTAAG-5´
Nuestro objetivo es utilizar la enzima EcoRI para insertar el gen en el plásmido. Primero,
digerimos (cortamos) por separado con EcoRI el fragmento del gen y el plásmido. Este paso
produce fragmentos con extremos cohesivos:

Por separado, digerimos (cortamos) con EcoRI el fragmento del gen y el plásmido. Este
paso produce fragmentos con extremos cohesivos. Todos los extremos tienen un extremo
sobresaliente de cuatro nucleótidos con la secuencia 5'-AATT-3'. Eso es porque el patrón
de corte de EcoRI es:

5'-G|AATTC-3'
3'-CTTAA|G-5'

A continuación, tomamos el fragmento del gen y el plásmido linearizado (abierto) y los

combinamos con ADN ligasa. Los extremos cohesivos de ambos fragmentos se unen por
apareamiento complementario de bases:
 Ahora, tomamos el fragmento del gen y el plásmido linearizado (abierto) y los combinamos
con ADN ligasa. Los extremos cohesivos de ambos fragmentos se unen por apareamiento
complementario de bases. Sin embargo, todavía existen huecos en el esqueleto de azúcar-
fosfato de la doble hélice del ADN en los sitios de unión entre el gen y ADN del plásmido.

Una vez que los une la ligasa, los fragmentos se convierten en un solo fragmento de ADN sin
interrupciones. El gen blanco ya se ha insertado en el plásmido y tenemos un plásmido
recombinante.

Una vez que los une la ligasa, los fragmentos se convierten en un solo fragmento de ADN
sin interrupciones. El gen blanco ya se ha insertado en el plásmido y tenemos un plásmido
recombinante. En el plásmido, el gen ahora está flanqueado por dos sitios de EcoRI que se
generaron cuando los extremos cortados se ligaron entre sí.

En la digestión con enzimas de restricción y la ligación participan muchas moléculas

de ADN

En el ejemplo anterior, vimos un resultado de la ligación entre un gen y un plásmido con EcoRI.
Sin embargo, en esta misma reacción de ligación podrían ocurrir otros resultados. Por ejemplo,
el plásmido cortado podría recircularizarse (cerrarse en su estado original) sin incorporar el
gen. Asimismo, el gen podría entrar al plásmido, pero en dirección contraria (puesto que sus
dos extremos cohesivos de EcoRI son idénticos).
 Plásmido recombinante producido cuando el gen entra en
sentido hacia adelante ("apuntando" en la dirección del
promotor que se encuentra en el plásmido).

Plásmido no recombinante que se produce cuando el

plásmido cortado simplemente se vuelve a cerrar (sus
extremos se ligan entre sí).

Derecha: plásmido recombinante producido cuando el gen

entra en sentido inverso ("apuntando" en dirección
contraria al promotor que se encuentra en el plásmido).

La digestión con enzimas de restricción y la ligación como esta se realiza con muchas copias de
ADN del plásmido y del gen. De hecho, en una sola ligación se utilizan ¡miles de millones de
moléculas de ADN! Todas estas moléculas están chocando entre sí y con la ADN ligasa al azar y
de diferentes maneras. Por lo tanto, si es posible formar varios productos, todos se
producirán con cierta frecuencia, incluyendo los que no queremos.

¿Cómo podemos evitar plásmidos "malos"?

Cuando transformamos bacterias con el ADN de una ligación, cada una toma un fragmento
diferente de ADN. Después de la transformación, podemos revisar las bacterias y usar solo
aquellas que tengan el plásmido correcto. En muchos casos, el plásmido de las bacterias
transformadas se analiza mediante otra digestión con enzimas de restricción para ver si
contienen el inserto correcto en la orientación correcta.