Está en la página 1de 4

Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Qumica
Laboratorio de Bioqumica Experimental
REGULACIN DEL METABOLISMO: REGULACIN GENTICA EN EL OPERN lac
Bautista Quiroz Erik Antonio, Canchola Carrillo Eileen Vittoria.
Informacin
19 noviembre de
2014
Palabras clave:
E. coli W3110
Opern
ONPG
-galactosidasa

Resumen
El opern Lac es un opern requerido en el transporte y el metabolismo de lactosa en
diversas bacterias. En este ensayo experimental se evalu su regulacin gentica,
incubando una cepa de E. coli W3110 en un medio con diferentes concentraciones de
glucosa y lactosa para activar la sntesis de la -galactosidasa. Posteriormente, a estas
bacterias se les aadi ONPG; el cual es hidrolizado por la -galactosidasa para generar onitrofenol, un compuesto que funciona como marcador de que se est llevando a cabo la
reaccin de dicha enzima otorgndole a las muestras una coloracin amarillenta. Para
poder asignar un valor cuantitativo a la produccin de -galactosidasa (coloracin amarilla)
de las muestras, se midi su absorbancia a una longitud de onda de 420 nm. Se determin
una coloracin ms intensa en el tubo B (Lactosa 2%), es decir, una concentracin de onitrofenol mayor, lo cual es directamente proporcional a la cantidad de -galactosidasa

INTRODUCCIN
La regulacin metablica es el incremento
o el decremento de una reaccin
enzimtica o de toda una secuencia de
reacciones enzimticas de las rutas
metablicas, a travs de mecanismos
globales de regulacin que involucra el
aumento
o
disminucin
de
la
concentracin de enzimas por medio de la
regulacin de la expresin gentica, que es
explicada a travs de modelos conocidos
como operones (Moat, 2002).
En bacterias, el opern Lac es necesario
para la utilizacin de lactosa como fuente
de carbono. El opern (Figura 1) consiste
de 3 genes: lac Z (-galactosidasa), lac Y
(-galacto-permeasa) y lac A (Galactsidotransacetilasa). Adems de stos genes
existen la secuencia promotora, operadora
y el gen lac I. El operador es el sitio de
unin para el represor transcripcional
codificado por lac I, que es una protena
que se transcribe independientemente de
los otros genes lac.

Figura 1.Esquema del Opern Lac. (Imagen


obtenida de la pgina web
http://genmolecular.com/regulacion-de-laexpresion-genica/)

Estas protenas (lac Z, lac Y, lac A) slo son


necesarias cuando la bacteria requiere
utilizar lactosa como fuente de carbono;
adems, su expresin es regulada en
respuesta a la concentracin de glucosa y
lactosa. En ausencia de lactosa, el represor
Lac I se une a la zona operadora y
previene la unin de la RNA polimerasa a
la zona promotora, impidiendo la sntesis
de protenas (lac Z, lac Y, lac A). Sin
embargo cuando existe un medio con
lactosa provoca la prdida de afinidad de
Lac I por el operador. Esto elimina la
represin de la transcripcin del opern

cuando dichas molculas se encuentran


presentes. La expresin del opern Lac
tambin es regulada por la glucosa,
mediante la Protena Activadora por
Catabolitos (CAP). sta protena se une al
AMP cclico (cAMP) y a la regin promotora
del operador para incrementar el inicio de
la transcripcin por la RNA polimerasa. La
ausencia de glucosa estimula la produccin
de cAMP, lo que incrementa la unin de
CAP al promotor e induce la expresin del
opern Lac (Casali, 2003). As mismo la
presencia de glucosa disminuye la
produccin de cAMP, lo que disminuye la
unin de CAP al promotor e inhibe la
expresin del opern Lac.
Para demostrar que existe una regulacin
de la expresin gentica encargada de
llevar a cabo la biotransformacin (o
metabolismo) de la lactosa, se realizaran
una serie de ensayos en cultivos de E. coli
W3110 en medio M9 glicerol, las clulas
bacterianas sern cultivadas a una
temperatura de 37C por 15 minutos en
diferentes fuentes de carbono: glucosa,
lactosa, glucosa + lactosa y glucosa a la
que posteriormente se la agregara lactosa
y un blanco con glucosa + lactosa (la
concentracin de cada carbohidrato ser al
2% en un volumen de 250.0 L). Para
evaluar la actividad del opern de lactosa
se utiliz como marcador al ONPG, que nos
permite visualizar la expresin del gen Z
(-galactosidasa).
La -galactosidasa hidroliza el sustrato
sinttico e incoloro (ONPG) como se
muestra en la Fig.2, midiendo la
absorbancia del o- nitrofenol (producto de
la reaccin de hidrlisis) a una longitud de
onda de 420 nm.

Figura 2. Reaccin de hidrlisis del ONPG por la


-galactosidasa (imagen obtenida de la pgina
web: bio-spring.info).

OBJETIVO
Comprender el funcionamiento del opern
de lactosa en presencia y ausencia de
glucosa y lactosa, monitoreando la
produccin de -galactosidasa por medio
de una reaccin colorida.
HIPTESIS
La presencia o ausencia de la lactosa ser
el nico factor que influye en la expresin
de los genes involucrados para el uso de
este carbohidrato como fuente de carbono.
METODOLOGA
La parte experimental fue realizada de
acuerdo al protocolo: REGULACIN DEL
METABOLISMO
PARTE I: REGULACIN GENTICA EN EL
OPERN lac del Manual de Prcticas de
Bioqumica Experimental de la Facultad de
Qumica de la UNAM
RESULTADOS
Despus de una incubacin a 31C durante
15 minutos, se procedi a la lectura de la
actividad
enzimtica,
usando
como
marcador de dicha actividad al ONPG.
El ONPG al ser hidrolizado por la galactosidasa, se produce o-nitrofenol, que
es un compuesto de coloracin amarilla
cuya absorbancia se lee a 420 nm; esta
coloracin se puede apreciar en los tubos
(A (glucosa), B (lactosa), C (glucosa +

lactosa), D (glucosa + lactosa aadida 7.5


min. despus) comparada con un grupo
control (tubo E (blanco)), como se muestra
en la Figura 3.
Para obtener un valor cuantitativo de
la intensidad de la coloracin amarilla,
se midi su absorbacia a una longitud
de onda de 420 nm. Los resultados de
las absorbancias medidas se registran
en la Tabla 1.
Tabla 1.- Medida cuantitativa de la
Produccin de -galactosidasa.
Tubo

Blanco (Tubo
E)
A
B
C
D

Conteni
do (al
2% en
250.0
L)
-

A420 nm

glucosa
lactosa
glucosa +
lactosa
Glucosa
+ lactosa
aadida
7.5 min.
Despus

0.222
0.683
0.436

0.591

DISCUSIN
Se realiz el monitoreo de la
regulacin gentica del Opern
Lac del cultivo de Escherichia
coli W3110 en medio M9glicerol,
en
presencia
de
glucosa, lactosa o una mezcla
de ambos. Para permitir la
visualizacin de la expresin
del gen Z (.galactosidasa) ; se
aadi ONPG, el cual es
hidrolizado
a o-nitrofenol
(compuesto
amarillo).
La
cantidad
de
o-nitrofenol

Tubo A
(glucosa
)

Tubo C
(glucosa
+
lactosa)

Tubo E
(blanco
)

producido es directamente proporcional


a la absorbancia registrada a 420 nm.
De acuerdo a la Tabla 1 la mayor
produccin de o-nitrofenolTubo
ocurri
en el
D (glucosa
Tubo
+ lactosa
tubo B; debido
la Bpresencia
de lactosa
aadida
en el medio.(lactos
As mismo,
se 7.5
puede
a))
min. Despus).
observar
Tabla 1
en la Figura 3
Figura en
3. Lalacantidad
dey-galactosidasa
producida
es
directamente
proporcional
a la
que los tubos C y D
presentan
cantidad de o-nitrofenol producido y, por lo tanto,
coloracin
amarilla.
directamente
proporcional a la intensidad de
color amarillo.

En el tubo C las bacterias emplearon en


primer lugar la glucosa (carbohidrato
ms sencillo) y posteriormente, en
ausencia
de
glucosa,
emplearon
lactosa
(expresin
de
la
galactosidasa); presentndose as el
fenmeno de Diauxa. La glucosa acta
como una molcula de sealizacin que
reprime la expresin del opern Lac al
disminuir la concentracin de AMPc y
su unin a la CAP, una vez empleada la
glucosa aumenta el AMPc y su unin a
la CAP y al promotor Lac, resultando en
un aumento de la transcripcin del
Opern Lac.
En el tubo D en un principio la bacteria
slo estaba en presencia de glucosa
por lo cual no se esperaba aparicin de
color,no obstante a la mitad del
experimento se agreg Lactosa, esto
permiti que una vez que se acabar
el carbohidrato ms simple (glucosa) la
bacteria empezar emplear Lactosa
que estaba en su medio y con ello
aumentar la induccin a nivel
transcripcional del Opern Lac.
Por ltimo en el tubo A no hay inductor,
en este caso el indutor es la lactosa y
al no estar presente se va a llevar a
cabo la represin de la zona operadora

por el represor y por lo tanto la RNA


polimerasa no podr llevar a cabo la
sintesis de los genes estructurales. Sin
embargo este tubo presenta una ligera
coloracin amarilla, mostrando que no
se inhibe la transcripcin del gen Z
completamente, ya que siempre hay un
estado basal y este fenmeno provoca
una coloracin en dicho tubo.
CONCLUSIN
Se llev a cabo el monitoreo de la
regulacin gentica del opern Lac,
utilizando
lactosa
y
glucosa,
comprendiendose as el funcionamiento
de este mecanismo de regulacin de la
expresin gentica Se determin que la
lactosa induce la expresin de los
genes del opern (tubos B, C y D),
mientras que la glucosa los inhibe

(tubo A). Cuando ambos carbohidratos


se administran en conjunto, ocurrir el
fenmeno de diauxa (tubos C y D).
REFERENCIA BIBLIOGRFICA

Moat Albert, (2002) Microbial


Physiology. 4th Edition, USA, Edit.
Wiley & Sons, pag. 736.

Casali Nicola, (2003) E. coli


Plasmid Vectors: Methods and
Applications. Methods in Molecular
Biology,
Volume
235.
Springer
Science & Bussiness Media, pp 277 y
278.

Snchez Sobeida, Material


de Apoyo para los estudiantes
del
curso
de
Bioqumica
Experimental (0141) Facultad de
Qumica,UNAM,2013 , pp. 41-43.

También podría gustarte