DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEINAS

METODO DE BIURET

¿En qué consiste la reacción del Biuret?

El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por

la condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco.

Reacción del Biuret

Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO 4) se añade

a una solución de proteína se forma una complejo entre el ion cúprico y
los enlaces peptídicos, con aparición de una coloración violeta-púrpura,
que presenta un máximo de absorción a 540 nm.

Las características más importantes de la reacción son:

· La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los

péptidos y proteínas.

· Su rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml.

· No depende de la composición de aminoácidos.

· Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reacción.

Violeta-púrpura
Complejo proteína-Cu(II)
El espectrofotómetro que se va a manejar en la práctica es del tipo
convencional de haz simple. Un esquema del mismo se presenta a
continuación:

Esquema de un espectrofotómetro convencional de haz simple

· Se enciende el espectrofotómetro y se ajusta la longitud de onda del

espectrofotómetro a 540 nm.

· Se colocan en una gradilla ocho tubos de ensayo que deben de estar

limpios y secos.

· Se numeran del 1 al 8 con un rotulador permanente al agua.

· Con las micropipetas adecuadas al volumen a medir, se adiciona a
cada uno de ellos los volúmenes de la disolución patrón de albúmina
de suero bovino (BSA) y de agua destilada que se indican en la
siguiente Tabla:

Tubo Albúmina Agua Problema

(nº) patrón (mL) (ml)
(mL)
1 0 2,0
2 0,1 1,9
3 0,2 1,8
4 0,3 1,7
5 0,4 1,6
6 0.5 1,5
7 0.6 1.4
8 2.0

A cada uno de los tubos de ensayo se añaden 2 mL de reactivo de

Biuret, se tapa con papel parafilm y se invierte dos o tres veces para
mezclar

Se toma la gradilla con los tubos de ensayo y se introduce en el baño

de agua termostatizado a 37 ºC, dejándose que se desarrolle el color
durante 15 min.
· Se enfrían los tubos de ensayo, introduciendo la gradilla en el agua a
temperatura ambiente

Se sacan del fregador y se procede a medir en el espectrofotómetro

siguiendo las normas expresadas anteriormente.

· Se ajusta el cero de absorbancia con la solución blanco exenta de

proteína (tubo 1).

· Se miden las absorbancias de los tubos 2 a 8.

· Se anotan las medidas de absorbancia en el cuaderno de laboratorio.

· Una vez realizadas las medidas, se limpian cada uno de los tubos de
ensayo con escobilla y jabón. Las marcas de rotulador se eliminan
fácilmente por frotación con el estropajo. Se lava con abundante
agua del grifo y se enjuagan los tubos con agua destilada. Se dejan
en la gradilla boca abajo hasta el día siguiente para que se sequen.

 Se calcula la concentración de proteína que se ha colocado en cada

uno de los tubos de ensayo.
 Como ejemplo: en el ensayo de Biuret, en el tubo 2 se han colocado 0,2
mL de BSA 10 mg/mL y se han diluido a un volumen de 2 mL con agua.
Por tanto la concentración de proteína en el tubo será:

(0,2 mL x 10 mg/mL) : 2 mL = 1 mg/mL

· En papel milimetrado, se representan los valores experimentales de

absorbancia obtenidos frente a la concentración de proteína estándar
calculada de cada uno de los tubos, para cada método ensayado.

· Se ajustan los puntos obtenidos por el método de mínimos cuadrados a

una recta, incluyendo el punto 0,0.

· Se representan la rectas ajustada en el papel milimetrado.

Si la absorbancia de la muestra está dentro del rango de medida del

método seleccionado, mediante la ecuación de la recta de calibrado se
puede calcular la concentración de proteína de la disolución problema