PRACTICA.

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CLONACION

I.- OBJETIVO
Conocer los principios de la clonación de moléculas y de células.

II.- FUNDAMENTO

La reproducción asexual o reproducción clonal, es una forma natural de reproducción

utilizada por las procariotas.
Se puede definir como el proceso que produce, de forma asexual, copias idénticas de una
molécula, célula u organismo.

Clonación molecular
La clonación de ADN se utiliza por ejemplo, en:
Productos biofarmacéuticos. La clonación de ADN puede utilizarse para producir
proteínas humanas con aplicaciones biomédicas, como la insulina, la hormona del
crecimiento humana que se administra a pacientes que no pueden sintetizarla, y el
activador tisular del plasminógeno (tPA), que se utiliza para tratar infartos y prevenir
coágulos sanguíneos. Proteínas recombinantes como estas suelen producirse en bacterias.
Terapia génica. Para tratar algunos trastornos genéticos, como construir plásmidos que
contiene una versión normal del gen que falla en la fibrosis quística. Cuando se
suministran los plásmidos a los pulmones de pacientes con fibrosis quística, disminuye el
deterioro de la función pulmonar del paciente.
Inicialmente, el trozo de ADN de interés necesita ser aislado del ADN adecuado. Luego
se amplifica y se se inserta en un vector de clonación: El vector se linealiza (ya que es
circular), usando enzimas de restricción y a continuación se incuban en condiciones
adecuadas el fragmento de ADN de interés y el vector con la enzima ADN ligasa.
Luego, se produce la transfección dentro de las células (con el inserto de ADN extraño)
y son cultivadas, procediendo a identificar tanto las células transfectadas y las no
transfectadas. Para tal fin los vectores de clonación pueden incluir marcadores de
resistencia a los antibióticos con los que sólo las células que han sido transfectadas
pueden crecer, u otros vectores de clonación proporcionan un cribado de color azul/
blanco, que facilita su separación.

Clonación celular
Consiste en formar un grupo de ellas a partir de una sola. En el caso de organismos
unicelulares como bacterias y levaduras, este proceso es muy sencillo, y sólo requiere la
inoculación de los productos adecuados.
En el caso de la clonación de las células de organismos pluricelulares es una tarea difícil,
ya que estas células necesitan unas condiciones del medio muy específicas.

Clonación de organismos
La clonación de un organismo es crearlo con la misma información genética proveniente
de una célula existente. Es un método de reproducción asexual, donde la fertilización no
ocurre. En términos generales, solo hay un progenitor involucrado.

III.- PROCEDIMIENTO
3.1.- Clonación de moléculas (ADN)

Los pasos básicos son:

a. Cortar y pegar el ADN
Para unir fragmentos de ADN de diferentes fuentes, se utiliza dos tipos de
enzimas: enzimas de restricción y ligasa.
Una enzima de la restricción es una enzima que reconoce una secuencia blanco
específica y corta el ADN en ese lugar o en un sitio cercano. Muchas enzimas de
restricción cortan produciendo extremos de cadena sencilla cortos que con extremos
sobresalientes que se empatan. Estos extremos luego pueden complementar sus bases y
unirse. Sin embargo, no se combinan para formar una molécula de ADN completa hasta
que la ADN ligasa las une sellando los espacios en el esqueleto del ADN.

El objetivo de clonar es insertar un gen blanco (el de la insulina humana, por ejemplo) en
un plásmido. Con ayuda de una enzima de restricción cuidadosamente elegida, digerimos:
• El plásmido, que solo tiene un sitio de corte.
• El fragmento del gen blanco, que tiene un sitio de corte cerca de cada extremo.
Luego, combinamos los fragmentos con ADN ligasa, que los une formando un plásmido
recombinante que contiene el gen de interés.
Diagrama que representa la digestión con enzimas de restricción y la ligación en un
esquema simplificado.
Empezamos con un plásmido bacteriano circular y un gen blanco. En ambos extremos del
gen blanco hay sitios de restricción, secuencias de ADN reconocidas por una enzima de
restricción particular. En el plásmido, también hay un sitio de restricción reconocido por
esa misma enzima, justo después de un promotor que dirigirá su expresión en bacterias.
El plásmido y el gen blanco (por separado) se digieren con la enzima de restricción. Los
fragmentos se purifican y se combinan. Ambos tienen "extremos cohesivos", o salientes
de ADN de cadena sencilla, por lo que pueden pegarse.
La enzima ADN ligasa une los fragmentos con extremos complementarios para formar
una única molécula completa de ADN. Esto produce un plásmido recombinante que
contiene el gen blanco.

b. Transformación y selección bacteriana

Mediante el proceso llamado transformación pueden introducirse plásmidos y otros
tipos de ADN en bacterias, como E. coli, Para lo cua, células bacterianas preparadas se
someten a un choque (como alta temperatura) para incorporar ADN extraño.

El ADN producido en la ligación (que puede ser una mezcla de plásmidos deseados,
plásmidos de productos secundarios y fragmentos de ADN lineal) se agrega a las
bacterias, uqe se desea transformar, y se someten a un golpe de calor, que mejora la
eficacia con la que el ADN entra durante la transformación. Sin embargo, solo una
pequeña minoría de las bacterias incorporará con éxito un plásmido.
Típicamente, los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibióticos que permite
a las bacterias sobrevivir en presencia de un antibiótico específico. Así, las bacterias que
incorporan el plásmido pueden seleccionarse en placas de medio de cultivo que contenga
dicho antibiótico. Las bacterias sin plásmido morirán, mientras que las bacterias que
contienen plásmido pueden reproducirse.
Fig. 2. Panel de la izquierda: diagrama de un plásmido que contiene un gen de resistencia
a antibióticos. Panel de la derecha: todas las bacterias de la transformación se colocan en
una placa con antibióticos. Las bacterias sin plásmido mueren a causa del antibiótico.

Cada bacteria que tenga plásmido, forma una colonia, un grupo de bacterias clonales que
contienen el mismo plásmido.
No necesariamente todas las colonias contendrán el plásmido adecuado. Eso es porque,
durante una ligación, los fragmentos de ADN no siempre se "pegan" exactamente como
queremos. Por el contrario, debemos recolectar ADN de varias colonias y ver si cada una
contiene el plásmido correcto. Se usan métodos como la digestión con enzimas de
restricción y la PCR para revisar los plásmidos.

c. Producción de proteínas
Una vez que hemos encontrado una colonia de bacterias con el plásmido adecuado,
podemos hacer crecer un gran cultivo de bacterias que contengan el plásmido.

Luego se induce la expresión del gen contenido en el plásmido en las bacterias de ese
cultivo, con lo que el gen blanco se transcribe en ARNm y se traduce en proteína.
Una vez que se ha producido la proteína, las células bacterianas pueden romperse para
liberarla. Hay muchas otras proteínas y macromoléculas flotando en las bacterias, por lo
que la proteína blanco debe separarse del resto con técnicas bioquímicas.

3.2.- Clonación de animales

Para lograr el experimento con la oveja Dolly, se siguieron los siguientes pasos:
- Se cultivaron in vitro células de la glándula mamaria de una oveja adulta de raza Finn
Dorset que se encontraba en el último trimestre de preñez
- Las células fueron posteriormente fusionadas, mediante un shock eléctrico, con ovocitos
(óvulos inmaduros) a los que previamente se les había extraído el núcleo (ovocitos
anucleados), provenientes de una oveja de raza Scottish Blackface (blanca con cara
negra).
- Estos ovocitos, fertilizados de manera artificial, después de ser activados con una suave
descarga eléctrica, comenzaron a dividirse. Cuando los embriones llegaron a poseer entre
ocho y dieciséis células (estadio de mórula), se implantaron en el útero de otras ovejas
Scottish Blackface
- Transcurridos 148 días nació un cordero de 6,6 kg de peso, totalmente blanco.
- Estudios moleculares demostraron que la dotación genética del cordero clonado era
idéntica a la de la oveja de la cual se extrajeron las células de la glándula mamaria, y
diferente a la de la oveja utilizada como portadora
Para llegar hasta Dolly se usaron 277 embriones, y una cuarta parte de las ovejas murieron
antes de nacer.
Aplicaciones de la clonación de animales
Uno de los objetivos buscados por el grupo de Wilmut (en alianza con una empresa) es
unir la técnica de la clonación con la de Ingeniería genética de mamíferos con objeto de
producir medicamentos o sustancias útiles comercialmente. La idea es que una vez que
se haya obtenido un animal transgénico interesante (por ejemplo, ovejas o vacas que en
su leche secretan sustancias terapéuticas determinadas por un gen introducido
previamente), ese individuo serviría de "molde" para generar varios ejemplares clónicos
Otra aplicación (más en la línea de la ganadería tradicional) sería asegurar copias de un
ejemplar que haya mostrado buenos rendimientos (en carne, en leche, etc.). Sin embargo,
mientras el costo de la técnica sea elevado, no estará al alcance de las explotaciones
ganaderas convencionales.
Sin embargo, la biodiversidad es valiosa también en los "ecosistemas agropecuarios", ya
que supone una reserva de recursos genéticos adaptados a diversas condiciones
ambientales y a diversos contextos socioeconómicos

III.- OBSERVACION DE VIDEOS

• Clonado de oveja Dolly

https://www.youtube.com/watch?v=0VYcEi1OiKc
• Clonación terapéutica
https://www.youtube.com/watch?v=EluOOk-xigc
• Clonación y transgénicos
https://www.youtube.com/watch?v=1RUEsTKoOGM&t=328s

• Alimentos transgénicos
https://www.youtube.com/watch?v=Ft6OnRmBDlI&t=22s

• Nuevas técnicas biotecnológicas para mejorar las características de los

vegetales"
https://www.youtube.com/watch?v=6vuutMVvv_A

• Transgénicos: ¿Biodiversidad en peligro?

https://www.youtube.com/watch?v=d_g58PFJHgQ

IV.- CUESTIONARIO

1.- Defina que es clonar

2.- En la clonación de ADN, que es lo que se desea clonar y para que
3.- Mencione los pasos de la clonación de ADN
4.- Menciones los pasos de la clonación de bacterias OMG
5.- Mencione los pasos de la clonación de un animal