Ingeniería Biotecnológica

Físico Química

UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA

CIENCIAS FARMACÉUTICAS, BIOQUÍMICAS Y
BIOTECNOLÓGICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA
BIOTECNOLÓGICA

ASIGNATURA: Análisis instrumental- 03

INTEGRANTES:

Ferrel Montesinos, Rodrigo Alonso

V Semestre

Arequipa - Perú
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Físico Química

Informe de Practica N° 6

ESPECTROFOTOMETRIA DEL ULTRAVIOLETA

DETERMINACION DE ACIDO BENZOICO

INTRODUCCIÓN

La determinación del ácido benzoico, también conocido como benzoato de sodio cuando se
encuentra en forma de sal, se puede realizar utilizando diferentes métodos analíticos.

Espectrofotometría UV-Visible: La espectrofotometría UV-Visible es una técnica utilizada

para determinar la concentración de compuestos en una muestra mediante la medición de la
absorción de luz a diferentes longitudes de onda. El ácido benzoico puede ser detectado y
cuantificado a través de su absorbancia en el rango UV-Visible.

OBJETIVOS

Preparación de las soluciones madre y patrones de ácido benzoico

● Obtener su espectro de absorción

● Seleccionar la longitud de onda de trabajo.
● Obtener la curva de calibración
● Determinar el contenido de ácido benzoico en un producto conservado
● Evaluar estadísticamente los resultados obtenidos

METODOLOGÍA

Materiales

● Fiolas de 10 ml.
● Bureta por 25 ml.
● Pipeta por 2, 5, 10 ml.
● Embudo de separación

REACTIVOS

● Cloroformo
● Solución saturada de cloruro de sodio acidificada con HCl (pH= 3 - 4 )
● Solución de HCl 0.001 M
● Solución stock de ácido benzoico de 250 ppm
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Calidad reactivo analítico, pureza 99.9%, se pesa 62.5 miligramos, se diluye y enrasa
con cloroformo en una fiola de 250 ml, agite para homogneizar la solución.

Métodos

.- Preparación de soluciones o patrones

Preparar 4 Fiolas de 50 ml. y preparar las soluciones patrones midiendo 5, 10, 15 y

20 ml de la solución stock de ácido benzoico. Llevar al enrase con cloroformo y
homogenizar la solución.

Soluciones Patrones de acido Benzoico

No patrón Volumen a medir ml Volumen final ml Concentración en

del stock ppm

1 1.0 25.0 10.0

2 2.0 25.0 20.0

3 3.0 25.0 30.0

4 4.0 25.0 40.0

2.- Determinación de la longitud de onda analítica

Seleccionar la función “ESPECTRO” en el modo básico del menú y ajustar los

parámetros analíticos siguientes:

1.- INTERVALO DE LONGITUD DE ONDA

λ S = 300 NM λE= 200 NM

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2.- RANGOS DE ABSORBANCIA

UPPER = + 1.00 LOWER = 0.00 A

Graficar la curva de absorción y efectuar un barrido con el cursor y determinar su

longitud de onda de trabajo. Usar como blanco cloroformo

3.- Medición de las muestras

Pesar exactamente 5.0000 gramos de muestra, se trata con una solución de 50 ml de

cloruro de sodio saturada y ligeramente acidificada con ácido clorhídrico hasta
obtener más o menos un pH 3 - 4 en un embudo de separación.

Agite y agregue aproximadamente 20 ml de cloroformo, se agita fuertermente para

que el ácido benzoico pase de la fase acuosa a la orgánica. Deje en reposo para
permitir la separación de las dos fases. Separe la fase orgánica llevándola a otro
embudo de decantación cuidando de que no pase la fase acuosa ni la emulsión
formada. Repita nuevamente el ensayo agregando sobre la fase acuosa del primer
embudo més o menos 15 ml de clorformo. Agitar, separar y llevar la fase orgánica
para que incremente el solvente de segundo embudo. Repetir por tercera la extracción
con 10 ml de cloroformo. Juntar los extractos de cloroformo en un embudo de pera

Lavar por tres veces la fase orgánica con el componente extraído, con solución
ligeramente ácida de ácido clorhídríco (0.001 M) con porciones de 40, 30 y 20 ml de
solución. Llevar la solución orgánica a una fiola de 50ml completando hasta el aforo
con cloroformo. Homogenice la solución.

Seleccionar en el menú básico de funciones el modo “CUANTITATIVO” y ajustar los

parámetros analíticos de medición a la longitud de onda de trabajo y del número de
patrones por medir empleando como blanco cloroformo. Medir los valores de
absorbancias que presentan cada solución problema.
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SOLUCIONES PATRONES DE ACIDO BENZOICO

No patrón Volumen a medir ml Volumen final ml Concentración en

ppm
stock

1 1.0 25.0 10.0

2 2.0 25.0 20.0

3 3.0 25.0 30.0

4 4.0 25.0 40.0

1.- Pesar 2.0000 g de la muestra de Ketchup

2.- Trasvasar la muestra a un vaso con 30 ml de NaCl acidificado con HCl a pH 3-4

3.- PRIMERA EXTRACCIÓN

Colocar la solución problema en un embudo de pera de 125 ml y agregar 20 ml de
cloroformo en una primera extracción. agitar fuertemente y luego dejar en reposo para
que se separen la fase acuosa y clorofórmica (color naranja).
Decantar la solución cloroformica y despositar en otro embudo de separación.

4.- SEGUNDA EXTRACCIÓN

Realizar una segunda extracción con 15 ml de cloroformo y ejecutar las mismas
operaciones. decantar al embudo la solución de la fase orgánica, juntándola con la
primera extracción

5.- TERCERA EXTRACCIÓN

Realizar una tercera extracción con 10 ml de cloroformo. Agitar y dejar en reposo,
luego decantar la fase orgánica

6.- Juntar la primera, segunda, y tercera extracción en el embudo de separación, para

lavarlas con HCl 0.001 M

6.- PRIMER LAVADO

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El embudo de separación que contiene las tres extracciones cloroformicas lavarlas

con HCl 0.001 m con volúmenes de 40 ml. agitar fuertemente y dejar en reposo para
separación de las fases.

7.- SEGUNDO LAVADO

la solución orgánica depositarla en un segundo embudo, añadirle 30 ml de HCl 0.001
m, agitar, dejar en reposo para separación de fases y separar.

8.- TERCER LAVADO

Repetir la operación de lavado con 20 ml de la solución lavadora.

9.- Despues del lavado de la fase orgánica contenida en el embudo separarla y

recibirla en una fiola de 50 ml (libre de agua), diluirla y enrasar con cloroformo.

10.- MEDICIÓN DE LAS MUESTRAS

Se mide la muestra clorofórmica a la longitud de onda de trabajo de 242 nm,
empleando como blanco cloroformo.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La espectrofotometría UV es un método comúnmente utilizado para la determinación

cuantitativa de compuestos, incluyendo el ácido benzoico. Aquí está la discusión de un
posible análisis espectrofotométrico del ácido benzoico:

En la espectrofotometría UV-, se mide la absorbancia de una muestra en función de la

longitud de onda de la luz. El ácido benzoico tiene una absorbancia máxima en el rango de
longitud de onda de aproximadamente 230 a 240 nm. Por lo tanto, se puede utilizar una
longitud de onda dentro de este rango para realizar la determinación del ácido benzoico.

Para realizar el análisis, se preparan soluciones estándar de concentraciones conocidas de

ácido benzoico. Estas soluciones se miden en un espectrofotómetro UV a la longitud de onda
seleccionada. Se registra la absorbancia de cada solución estándar y se construye una curva
de calibración trazando la absorbancia en el eje vertical y la concentración en el eje horizontal.

Una vez que se ha construido la curva de calibración, se mide la absorbancia de la muestra

desconocida a la misma longitud de onda y se utiliza la curva de calibración para determinar
su concentración de ácido benzoico. Esto se logra trazando una línea desde la absorbancia
medida hasta la curva de calibración y luego hacia abajo hasta el eje horizontal para obtener
la concentración correspondiente.

Es importante comparar la concentración obtenida para la muestra desconocida con las

concentraciones de las soluciones estándar y evaluar la precisión y la exactitud del método.
La exactitud se evalúa comparando el valor obtenido con el valor real o esperado del ácido
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benzoico en la muestra. La precisión se evalúa mediante la repetibilidad de las mediciones y

la variabilidad de los resultados.

Además, es importante tener en cuenta las limitaciones y consideraciones del método, como
la selectividad de la longitud de onda utilizada, la posible interferencia de otros compuestos
en la muestra y la linealidad de la respuesta en el rango de concentraciones analizadas.

CONCLUSIONES

En resumen, la espectrofotometría UV es un método adecuado y ampliamente utilizado para

la determinación cuantitativa del ácido benzoico, proporcionando resultados confiables
cuando se realiza correctamente y se tienen en cuenta las consideraciones apropiadas.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

SIMAL, J., & LóPEZ, J. (1983). APLICACION DE LA SEGUNDA DERIVADA DEL ESPECTRO PARA
LA DETERMINACION DE ACIDO BENZOICO EN ALIMENTOS.

Garza, A. D. J., Naccha, L. R., Heyer, L., Waksman, N., & Cavazos, N. C. (2007). Validación de un
método para la determinación de ácido benzóico en productos lácteos. Revista Salud Pública y
Nutrición, 8(3), 1-12.

.Cuestionario

1.- Indicar las limitaciones que presenta el agua como disolvente en la región uv

El agua es un disolvente ampliamente utilizado en la espectrofotometría UV debido a su

disponibilidad, estabilidad y transparencia en la región UV. Sin embargo, también presenta
algunas limitaciones en esta región del espectro electromagnético

A pesar de estas limitaciones, el agua sigue siendo ampliamente utilizada como disolvente
en la espectrofotometría UV debido a su disponibilidad y compatibilidad con muchos
compuestos. Sin embargo, es importante considerar las limitaciones y, cuando sea necesario,
realizar ajustes o utilizar disolventes alternativos para superar los desafíos específicos de
cada análisis.

2.- Porqué el ácido benzoico absorbe radiación UV

El ácido benzoico absorbe radiación UV debido a su estructura química. El ácido benzoico

contiene un anillo bencénico conjugado con un grupo carboxilo (-COOH) en posición orto (2)
con respecto al anillo. Esta estructura conjugada le confiere propiedades de absorción en la
región del espectro UV.

3.- Señale razones porque se utiliza disolventes orgánicos en estos métodos

Los compuestos orgánicos que contienen enlaces conjugados, como el anillo bencénico,
pueden absorber radiación en la región UV-visible debido a las transiciones electrónicas. En
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el caso del ácido benzoico, la absorción ocurre principalmente en la región de longitud de

onda ultravioleta cercana (UV-C), que corresponde a longitudes de onda entre
aproximadamente 200 y 280 nm.

4.- Porque razones se emplean celdas de material de cuarzo en la espectroscopia UV

Las celdas de material de cuarzo se emplean comúnmente en la espectroscopia UV por varias

razones:

 Transparencia UV: El cuarzo es un material transparente en el rango de longitud de

onda UV, lo que permite que la radiación UV pase a través de él sin una absorción
significativa. Esto es importante para garantizar mediciones precisas y confiables en
la región UV del espectro electromagnético.

 Baja autofluorescencia: El cuarzo tiene una baja autofluorescencia en comparación

con otros materiales, como el vidrio común. La autofluorescencia puede afectar las
mediciones de baja intensidad y reducir la sensibilidad y la precisión de los resultados.
El uso de celdas de cuarzo minimiza esta interferencia y mejora la detección de
señales débiles.

 Alta resistencia química: El cuarzo es un material resistente a muchos productos

químicos, lo que lo hace adecuado para su uso en una amplia gama de aplicaciones
espectroscópicas. Puede soportar solventes orgánicos, ácidos y bases fuertes sin
deteriorarse o afectar la calidad de las mediciones.

 Estabilidad térmica: El cuarzo exhibe una alta estabilidad térmica y puede soportar
temperaturas extremas sin deformarse o alterar sus propiedades ópticas. Esto es
particularmente importante para aplicaciones que requieren calentamiento o
enfriamiento de las muestras sin afectar la integridad de la celda.

 Durabilidad: Las celdas de cuarzo son duraderas y tienen una vida útil prolongada.
Son menos propensas a rayarse o dañarse durante el manejo y el uso repetido, lo que
garantiza mediciones confiables y consistentes a lo largo del tiempo.

5.- Como prepara la solución stock de 250 ppm de ácido benzoico a partir del reactivo
de fábrica si presenta una pureza del 99%

Para preparar una solución stock de 250 ppm (partes por millón) de ácido benzoico a partir
del reactivo de fábrica con una pureza del 99%, se pueden seguir los siguientes pasos:

Determinar la masa de ácido benzoico necesario: La concentración de 250 ppm significa que
hay 250 partes de ácido benzoico por cada millón de partes de solución. Si asumimos que
trabajamos con 1 litro de solución, esto significa que necesitamos 250 mg (0.25 g) de ácido
benzoico en la solución.

Calcular la cantidad de reactivo de fábrica necesaria: Debido a que el reactivo de fábrica tiene
una pureza del 99%, podemos usar la siguiente fórmula para calcular la cantidad necesaria
de reactivo de fábrica:

Cantidad de reactivo de fábrica = Cantidad de ácido benzoico necesario / Pureza del reactivo
de fábrica
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En este caso, la cantidad de ácido benzoico necesario es 0.25 g y la pureza del reactivo de
fábrica es 99%. Sustituyendo estos valores en la fórmula, obtenemos:

Cantidad de reactivo de fábrica = 0.25 g / 0.99 ≈ 0.2535 g

Por lo tanto, se necesitan aproximadamente 0.2535 g de reactivo de fábrica.
Disolver el reactivo de fábrica en un volumen conocido de disolvente: Para preparar la
solución stock, disuelva los 0.2535 g de reactivo de fábrica en un volumen conocido de
disolvente apropiado, como agua destilada o algún otro disolvente adecuado.

Ajustar el volumen final de la solución: Asegúrese de que el volumen final de la solución sea
el deseado. Si está trabajando con 1 litro de solución, asegúrese de ajustar el volumen total
a 1 litro.

Mezclar y homogenizar la solución: Agite o mezcle adecuadamente la solución para asegurar

una distribución homogénea del ácido benzoico en el disolvente

6.- Se trataron 2 ml de una muestra de orina que contiene fosfatos, despues de la

disolución se diluyó a 100 ml, la medida fotométrica de una alícuota de 25 ml dio una
absorbancia de 0.428. Calcular la concentración de fosfatos como fosforo en mg / ml
si la absortividad molar es de 750 (la medición se efectuó en celda de 1 cm)

En este caso, conocemos la absorbancia (A = 0.428), la absortividad molar (ε = 750),

y la longitud de trayectoria (l = 1 cm). Queremos calcular la concentración de fosfatos
como fósforo en mg/ml (c).

Convertir la absorbancia a absorbancia molar: Como la absorbancia se midió en una

celda de 1 cm de longitud de trayectoria, la absorbancia molar (A') es igual a la
absorbancia medida (A). No es necesario realizar ninguna conversión.

Reorganizar la ecuación de la Ley de Lambert-Beer para despejar la concentración

(c): A' = ε * l * c c = A' / (ε * l)

Calcular la concentración de fosfatos como fósforo en mg/ml: c = 0.428 / (750 * 1) =

0.0005707 M

Para convertir la concentración molar a mg/ml, debemos tener en cuenta que 1 Molar
(M) es igual a la masa molecular de la sustancia en gramos dividida por el volumen
en litros. En el caso del fósforo, su masa atómica es de 30.97 g/mol.

c (en mg/ml) = 0.0005707 M * (30.97 g/mol) * (1 ml / 1000 mg) = 0.0177 mg/ml

Por lo tanto, la concentración de fosfatos como fósforo en la muestra de orina es de

aproximadamente 0.0177 mg/ml.
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P á g i n a 1 | 10