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OBJETIVOS:

GENERAL:

Obtención de etanol a partir de la piña.

PARTICULARES:

Conocer qué es un metabolito.

Conocer las técnicas de separación de un metabolito.

Conocer técnicas de recuperación del metabolito.

Conocer el método para la obtención del etanol a partir de la piña.

Poner en práctica el método para la obtención del etanol a partir de la piña.

INTRODUCCIÓN

Los procesos fermentativos o de fermentaciones han sido desarrollados y utilizados por el


hombre desde hace aproximadamente ocho mil años, a pesar de que no se conocía la
existencia y la presencia de los microorganismos en esos procesos.

La palabra fermentación proviene de la adaptación del término en latín fermentare, que


significa ͞ebullir͟; se utilizó porque describía la ebullición aparente que se observa en la
fabricación de vinos a causa de la producción de dióxido de carbono, gas que se genera en
forma de burbujas y provoca movimiento en el líquido.

El concepto de fermentación se ha ido modificando con el tiempo y, actualmente, abarca una


gran cantidad de procesos y productos diversos, el término se aplica tanto a procesos muy
simples como a los que se desarrollan a escala industrial ʹcon controles bien establecidos y de
gran utilidad para el hombre- por lo que resulta difícil describirlo. Sin embargo, prevalecen dos
criterios para su definición, uno bioquímico y otro microbiológico.

Desde el punto de vista bioquímico una fermentación se define como un proceso mediante el
cual las sustancias orgánicas (sustratos) sufren una serie de cambios químicos (reducciones y
oxidaciones) que producen energía. Al finalizar la fermentación se presenta una acumulación
de varios productos, unos más oxidados (aceptaron electrones) y otros más reducidos
(donaron electrones) del sustrato, con un balance total de energía positivo. Esta energía es
utilizada en el metabolismo de los microorganismos. (1)

Es importante mencionar que en el concepto bioquímico, no se consideran como


fermentaciones los procesos en los que participa el oxigeno. Cuando el aceptor final de
electrones es el oxigeno molecular y no una sustancia orgánica el proceso se conoce como
respiración.

Desde el punto de vista microbiológico en la actualidad se entiende por fermentación aquel


proceso en el que los microorganismos producen metabolitos o biomasa, a partir de la
utilización de sustancias orgánicas en ausencia o presencia de oxigeno. La descomposición de
los sustratos es llevada a cabo por enzimas producidas por los microorganismos para llevar a
cabo tal finalidad. Se debe observar que el concepto llega a excluir a los microorganismos que
se encuentren presentes siempre y cuando estén presentes sus enzimas; sin embargo, en estos
casos, la velocidad del producto y los rendimientos son menores.

Un proceso de fermentación está compuesto por tres etapas:

ͻ La preparación del inoculo

ͻ La selección del medio de cultivo

ͻ La producción de la biomasa o de los metabolitos de interés

La gran cantidad de productos y procesos que involucra el concepto de fermentación hace


difícil la definición no solo del concepto sino también la clasificación. En general, se establecen
divisiones con base en:

ͻ El tipo de producto final a obtener.

ͻ La presencia o ausencia de oxigeno en el proceso.

Desde el punto de vista comercial, las fermentaciones se pueden obtener tomando en cuenta
los productos que se obtendrán, entre ellos se pueden mencionar:

ͻ Células microbianas (biomasa).

ͻ Metabolitos microbianos (enzimas, etanol, butanol, acetonas, ácidos orgánicos,


etcétera).

Los enzimas o fermentos segregados por microorganismo son poderosos catalizadores de


naturaleza proteica que, sin embargo, pueden actuar en forma independiente a la de los
respectivos microorganismos que los generan. (2)

Se puede representar la fermentación de la siguiente forma:

Microorganismos + Nutrientes + Condiciones Ambientales Fermentación

La fermentación alcohólica consiste en la descomposición de los azúcares contenidos en el


mosto: glucosa y fructuosa en etanol o alcohol etílico y en anhídrido carbónico,
corrientemente llamado gas carbónico, que, expresada en términos químicos, se establece la
ecuación ya formulada por Gay-Lussac en el año 1820.

C6H1206 = 2(CH3-CH2OH) + 2 CO2

glucosa etanol anhídrido carbónico

Las levaduras son unos hongos que pertenecen al grupo de los ascomicetos, cuya característica
es el aparato reproductor en forma de asca, o sea, una célula especial de paredes recias que
contienen, en su interior, una serie de otras pequeñas células; las ascosporas, reproductoras.

La causa de la fermentación alcohólica fue demostrada por Pasteur, quien descubrió que ésta
no era más que el resultante de un fenómeno bioquímico, la vida de un ser vivo unicelular, la
levadura, el cual, en lugar de tomar el oxígeno que precisa para su proceso respiratorio
directamente del aire, lo toma de otra sustancia, en este caso la glucosa o la fructosa del
mosto a las que descompone. Este tipo de respiración propia de muchos organismos vivos,
entre ellos las levaduras, recibe el nombre de respiración anaerobia. (5)

Las levaduras están compuestas de un 75 % de agua y de un 25 % de sustancias sólidas. De


éstas, un 25 a 40 % son hidratos de carbono, un 2 a 5 % grasas, un 2 a 5 % prótidos y un 5 a 10
% materias minerales. Las levaduras encuentran todos estos componentes en cantidad
suficiente en el mosto.

Las levaduras, al carecer de clorofila, no pueden realizar la síntesis de los hidratos de carbono,
sino que tienen que encontrarlos ya formados en el medio donde se desarrollan, en este caso
el mosto.

Para su respiración, las levaduras pueden coger el oxígeno del aire, respiración aerobia o bien
de una sustancia donde se encuentre combinado, respiración anaerobia, en este caso de los
azúcares.

Dentro del grupo de los ascomicetos, las levaduras pertenecen a la familia de las
sacaromicetáceas, cuyas características comunes son: ser unicelulares, de forma esférica u
ovoide, presentarse libres o formando colonias filamentosas, cubiertas de una membrana
celulósica fina que va aumentando de tamaño a medida que se desarrolla; en el interior, se
encuentra el protoplasma de constitución albuminoidea y, en el centro, el núcleo de forma
esférica y junto a él una gran vacuola que contiene las sustancias de reserva para su
metabolismo: enzimas, vitaminas, compuestos fosfóricos, hidratos de carbono, etc.

La reproducción de las levaduras, además de la ya citada por ascas que tiene origen sexual,
puede ser de forma sexuada por escisión y por gemación. (2)

PROCESO PARA LA OBTENCIÓN DE ETANOL. (FIG. 1)


El compuesto químico etanol, conocido como alcohol etílico, es un alcohol que se presenta
como un líquido incoloro e inflamable con un punto de ebullición de 78 °C. Al mezclarse con
agua en cualquier proporción, da una mezcla azeotrópica.

Su fórmula química es CH3-CH2-OH, principal producto de las bebidas alcohólicas como el vino
(un 15% aproximadamente), la cerveza (5%) o licores (hasta un 50%).

Además de usarse con fines culinarios (Bebida alcohólica), el etanol se utiliza ampliamente en
muchos sectores industriales y en el sector farmacéutico, como principio activo o excipiente de
algunos medicamentos y cosméticos (es el caso del alcohol antiséptico 70º GL y en la
elaboración de ambientadores y perfumes).

Es un buen disolvente, y puede utilizarse como anticongelante. La industria química lo utiliza


como compuesto de partida en la síntesis de diversos productos, como el acetato de etilo (un
disolvente para pegamentos, pinturas, etc.), el éter di etílico, etc.

Se emplea como combustible industrial y doméstico. Esta última aplicación se extiende


también cada vez más en otros países para cumplir con el protocolo de Kyoto. Estudios del
Departamento de Energía de USA dicen que el uso en automóviles reduce la producción de
gases de invernadero en un 85%. En países como México existe la política del ejecutivo federal
de apoyar los proyectos para la producción integral de etanol y reducir la importación de
gasolinas que ya alcanza el 60 %.

El etanol puede afectar al sistema nervioso central, provocando estados de euforia,


desinhibición, mareos, somnolencia, confusión, alucinaciones (como lo sean ver doble o que
todo se mueve de forma espontánea). Al mismo tiempo, baja los reflejos. Con concentraciones
más altas ralentiza los movimientos, impide la coordinación correcta de los miembros, pérdida
temporal de la visión, etc. En ciertos casos se produce un incremento en la irritabilidad del
sujeto intoxicado como también en la agresividad; en otra cierta cantidad de individuos se ve
afectada la zona que controla los impulsos, volviéndose impulsivamente descontrolados y
frenéticos. Finalmente, conduce al coma y puede provocar la muerte.

La resistencia al alcohol parece aumentar en las personas adultas, de mayor peso y de menor
altura, mientras que los niños son especialmente vulnerables. Se han comunicado casos de
bebés que murieron por intoxicación debida a la inhalación de vapores de etanol tras haberles
aplicado trapos impregnados de alcohol. La ingesta en niños puede conducir a un retardo
mental agravado o a un subdesarrollo físico y mental. También se han realizado estudios que
demuestran que si las madres ingerían alcohol durante el embarazo, sus hijos podían ser más
propensos a tener el síndrome de alcohólico fetal.
Información general del microorganismo

͞SACCHAROMYCES CEREVISIAE͟ (5)

Reino Fungi

DivisiónAscomycota

Clase Hemiascomycetes

Orden Saccharomycetales

Familia Saccharomycetaceae

Género Saccharomyces

Especie S. cerevisiae

TABLA 1

La levadura de cerveza ͞SACCHAROMYCES CEREVISIAE͟ es un hongo unicelular, un tipo de


levadura utilizado industrialmente en la fabricación de pan, cerveza y vino. El ciclo de vida de
las levaduras alterna dos formas, una haploide y otra diploide. Ambas formas se reproducen
de forma asexual por gemación. En condiciones muy determinadas la forma diploide es capaz
de reproducirse sexualmente. En estos casos se produce la meiosis en la célula formándose un
asca que contiene cuatro ascosporas haploides.

͞S. CEREVISIAE͟ es uno de los modelos más adecuados para el estudio de problemas
biológicos. Es un sistema eucariota, con una complejidad sólo ligeramente superior a la de la
bacteria pero que comparte con ella muchas de sus ventajas técnicas. Además de su rápido
crecimiento, la dispersión de las células y la facilidad con que se replican cultivos y aíslan
mutantes, destaca por un sencillo y versátil sistema de transformación de ADN. Por otro lado,
la ausencia de patogenicidad permite su manipulación con las mínimas precauciones. (5)

͞S. CEREVISIAE͟ es un sistema genético que, a diferencia de la mayoría de los otros


microorganismos, presenta dos fases biológicas estables: haploide y diploide. La fase haploide
permite generar, aislar y caracterizar mutantes con mucha facilidad, mientras que en la
diploide se pueden realizar estudios de complementación. Una levadura haploide contiene 16
cromosomas que varían en tamaño de 200 a 2200 kilobases (Kb).
Una ventaja adicional de este microorganismo consiste en que se conoce la secuencia
completa de su genoma y se mantiene en constante revisión. Ello ha permitido la
manipulación genética de los casi 6600 genes que codifica el genoma de levadura, el uso
extensivo de micromatrices de ADN para investigar el transcriptoma y estudios a escala
genómica de, entre otros muchos aspectos, la expresión génica, localización de proteínas y la
organización funcional del genoma y el proteoma.

La maquinaria molecular de muchos procesos celulares se encuentra conservada tanto en


levaduras como en plantas y en mamíferos. Esto se ilustra con el hecho de que rutinariamente
se han introducido genes de eucariotas superiores en levaduras para el análisis sistemático de
su función.

Por estas razones, S. Cerevisiae se ha convertido en una importante herramienta a gran escala
de análisis de genómica funcional, proporcionando un punto de partida para el análisis de
organismos eucariotas más complejos. Al ser un organismo unicelular con una tasa de
crecimiento rápida, la levadura se puede utilizar para los estudios de células que resultarían
muy complicados o costosos en organismos multicelulares.

Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la producción de cerveza, pan
y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol durante el proceso de
fermentación. Básicamente este proceso se lleva a cabo cuando esta levadura se encuentra en
un medio muy rico en azúcares (como la D-glucosa). En condiciones de escasez de nutrientes,
la levadura utiliza otras rutas metabólicas que le permiten obtener un mayor rendimiento
energético, y por tanto no realiza la fermentación.

Desde el punto de vista científico, este microorganismo se ha empleado como modelo simple
de la célula eucariota. Esto se debe a una serie de ventajas como su facilidad de cultivo y su
velocidad de división celular (aproximadamente dos horas). (2)

MATERIALES Y EQUIPOS

CANTIDAD MATERIAL Y REACTIVOS EQUIPO

2 Piñas grandes maduras

100gr Azúcar blanca o piloncillo

90 gr Levadura (Saccharomyces cerevisiae)


Agua

1 Balanza Granataria.

1 Olla Licuadora

1 Colador

1 Cuchillo

1 Tabla de picar

2 Agitadores

1 Tubo condensador.

1 Frasco de plástico de 5 lt.

1 Matraz de bola 250 ml.

1 Mechero

1 Espátula

1 Vaso de precipitado 500ml.

1 Papel filtro

1 Termómetro. (escala de 0 a 100ºC)

3 matraz Erlenmeyer 250 ml.

1 Frasco de vidrio (esterilizado)

1 Indicadores de pH (0-14)

1 Pizeta

1 tubo conector de tres vías

1 matraz balón de 250 ml

1 Refrigerante

2 Pinza de tres dedos

2 soporte universal

MATERIA PRIMA
La materia prima que se utilizará para producir nuestro metabolito (Alcohol Etílico) será la
Piña, ya que es una fruta típica de la región.

Al igual que para el resto de los cultivos, la deficiencia en nitrógeno retrasa el crecimiento,
apareciendo plantas ͞enanizadas͟ y amarilleamiento en las hojas; la producción de fruto y
tallos se ve afectada. Rara vez se observan deficiencias de fósforo, pero en caso de ser
acusadas, el rendimiento se ve afectado negativamente. La carencia de potasio se manifiesta
por la aparición de puntos amarillos en las hojas. La zona basal de las hojas jóvenes debe
contener al menos un 3,2 % de K sobre materia seca (s.m.s.).

Un contenido mínimo de sólidos solubles de 12% y una acidez máxima de 1% asegurarán un


sabor mínimo aceptable a los consumidores.

La fruta se clasifica en tres categorías:

Categoría A.- frutos con peso superior a 1.5 kg.

Categoría B.- frutos con peso comprendido entre 1 y 1.5 kg.

Categoría C.- frutos con peso inferior a 1 kg.

Cambios físicos y químicos de la piña durante la maduración y el almacenamiento.

La piña es una fruta no climatérica por lo que tiene baja velocidad de respiración que declina
lentamente después de su cosecha. Las piñas deben cosecharse cuando adquieren madurez de
consumo debido a que no continúan madurando después de la cosecha. (2)

Temperatura 7°C 10°C 13°C 15°C

mL CO2/kgͻh 2-4 3-5 5-8 8-10

La exposición de las piñas a temperaturas inferiores a 7ºC puede producir daño por frio, lo
recomendable es almacenarlas en temperaturas que oscilen entre 7-10°C (45-50°F). Las frutas
maduras son menos susceptibles que las inmaduras o las parcialmente maduras por lo que se
recomienda una temperatura de 10-13°C (50-55°F) para su mejor conservación.

Su consumo es de años atrás y las presentaciones más comunes son en rebanadas o trozos de
almíbar, purés o jugos.

Debido a sus características es recomendable procesarla lo mas rápido posible para minimizar
su deterioro, así la cantidad de fruta almacenada debe ser mínima.

Enfermedades
Pudrición por Thielaviopsis (pudrición negra): causada por Thielaviopsis paradoxa, siendo la
enfermedad más grave de postcosecha; puede comenzar en el tallo y avanzar a través de la
mayor parte de la pulpa con sólo un oscurecimiento ligero de la piel como síntoma externo.
Este oscurecimiento se debe a la salida de agua de la piel que se encuentra sobre las porciones
dañadas de la pulpa. A medida que la pulpa se ablanda, la piel encima de ella se rompe
fácilmente bajo una presión ligera.

Fermentación por levaduras: causada por Saccharomyces spp, generalmente se le asocia con
fruta sobremadura. Las levaduras entran a la fruta a través de heridas. La pulpa se vuelve
blanda, de color amarillo brillante y pierde continuidad debido a la presencia de cavidades con
gas (bióxido de carbono y otros compuestos volátiles producto de la fermentación). (4)

DIAGRAMA DE FLUJO PARA LA ELABORACIÓN DE ALCOHOL DE PIÑA

ALCOHOL DE PIÑA

RECEPCIÓN

LAVADO Y SELECCIÓN

PELADO Y TROZADO ® cáscara y corazón

EXTRACCIÓN DE LA PULPA

azúcar y levadura ® PREPARACIÓN DEL MOSTO


FERMENTACIÓN ALCOHOLICA temperatura ambiente, 3 a 4 días

Filtrado DESTILADO A 78 °C

ENVASADO

PROCEDIMIENTO

Preparación

1._ Se esteriliza el recipiente donde se llevara a cabo la fermentación, al igual que los
materiales a utilizar como el agitador utilizado para homogenizar la solución a preparar.

2._ Nuestra materia prima a utilizar, que en este caso es la piña se lava perfectamente y se
retira por completo la cascara.

3._ Procedemos a picar la piña pues, ya que se utilizara solo la pulpa de esta. Se licua con 250
ml de agua natural y 100 gr de piloncillo.

4._ Licuada la piña esta se coloca dentro del recipiente esterilizado anteriormente y se le
agrega 7 gr de levadura y se agita hasta incorporarla bien.

5._ La pulpa de la piña se pone a fermentar durante cuatro días.

6._Debe controlarse la temperatura en un intervalo de 27ºC a 32ºC y el pH de 4 a 5 cada dos


horas a medida que se produzca una buena fermentación y la levadura se encuentre en
condiciones óptimas para poder desarrollarse.

Purificación del metabolito.

1._ Transcurridos los cuatro días de fermentación, se filtra la solución fermentada de piña para
obtener solo líquido y eliminar los excesos de piña.

2._En un matraz balón de 250 ml agregar la solución fermentada de piña habiendo sido
anteriormente filtrada.

3._Cerrar el matraz balón con un tapón con orificio y colocar el termómetro.

4._Colocar el matraz balón en un refrigerante a reflujo conectado este a su vez a un


refrigerante para destilación, tenga cuidado de no oler los desprendimientos gaseosos.
5._Calentar hasta 78º C (punto de ebullición del alcohol). Recoger el destilado en un matraz
Erlenmeyer.

5._Realizar los cálculos necesarios.

RESULTADOS

Recepción: consiste en cuantificar la materia prima que entra al proceso, es necesario usar
balanzas limpias y calibradas.

Lavado y selección: el lavado se efectúa con agua clorada, y la selección con base a la
maduración de la piña además, que no haya materia prima defectuosa.

Preparación de la fruta: la eliminación de la cáscara, esto reduce la tendencia a un sabor


desagradable en el producto final. Este proceso se puede hacer en forma manual o mecánica;
en nuestro caso la piña se preparó de forma manual.

Extracción de la pulpa: se hace pasando la fruta por un despulpador o bien licuándola para
facilitar la extracción. En la extracción de la pulpa se pueden agregar pequeñas cantidades de
agua para facilitar su molido.
Estandarizado: la pulpa extraída de la extracción o licuado se le debe adicionar azúcar o
piloncillo. Estos son carbohidratos que facilitarán la fermentación.

Preparación del cultivo: el cultivo se hace separando la pulpa se inocula con levadura del tipo
͞SACCHAROMYCES CEREVISIAE͟ (levadura para panificar). Se vierte la pulpa licuada en un
recipiente limpio; debe incorporar bien la levadura al mosto agitándolo homogéneamente.

Mezclado y fermentación alcohólica: el cultivo preparado en el paso anterior se agrega al


recipiente y se deja fermentar por unos 3 o 4 días, a temperatura ambiente. Este debe taparse
muy bien. Abrirlo solo para medir su pH en un rango de tiempo determinado.
Transvasado: a los 4 días, el líquido claro obtenido de la fase anterior, se transvasa con la
ayuda de un filtro a un matraz donde se medirán 800 ml. del fermentado que se utilizara
posteriormente para destilarlo.

Una vez colocado en un matraz el líquido filtrado anteriormente se prepara para destilarlo y
así poder obtener el alcohol de piña.

Filtrado: el filtrado se hace con la ayuda de filtros o coladores finos con diámetro de 0.45 µm,
para eliminar residuos de pulpa o levadura y obtener solamente el liquido que es el que
utilizaremos para destilarlo.

Envasado: se hace en un recipiente con tapa de rosca, previamente esterilizado.

Al término de haber destilado el líquido que se fermentó durante tres días se obtuvo 8 ml de
alcohol, el cual fue recogido en un matraz, posteriormente se almacena en un recipiente (un
frasco de 10 ml) previamente esterilizado.

CONDICIONES DE LA FERMENTACIÓN DE LA PIÑA

Temperatura: 27 - 32 ºC

Acidez: 4 ч pH ч 5
Glucosa + Levaduras ї Etanol + Dióxido de Carbono

CRECIMIENTO MICROBIANO EN LA FERMENTACIÓN DE LA PIÑA

Día / hora Temperatura ° C pH medido Apariencia del fermentado

13-11-09- 21:17 hrs. 28 3 Mezcla amarillo acuoso

14-11-09- 1:17 hrs. 28 3 amarillo acuoso

14-11-09- 5:19 hrs. 29 3 amarillo acuoso

14-11-09- 9:19 hrs. 28.5 3 amarillo oscuro

14-11-09- 15:19 hrs. 30 4 Amarillo oscuro espeso

15-11-09- 16:20 hrs. 31 4 Amarillo oscuro espeso

16-11-09- 11:24 hrs. 30 4 Amarillo oscuro

espeso

17-11-09- 11:00 hrs 30 4 Amarillo oscuro

espeso

CONCLUSIÓN

El proceso de obtención del alcohol etílico consiste en la fermentación de los azúcares de la


piña a alcohol etílico por acción de las levaduras presentes; Saccharomyces cerevisiae, como
aprendizaje podemos mencionar que el papel de los microorganismos que están presentes en
la obtención del alcohol de piña, son de suma importancia, así como el manejo que le
debemos dar en torno al control de la temperatura, ya que es una variable determinante en el
crecimiento microbiano en la fermentación alcohólica, la temperatura debe estar entre 25° a
30-31° C, ya que es el rango en el cual se desarrollan idealmente, de lo contrario podría
impedir su crecimiento.

De igual manera, así como en este proyecto, en la industria productora de Alcohol estos
microorganismos son una parte vital en sus procesos de producción.

Podemos recomendar a posteriores personas que repitan este proceso de obtención de


alcohol etílico, controlar muy bien variables como la temperatura en la destilación del
fermentado ya que el punto de ebullición del etanol es de 78°C el cual esta relativamente
cerca al del agua que es 100°C, si el instrumento que utilicen para calentar el fermentado no
permite una perfecta regulación de la temperatura, se puede elevar muy rápido y alcanzar a
evaporar agua, lo que restaría pureza a nuestro etanol, esta situación represento un problema
para nosotros, ya que no contábamos con el equipo adecuado y requirió de un mayor esfuerzo
y atención.

Por último podemos mencionar la gran diversidad de microorganismos que existen y que son
o pueden ser utilizados en la producción de una gran variedad de metabolitos, los cuales son
una mano de obra muy barata en la industria; por muchos factores, podríamos nosotros como
futuros ingenieros químicos poner algo de atención a esta área que para nuestra percepción es
una de las ramas más interesantes en la ingeniería química, y aprovechar mas las materias
primas que tenemos.

BIBLIOGRAFÍA

1. HERNANDEZ, Alicia; ALFARO, Ileana; ARRIETA Ronhald, ͞Microbiología Industrial͟ 1ra


ed .España: Editorial EUNED.

2. INGRAHAM, John; INGRAHAM Catherine, ͞Introducción a la microbiología͟ 1ra ed.


España: Editorial Reverté, 1998.

3. PERRY Robert H., ͞Manual del Ingeniero Químico͟ 7ma ed. España: Editorial McGraw-
Hill, 2004.

4. SUAREZ LEPE, José Antonio; IÑIGO LEAL, Baldomero, ͞Microbiología Enológica͟ 2 ed.
España: Editorial Mundi-Prensa 1992.

5. YUAN KUN, Lee, "Biotecnología Microbiana: Principios y Aplicaciones" 1ra ed


.Estados Unidos: Editorial Mundo Científico, 2006.

ANEXOS

RECUPERACIÓN DE PRODUCTOS.

Una vez realizada la fermentación, hemos de recuperar el producto que hemos ganado. Las
técnicas para recuperar el producto son similares a las usadas en la industria química
convencional, pero con la salvedad que nuestro producto es biológico, por lo que no podremos
usar ninguna técnica que pueda inactivar el producto. También hemos de tener presente la
localización de nuestro producto, de manera que si queremos la célula o un producto
sintetizado por ellas las técnicas variaran, igual que variaran si el producto es intracelular o
extracelular.
Otro aspecto que se ha de tener en cuenta y no olvidar nunca es que estamos en la industria,
lo que implica que buscamos rentabilidad, de manera que no podremos usar algunas técnicas.
En general, la recuperación puede suponer el 20% del costo del producto, pero en productos
con un alto valor añadido puede llegar al 95% del total.

1. La selección de las técnicas a emplear depende de:

a. Localización del producto: Variará si es intra- o extracelular.

b. Características físicas y químicas del producto.

c. Características biológicas: se altera con facilidad.

2. Concentración

3. Presencia de productos secundarios.

4. Destino del producto: el grado de purificación será diferente si se trata de un producto


medioambiental, alimentario o sanitario. (5)

Existen una serie de etapas en el proceso de recuperación del producto, una vez concluido la
fermentación y tenemos el medio de cultivo con el producto y los organismos.

ͻ Separación de los sólidos en suspensión; microorganismos básicamente. Se ha de tener


en cuenta que si el producto es intracelular deberemos lisar los microorganismos antes de
eliminarlos, o bien conservar la parte sólida y eliminar el medio.

ͻ Extracción, concentración y purificación. En este punto se tienen que considerar los


diferentes métodos de extracción, ya que no se usarán los mismos métodos para extraer
antibióticos que para extraer alcohol.

Podemos iniciar el proceso de extracción en base al tamaño del producto. Podemos tener
diferentes tamaños. En función de cuál sea el tamaño se usará un método u otro. Existen
diferentes protocolos, basados en diferentes principios, ya sean el tamaño, la carga, el peso, se
usará uno u otro como criterio de selección.

Veremos ahora una serie de métodos, basados en el tamaño. Estos métodos están ordenados
en función de tamaño, de manera que los primeros sirven para partículas más grandes que los
últimos.

a. Sedimentación: es el método más fácil y barato. Si el producto es estable, se deja


sedimentar en el propio fermentador. Un problema es que la sedimentación requiere tiempo,
entre 24 y 48 hrs, lo que es bastante tiempo.
b. Centrifugación: es un proceso más rápido que la sedimentación, pero ya no es gratis,
sino que requiere energía a la vez que algunos aparatos adecuados. Además no se puede usar
la centrifuga de carga, sino en continuo. Se usan decantadores westfalia.

c. Floculación: resulta de mucho interés en la industria, puesto que es gratis. Para


sedimentar, las partículas han de ser mayores o iguales a 3 µm. Si son más pequeñas, se añade
un floculante, provocando que aumenten de tamaño y sedimenten. Se ha de ir con cuidado
con el floculante que se añade, ya que si lo que sedimenta es residuo no hay problema, pero si
el producto, se ha de ir con cuidado con el floculante, que no podrá ser insoluble.

d. Filtración: es un método de mucho interés. El problema es que suele resultar muy


caro, ya que los filtros resultan caros y que requiere energía. Se ha optimizar el proceso.

e. Filtración perpendicular: se hace pasar lo que se quiere filtrar perpendicularmente al


filtro. Se ha de hacer un prefiltrado para eliminar posibles residuos grandes que puedan
obturar el filtro.

f. Filtro tangencial: es similar al anterior, pero el flujo es tangencial.

g. Diálisis: la mezcla se introduce en un saco semipermeable adecuado, que se sumerge


en agua o un tampón adecuado. Lo que pueda pasar a través de la membrana saldrá, mientras
que lo que no permanecerá en la bolsa.

Existen otras técnicas de separación, que cada día son más importantes a nivel biotecnológico.

h. Cromatografía de adsorción: se llena la columna de carbono activo o similar. Se vierte


el producto a purificar, y por interacciones se podrá purificar el producto.

i. Cromatografía de intercambio iónico: el producto tiene una carga eléctrica, sea cual
sea. Se llena de resina catiónica o aniónica, según sea el caso, en una columna. El producto
quedará retenido entonces por carga. El tipo de resina dependerá de la carga del producto.

j. Cromatografía de exclusión molecular: existen ciertos polisacáridos, como dextranos o


sephadex, que permiten hacer columnas a la carta. La idea es que confiere una forma con
receptáculos para moléculas de determinado tamaño, ni más grandes ni más pequeñas

k. Cromatografía de afinidad: es las más fina de todas las técnicas, pero por lo tanto, la
más cara. Se usa una columna con un sustrato muy afín al producto, como puede ser la
relación antígeno- anticuerpo, o enzima- sustrato. Se busca interacciones muy especificas
entre sustrato- producto.

Las principales operaciones de recuperación en la que con las etapas en que son utilizadas son:

SEPARACIÓN DE SÓLIDOS

Por gravedad Sedimentación, centrifugación, floculación

Mecánica Filtración. Diálisis


En superficie Adsorción, intercambio iónico, flotación

Térmica Desecado en spray, liofilización

Eléctrica Electroferesis

FRACCIONAMIENTO: Diálisis, electrodiálisis, ultrafiltración, cromatografía, electroforesis,


microflotación.

EXTRACCIÓN: Por disolventes, intercambio iónico, adsorción selectiva.

CONCETRACIÓN. Evaporación al vacío, osmosis inversa.

PURIFICACIÓN: Cristalización, desecado.

ROTULAR CELULAR: Rotura mecánica, lisis física, lisis química, lisis enzimática.

OTROS: Separación magnética.

Hemos hablado de diferentes tipos de cromatografía, que se diferencian en diversos aspectos,


como se ve en la tabla inferior:

Tipo Mecanismo Separación según

Cromatografía de adsorción Unión en superficie Afinidad por la superficie

Cromatografía de intercambio iónico Unión iónica Cargas

Cromatografía de exclusión molecular o de permeación en gel. Difusión por poros


Tamaño y forma de las moléculas

Cromatografía de afinidad: Adsorción/desorción bioespecífica Estructura molecular

Hay seis métodos físicos principales para separar los componentes de una mezcla, eligiéndose
uno u otro según que la mezcla sea sólida o líquida, y según las características de sus
componentes:

ͻ Por tamización: si la mezcla está formada por granos de diferentes tamaños,


haciéndola pasar por un tamiz, la separaremos en sus componentes. Los buscadores de oro
usaban esta técnica para buscar las pepitas del mineral.

ͻ Por filtración: separamos un sólido del líquido en el que está suspendido, vertiendo la
mezcla en un embudo con un filtro poroso por el que el líquido puede penetrar fácilmente. Así
podemos separar arena y agua.

ͻ
ͻ Por decantación: separamos dos líquidos de diferentes densidades, vertiendo la
mezcla en un embudo de decantación; cuando ha reposado y se han formado dos capas,
abrimos la llave inferior del embudo y dejamos caer el más denso, quedando el menos denso
en el embudo. Así separamos una mezcla de aceite y agua, por ejemplo.

ͻ Por separación magnética: si una de las sustancias de la mezcla tiene propiedades


magnéticas, como el hierro, la podemos separar con un imán.

ͻ Por evaporación: si en una mezcla líquida conseguimos que uno de los componentes se
evapore, quedando el otro.

ͻ Por cristalización y precipitación: algunas mezclas líquidas, como la del sulfato de


cobre en agua, tras calentarlas y filtrarlas, se dejan en un cristalizador (recipiente bajo y
ancho), de manera que al enfriarse, el agua se evapora y el sulfato de cobre queda separado
en forma de cristales.(3)

LIMITACIONES DEL PROCESO

La determinación de los factores que limitan la glicólisis fermentativa del etanol son complejos
debido a la interrelación existente y a la naturaleza de los parámetros intervinientes durante el
proceso de fermentación. Algunos de ellos se deben tener en cuenta en la fermentación
alcohólica industrial. En las limitaciones que surgen durante el proceso se pueden enumerar
algunos de los más importantes como son:

ͻ Concentración de etanol resultante: Una de las principales limitaciones del proceso, es


la resistencia de las levaduras a las concentraciones de etanol (alcohol) que se llegan a
producir durante la fermentación, algunos microorganismos como el ͞SACCHAROMYCES
CEREVISSIAE͟ pueden llegar a soportar hasta el 20% de concentración en volumen.

ͻ Acidez del substrato: El pH es un factor limitante en el proceso de la fermentación ya


que las levaduras se encuentran afectadas claramente por el ambiente, bien sea alcalino o
ácido. Por regla general el funcionamiento de las levaduras está en un rango que va
aproximadamente desde 3.5 a 5.5 pH. Los procesos industriales procuran mantener los niveles
óptimos de acidez durante la fermentación usualmente mediante el empleo de disoluciones
tampón. Los ácidos de algunas frutas (ácido tartárico, málico) limitan a veces este proceso.

ͻ Concentración de azúcares: La concentración excesiva de hidratos de carbono en


forma de monosacáridos y disacáridos puede frenar la actividad bacteriana. De la misma forma
la baja concentración puede frenar el proceso. Las concentraciones límite dependen del tipo
de azúcar así como de la levadura responsable de la fermentación.

ͻ Contacto con el aire: Una intervención de oxígeno (por mínima que sea) en el proceso
lo detiene por completo (es el denominado Efecto Pasteur). Esta es la razón por la que los
recipientes fermentadores se cierren herméticamente.

ͻ La temperatura: El proceso de fermentación es exotérmico, y las levaduras tienen un


régimen de funcionamiento en unos rangos de temperatura óptimos, se debe entender
además que las levaduras son seres mesófilos. Si se expone cualquier levadura a una
temperatura cercana o superior a 55 ºC por un tiempo de 5 minutos se produce su muerte. La
mayoría cumple su misión a temperaturas de 30ºC.

ͻ Ritmo de crecimiento de las cepas: Durante la fermentación las cepas crecen en


número debido a las condiciones favorables que se presentan en el medio, esto hace que se
incremente la concentración de levaduras.(1)

El proceso productivo del Etanol

El Etanol es el alcohol etílico producido a partir de la fermentación de los azúcares que se


encuentran en los productos vegetales (cereales, caña de azúcar, remolacha o biomasa)
combinados en forma de sacarosa, almidón, hemicelulosa y celulosa. Dependiendo de su
fuente de obtención, su producción implica fundamentalmente el proceso de separación de las
azúcares, y la fermentación y destilación de las mismas

Deben considerarse los siguientes pasos para una buena fermentación de la piña:

1. Los frutos deben de estar maduros.

2. Deben cosecharse libres de enfermedades.

3. No deben mezclarse frutos enfermos, inmaduros o sobre madurados con los frutos
sanos. Las cajas de fermentación o cestos deben limpiarse previamente al inicio del proceso,
eliminando restos, hongos o insectos que puedan estar presentes.

4. La fermentación debe programarse para reunir suficientes frutos y abrirlos al mismo


tiempo, para llenar el fermentador inmediatamente. De otra manera, la falta de materia prima
provoca fallas en el proceso, por no existir el volumen suficiente para alcanzar la temperatura
requerida en el proceso.

5. Es necesario controlar el proceso en su totalidad.

6. El proceso debe durar el tiempo necesario, pues si este se disminuye, muchos frutos
quedan sin fermentar y si se aumenta, ocurrirá la sobre fermentación que provoca malos
olores y cambios en la masa que perjudican significativamente la calidad del producto final.

7. Para saber si la piña está fermentado correctamente, debe medirse el PH

ETANOL (anhidro)

Alcohol etílico

CH3CH2OH/C2H5OH

Masa molecular: 46.1


Datos importantes

ESTADO FISICO; ASPECTO

Líquido incoloro, de olor característico.

PELIGROS FISICOS

El vapor se mezcla bien con el aire, formándose fácilmente mezclas explosivas.

PELIGROS QUIMICOS

Reacciona lentamente con hipoclorito cálcico, óxido de plata y amoníaco, originando peligro
de incendio y explosión. Reacciona violentamente con oxidantes fuertes tales como, ácido
nítrico o perclorato magnésico, originando peligro de incendio y explosión.

VIAS DE EXPOSICION

La sustancia se puede absorber por inhalación del vapor y por ingestión.

RIESGO DE INHALACION

Por evaporación de esta sustancia a 20°C se puede alcanzar lentamente una concentración
nociva en el aire.

PROPIEDADES FISICAS

Punto de ebullición: 78°C

Punto de fusión: -117°C

Densidad relativa (agua = 1): 0.8

Solubilidad en agua: Miscible

Presión de vapor, kPa a 20°C: 5.8

Densidad relativa de vapor (aire = 1): 1.6

Densidad relativa de la mezcla vapor/aire a 20°C (aire = 1): 1.03

Punto de inflamación: 13°C (c.c.)

Temperatura de autoignición: 363°C

Límites de explosividad, % en volumen en el aire: 3.3-19

Coeficiente de reparto etanol/agua como log Pow: -0.32


Condiciones para el desarrollo de levaduras.

Como todos los seres vivos, las levaduras tienen necesidades precisas en cuanto al medio en
que viven y a su nutrición. Son muy sensibles a la temperatura, necesitan oxigeno, una
alimentación apropiada en azúcares, en elementos minerales, en sustancias nitrogenadas y en
factores de crecimiento

Influencia de la aireación.

Las levaduras tienen necesidad de oxígeno para desarrollarse, pero ellas se adaptan durante
un cierto tiempo a la vida anaeróbica.

La necesidad de oxígeno es indirecta ya que las levaduras deben tener oxígeno para sintetizar
los esteroles y asimilar ciertos ácidos grasos. Los esteroles son sustancias con una cadena de
carbonos y una función alcohol y son el origen de varias hormonas y vitaminas de una
importancia considerable. Al comenzar la fermentación las primeras generaciones de
levaduras aprovechan las reservas de esteroles de las células madres y después de los
esteroles del medio natural. Debido a esto es necesaria la realización de remontares abiertos
donde se oxigena el vino en parte.

Influencia de la Acidez

Tiene gran influencia sobre diversos microorganismos que viven en el medio fermentativo y
compiten de tal manera que la acidez favorece a algunos y perjudica a otros. La acidez normal
de los vinos, pH que va de 2.8 a 3.7 , no influye sobre las levaduras en cuanto a su actividad
fermentativa ni su multiplicación, pero esta acidez imposibilita el desarrollo ( multiplicación y
actividad) de microorganismos indeseables de tal manera que el pH natural de los mostos es
un factor de selección favorable para las levaduras.

Influencia del Alcohol

A partir de los 13 grados GL la fermentación alcohólica es lenta y difícil, así las levaduras son
incapaces de terminar la fermentación en mostos que tienen 16 grados GL de alcohol
probable. Esto debido principalmente al estrés que sufre la levadura con a los niveles de
alcohol a nivel de la permeabilidad de membrana.

Influencia del Anhídrido Sulfuroso

Dependiendo de la cantidad de sulfuroso (SO2) que se encuentre en el medio ejerce una


oposición al desarrollo de microorganismo, teniendo una función antiséptica lo que ayuda a
asegurar la regularidad de la fermentación y su pureza. De tal forma ejerce una acción
selectiva ya que a igualdad de condiciones la resistencia a su acción antiséptica varia en
hongos, bacterias y levaduras, de tal forma que con una determinada dosis paraliza la
actividad de algunos microorganismos y para otros es letal.
Necesidades mínimas para el crecimiento de Saccharomyces Cerevisiae

ͻ Fuente de carbono: azúcares.

ͻ Fuente de nitrógeno: sulfato amoníaco, úrea o aminoácidos.

ͻ Biotina, también llamada vitamina B8 o vitamina H.

ͻ Sales y elementos traza.

A lo largo de todo el proceso de fermentación, y en función de las condiciones (cantidad de


azúcar disponible, temperatura, oxigeno, etc.) cambia el tipo de levadura que predomina
pudiéndose distinguir varias fases en la fermentación:

1ª fase (primeras 24 horas), predominan levaduras no esporogonias, que resisten un grado


alcohólico 4-5. Son sensibles al anhídrido sulfuroso.

2ª fase,(2º-4º día), predomina el Saccharomyces Cerevisiae que resiste hasta un grado de


alcohol entre 8 y 16. En esta fase es cuando se da la máxima capacidad fermentativa.

3ª fase, sigue actuando Saccharomyces Cerevisiae junto a Saccharomyces Oviformis. También


pueden existir otros microorganismos procedentes principalmente de las bodegas y de los
utensilios, suelen ser hongos entre los que destacan Penicillium, Aspergilus, Oidium,...

GLOSARIO

Bacteria: Organismo unicelular carente de membrana nuclear que delimite en su citoplasma


un verdadero núcleo. Su tamaño oscila entre 1 y 3 micrómetros y, por su forma se dividen en:
bacilos (bastoncitos), cocos (redondeados), espirilos (espiral).

Muchas de las bacterias están dotadas de unos filamentos locomotores, que se llaman flagelos
cuando son largos y escasos, y cilios cuando son más cortos y numerosos.

Fermentación: Desde el punto de vista bioquímico, una fermentación se define como un


proceso mediante el cual las sustancias orgánicas (sustrato) sufren una serie de cambios
químicos (reducciones y oxidaciones) que producen energía: al finalizar la fermentación, se
presenta una acumulación de varios productos, unos más oxidados (aceptaron electrones) y
otros más reducidos (donaron electrones) que el sustrato, con un balance total de energía
positivo. Esta energía es utilizada en el metabolismo de los microorganismos.

Fermentación Alcohólica: La fermentación alcohólica consiste en la transformación de la


glucosa en dos moléculas de alcohol etílico y dos de CO2. El proceso de degradación de la
glucosa es común a la glucólisis hasta el estado de ácido pirúvico, pero, a partir de aquí, éste se
descarboxila pasando a acetaldehído, el cual se reduce posteriormente a alcohol etílico.
La reacción global de la fermentación alcohólica será:

Glucosa + 2 ATP + 2 ADP -> 2 alcohol etílico + 2 CO2 + 2 ATP

En la fermentación alcohólica se producen también otras sustancias orgánicas, denominadas


productos secundarios, como, por ejemplo, ácido succínico, glicerina y ácido acético.

Glucolisis: o glicolisis, es la vía metabólica encargada de oxidar o fermentar la glucosa y así


obtener energía para la célula.

Levadura: Hongo microscópico, unicelular, con un núcleo que encierra los cromosomas
portadores de la información genética en forma de una molécula de ADN. Cada célula mide
aproximadamente 5micrometros en su longitud mayor; se produce por vía asexual, mediante
gemación.

Organismo Anaerobio: no necesitan oxígeno (O2) para desarrollarse, a diferencia de los


organismos aerobios.

pH: es la concentración de iones o cationes hidrógeno [H+] presentes en determinada


sustancia.

͞SACCHAROMYCES CEREVISSIAE͟: es un hongo unicelular, es un tipo de levadura utilizado


industrialmente en la fabricación del pan, cerveza y vino.

Escala de pH: La escala de pH nos muestra cómo de ácida o básica es una sustancia. Aquí
aparecen varias sustancias con el valor de su pH: cuanto más próximo a cero, más ácida es la
sustancia, y cuanto más próximo a 14, más básica.

Acido láctico: El ácido ы-láctico se produce a partir del pirúvato a través de la enzima lactato
deshidrogenado (LDH) en procesos de fermentación.

Acido pirúvico: es un ácido incoloro, de aroma similar al ácido acético.

Anaerobios: organismos que no necesitan oxígeno (O2) para desarrollarse, a diferencia de los
organismos aerobios.

Metabolismo: El metabolismo es el conjunto de reacciones y procesos físico-químicos que


ocurren en una célula.

http://www.buenastareas.com/ensayos/Bioprocesos-De-Separacion/655019.html