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Laboratorio de Biocatálisis: Catalasa

PRÁCTICA DE LABORATORIO # 5: CATALASA-

LA ENZIMA MÁS RÁPIDA DEL MUNDO.
BIOCATÁLISIS 19-01
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA
FACULTAD DE INGENIERÍA

OBJETIVOS:

Hacer seguimiento a la actividad catalítica de las enzimas mediante la detección de los cambios
de presión generados por los productos gaseosos.

Identificar el efecto que tienen los compuestos inhibitorios y la desnaturalización de enzimas en

la cinética enzimática de los bioprocesos.

Acercar a los estudiantes a aplicaciones prácticas de las enzimas como es el uso de biosensores,
complejos enzimáticos, y series de enzimas.

1. Introducción.

La catalasa (EC 1.11.1.6), es una enzima encontrada en muchos tejidos de animales (e.g. higado) y
plantas (e.g. semillas), a nivel celular se encuentra en los peroxisomas y en microcuerpos. La
presencia de la catalasa en los seres vivos es importante debido a que descompone el peróxido de
hidrógeno, el cual es un subproducto de muchos procesos de oxidación celular. Este compuesto,
presenta alto grado de toxicidad y debe ser eliminado inmediatamente del organismo, por su
elevada velocidad, la catalasa es la enzima más rápida en el mundo descubierta hasta ahora.

A nivel industrial, la catalasa es una enzima ampliamente usada en la eliminación rápida y selectiva
del peróxido de hidrógeno, sin generar ninguna otra reacción lateral. El peróxido de hidrógeno
puede ser empleado en la industria alimenticia, por ejemplo en el procesamiento de leche y huevos
como un método de esterilización para la eliminación de bacterias potencialmente peligrosas.
Requiriéndose luego emplear catalasa para eliminar el peróxido residual de estos alimentos, y así
puedan ser aptos para el consumo humano.

Adicionalmente, el peróxido de hidrógeno puede ser generado como producto de la acción de otro
conjunto de enzimas como las oxidasas, enzimas ampliamente usadas en biosensores. El consumo
de oxígeno y la producción de peróxido de hidrógeno permiten la determinación simple de la
actividad enzimática en un biosensor. Algunos ejemplos de los componentes detectados por las
oxidasas y la respectiva enzima que los detecta son: glucosa-glucosa oxidasa, etanol-alcohol

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oxidasa, fenol-fenol oxidasa y colesterol-colesterol oxidasa. Uno de los principales problemas del
uso de oxidasas como biosensores es la producción equimolar de peróxido de hidrógeno como
subproducto, lo cual puede inactivar estas enzimas o alterar el sustrato correspondiente; de este
modo, la eliminación de este compuesto se debe llevar a cabo empleando catalasas. El uso
combinado de oxidasas y catalasas es una solución ampliamente usada en el desarrollo de
biosensores.

2. Consultas preliminares a la práctica.

2.1. Elabore un diagrama de flujo esquemático donde se describa el procedimiento a realizar

durante el desarrollo de la práctica. Señale los puntos críticos que considere en las diferentes etapas
del proceso.

2.2. Estudie la presente guía antes del desarrollo de la práctica.

2.3. Repase el material de la clase teórica relacionado con la determinación de actividad enzimática,
tipos de inhibición, desnaturalización de proteínas y la formación de complejos enzimáticos.

2.4. Revise previo a la práctica de laboratorio la ficha de seguridad de los siguientes materiales: (1)
Peróxido de hidrogeno (1.5%, corrosivo), (2) Catalase 929L (C929L, Biocatalysts UK), (3) Glucose
Oxidase 789L (G789L, Biocatalysts UK), (4) Fluoruro de Sodio (NaF), ¡cuidado tóxico!

3. Fundamento teórico.

La enzima catalasa lleva a cabo la descomposición de peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno

(Figura 1), con la consecuente liberación de gas (O2) generando un incremento en la presión, lo
cual permite el seguimiento manométrico de la reacción.
𝐶𝑎𝑡𝑎𝑙𝑎𝑠𝑎
(𝑝𝑒𝑟𝑜𝑥𝑖𝑠𝑜𝑚𝑎𝑠)
2 H2O2 → 2 H2O + O2(g)
Figura 1. Reacción global de la conversión de peróxido de hidrógeno por acción de la catalasa.

Tanto la temperatura como el pH al cual las enzimas llevan a cabo su actividad, son
extremadamente importantes. Los organismos tienen una temperatura óptima a la cual sobreviven, y
sus enzimas trabajan mejor dentro de este rango de temperatura. Si la temperatura del ambiente es
demasiado alta, las enzimas podrían desnaturalizarse irreversiblemente, de forma que perderían la
estructura necesaria para llevar a cabo su función apropiadamente.

Otros conceptos relevantes para el desarrollo de la práctica:

La cinética de una reacción enzimática puede ser estudiada de muchas formas, por ejemplo:

• Midiendo la velocidad de desaparición de alguno de los sustratos (en este caso H2O2).

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• Midiendo la velocidad de aparición de alguno de los productos (en este caso O2 que es liberado
como gas, aumentando la presión a medida que aparece).

Durante esta práctica de laboratorio se evaluará la actividad enzimática de la catalasa, variando la

concentración de enzima empleada en el ensayo, la concentración de un inhibidor, en este caso
Fluoruro de sodio (NaF), y la temperatura de reacción. Además, se realizará un biosensor
manométrico de glucosa, empleando las enzimas glucosa oxidasa en compañía de la catalasa,
usando como sustrato la glucosa y variando la presencia de peróxido de hidrógeno. Cabe resaltar
que cada da una de estas variaciones, se evaluará de forma separada en ensayos diferentes; para ello
se realizarán ensayos directos mediante la cuantificación del aumento en la presión a causa de la
producción de oxígeno, utilizando un manómetro electrónico como medio de cuantificación.

Al comienzo de la reacción, la presión es la misma que la atmosférica debido a la ausencia de

producto. Después de unos pocos segundos, el oxígeno se comienza a acumular en el manómetro a
una velocidad aproximadamente constante, durante este tiempo la presión aumenta relativamente de
forma lineal hasta que se estabiliza. El cambio de la concentración del producto respecto al tiempo
al principio de la reacción es la velocidad inicial, es decir, la pendiente del avance de la reacción;
para determinar su valor se debe tener en cuenta un fragmento lineal al inicio, y así la concentración
de sustrato se considere constante en ese periodo como se observa en la Figura 2. A medida que el
peróxido es consumido, disminuye su concentración en solución ocasionando que luego de un
tiempo, el oxígeno se produzca a una velocidad menor. En el momento que se consume el peróxido
disponible, el oxígeno deja de formarse y la presión comienza a ser relativamente constante.

Figura 2. Curva típica de progreso de una reacción enzimática.

4. Seguridad durante la práctica (Caicedo)

4.1. Equipos de protección personal.

Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:

✓ Bata de laboratorio
✓ Guantes de nitrilo
✓ Gafas de seguridad

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Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su
intercambio con los demás compañeros de laboratorio.

4.2. Manejo de residuos químicos y biológicos

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los
residuos generados en las prácticas del laboratorio en forma adecuada. Por ello el estudiante debe:

1. Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los
cuales están debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar.

2. Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no

controladas y potencialmente peligrosas.

3. No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el desarrollo de la
práctica.

NOTA: Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio, quien le
indicará la forma correcta de hacerlo.

5. Materiales y métodos

5.1 Materiales y reactivos

Cada grupo contará con los siguientes materiales para la elaboración de la práctica:

Tabla 1. Materiales y equipos requeridos para el desarrollo de la práctica.

Materiales y equipos
Reactivos
(unidades)
Catalase 929L (C929L, Biocatalysts UK), Tomar
Ankom (RF) gas module (8) una alícuota de 1ml de enzima pura antes de la
práctica.
Glucosa oxidasa 789L (G789L, Biocatalysts UK).
Frasco Schott o Kimax de
Tomar una alícuota de 1ml de enzima pura antes de
50ml (8)
la práctica.
Cubeta para Baño de hielo. (1) Peróxido de hidrogeno (1.5% v/v, 30ml) (4)
Solución de glucosa al 10% (en buffer acetato de
Tubos Eppendorf (5)
sodio 0.1M, pH 5.1, 30ml) (1)
Solución de glucosa al 10% y peróxido al 1.5% (en
Cronometro (1)
buffer acetato de sodio 0.1M, pH 5.1, 30ml) (1)
Cilindro volumétrico (50ml) Solución de peróxido de hidrogeno 1.5% y Fluoruro
Mezclador de vidrio (2) de sodio al 2%. (1)
Solución de peróxido de hidrogeno 1.5% y Fluoruro
Micropipeta 100-1000µl (1)
de sodio al 5%. (1)
Micropipeta 10-100µl (1) Reactivo DNS (2 ml, ácido 3,5-dinitrosalicilico)
Puntas para micropipeta.
Tubo de ensayo de 8 ml (3)

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5.2 Efecto de la concentración de enzima

La actividad enzimática de la catalasa se medirá con el seguimiento a los cambios de presión en el

manómetro, generados debido a la liberación de oxígeno. Para esto, se empleará un manómetro
electrónico (Ankom gas module), y se llevarán a cabo 3 experimentos en forma separada donde se
varía la concentración inicial de enzima.

1. En 3 Frascos Schott de 50 mL, adicionar 30 mL de una solución de H2O2 al 1.5% v/v a cada
uno, rotular los frascos como concentración baja, media y alta. Se deben mantener alejados de
la luz todos los frascos empleados durante la práctica.
2. Tener listo el manómetro electrónico para comenzar a medir la presión. Al frasco rotulado
como concentración baja, añada 5µL de catalasa y luego mezcle durante 5 s una sola vez.
Ajuste el frasco schott con el manómetro y comience a medir el cambio de la presión con el
tiempo durante 15 min. Asegúrese que el manómetro quede bien ajustado y guarde los datos
generados para su posterior análisis.
3. Al frasco rotulado como concentración media añada 20µL de catalasa, mezcle, y comience a
medir el cambio de la presión en el manómetro con el tiempo durante 15 min, o hasta que la
presión sea constante.
4. Al frasco rotulado como concentración alta añada 100µL de catalasa, mezcle, y comience a
medir el cambio de la presión en el manómetro con el tiempo durante 15 min, o hasta que la
presión sea constante.

5.3. Efecto de la concentración de inhibidor

El fluoruro de sodio (NaF) es un reconocido inhibidor generalizado para muchas enzimas, afectando
las funciones básicas de muchas de ellas. En particular, los compuestos inhibitorios de la actividad
enzimática de la catalasa son muy diversos, sin embargo, muchos de ellos actúan sobre los grupos
hemo (hiero) de la enzima los cuales son fundamentales para llevar a cabo la actividad catalítica. El
fluoruro, es uno de estos compuestos que se conjuga con los grupos hemo de la catalasa, afectando
su interacción con las especies oxigenadas. En esta práctica se va a determinar el efecto inhibitorio
de dos concentraciones diferentes de NaF sobre la catalasa, para esto:

1. En un Frascos Schott de 50 mL, adicionar 30 mL de una solución de H2O2 al 1.5% v/v y NaF al
2%, rotular el frasco como concentración baja de inhibidor.
2. Tener listo el manómetro electrónico para comenzar a medir la presión. Al frasco rotulado
como concentración baja de inhibidor añada 20µL de catalasa y luego mezcle durante 5s una
sola vez, mida el cambio de la presión en el manómetro con el tiempo durante 15 min. y guarde
los datos para su posterior análisis.
3. Separadamente, en un Frascos Schott de 50 mL adicionar 30 mL de una solución de H2O2 al
1.5% v/v y NaF al 5%, rotular el frasco como concentración alta de inhibidor.
4. Añada 20µL de catalasa, mezcle, y comience a medir el cambio de la presión con el tiempo
durante 15 min o hasta que la presión sea constante.

5.4. Efecto de desnaturalización térmica

Las enzimas, como la gran mayoría de proteínas, trabajan adecuadamente en un rango relativamente
pequeño de temperatura. Cuando estas temperaturas son excedidas, las enzimas pueden sufrir
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alteraciones que en algunas ocasiones terminan siendo irreparables, perjudicando la estructura y

eficacia de las enzimas.

1. Adicione 100 µL de catalasa en un tubo Eppendorf de 2 mL. Usando pinzas, sostenga el tubo
de ensayo sobre un Beaker que contiene agua a 90°C. Mantenga el tubo de ensayo en contacto
con el agua durante 5 min.
2. Separadamente, en un Frasco Schott de 50 mL adicionar 30 mL de una solución de H2O2 al
1.5% v/v .
3. Tener listo el manómetro electrónico para comenzar a medir la presión. Añadir al frasco 20µL
de la catalasa desnaturalizada térmicamente, mezcle, y comience a medir el cambio de la
presión con el tiempo durante 15 min. Guarde los datos para su posterior análisis.

5.5. Biosensor manométrico de Glucosa

La glucosa oxidasa es una enzima que cataliza la oxidación de glucosa con la subsecuente
formación de peróxido de hidrógeno, en compañía de la enzima catalasa este peróxido es luego
descompuesto, lo que conlleva a la liberación de oxígeno gaseoso. En esta sección de la práctica se
llevará a cabo la biocatálisis de glucosa como sustrato, empleando un complejo de dos enzimas
trabajando en serie, la glucosa oxidasa (GOx) y la catalasa (POD), con este fin:

1. En 2 Frascos Schott de 50 mL, adicionar 30 mL de una solución de glucosa al 10% (preparada

en 0.1M buffer acetato de sodio, pH 5.1). Adicionalmente, una de estas soluciones contendrá
una concentración final de peróxido al 1.5%. Rotular los tubos teniendo en cuenta que uno
contendrá peróxido y el otro no, es decir, rotularlos: con peróxido y sin peróxido.
2. Al frasco rotulado sin peróxido, añada 100 µL del complejo enzimático GOx-POD y 20µL de
catalasa; mezcle durante 5s una sola vez y comience a medir el cambio de la presión con el
tiempo durante 15 min, o hasta que la presión sea constante.
3. Al frasco rotulado con peróxido, añada 100 µL del complejo enzimático GOx-POD y 20µL de
catalasa, mezcle y comience a medir el cambio de la presión con el tiempo durante 15 min, o
hasta que la presión sea constante.
4. Después de finalizada la reacción, medir la concentración final de glucosa usando el método del
DNS. Para este fin tome tres tubos de ensayos con tapa rosca, al primero agregue 500 μL de
agua destilada (este será el blanco), al segundo adicione 500 μL de la muestra sin peróxido y
al tercero agregue 500 μL de la muestra con peroxido. Para cada una de las muestras
mencionadas anteriormente, se debe adicionar 500 μL del reactivo DNS, luego tapar los tubos y
mezclar. Los tres tubos de ensayo se someten a una temperatura de 94°C por exactamente 5
min, después se enfrían rápidamente (segundos) en un baño con hielo y se adicionan 3.5 mL de
agua destilada a cada tubo. Posteriormente, estas muestras se agitan rápidamente, se calibra el
espectrofotómetro con el blanco a 540 nm, y finalmente se mide la absorbancia de las
muestras. Con base en esta información, y la curva de calibración de DNS obtenida en la
práctica 1, complete la Tabla 2.

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6. Resultados y discusión

6.1. Describa la unidad experimental, e identifique las variables independientes (manipuladas), los
niveles, las variables dependientes (Respuesta), los factores controlados, factores no
controlados.

6.2. Elabore una gráfica de concentración de peróxido remanente en solución vs tiempo para los tres
casos estudiados en el ítem 5.2, presente por lo menos los cálculos que tuvo que hacer para uno
de los casos. ¿Qué efecto tiene el cambio de la concentración de enzima en la velocidad de
descomposición del peróxido?
6.3. ¿Qué crees que pasaría con la velocidad de reacción si el dosaje de 100µl de enzima es
aumentado a 300µl de enzima? Prediga cuál sería la velocidad, y elabore una gráfica del cambio
en la presión en el frasco hipotético con el tiempo.
6.4. Estime el tiempo requerido para consumir la mitad de las moles de peróxido disponible para
cada una de las concentraciones de enzima empleadas en el ítem 5.2
6.5. ¿Qué factores pueden influenciar la actividad enzimática de la catalasa?, lleve a cabo el análisis
teniendo en cuenta los resultados experimentales.
6.6. ¿Qué efecto tiene la adición del inhibidor al peróxido antes de añadir la catalasa? ¿Qué
explicación puedes dar de los resultados? Grafique la Velocidad inicial de la reacción (Vo) vs la
concentración de inhibidor [I] con concentración de sustrato constante.
6.7. ¿Qué efecto crees que tiene el calentar la catalasa en agua hirviendo en sus propiedades
catalíticas? ¿A qué efectos estructurales se debe el cambio en la actividad enzimática?
6.8. Realice una gráfica de concentración de oxígeno vs tiempo para los dos experimentos
planteados en la actividad 5.5. ¿Qué efecto tiene la presencia de peróxido en el segundo
experimento en la actividad enzimática? ¿Qué posible explicación se le puede dar a este hecho
desde el punto de vista del consumo de glucosa? Analice los resultados de la concentración
final de glucosa en ambos experimentos.

7. Bibliografía

Bisswanger H. (2012). Practical Enzymology (360 p). Second edition. Wiley Blackwell.

Caicedo N. Prácticas de laboratorio: Biotransformaciones II. Universidad ICESI

www.sigmaaldrich.com/us-export.html, último acceso en junio 7 del 2017.

A. Illanes, (Ed.). Enzyme Biocatalysis: Principles and Applications. Springer-Verlag New York.
2008.

Harisha, S. Biotechnology procedures and experiments handbook. Infinity science press LLC. 2007.

Elaborado por: Dr. Carlos Andrés Alvarez Vasco

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ALUMNO: _________________________________________ CÓDIGO: ___________________

ALUMNO: _________________________________________ CÓDIGO: ___________________

DATOS DEL LABORATORIO

¿Qué datos necesita tomar para poder calcular las moles de H2O2 consumidas? Presente los
datos y un ejemplo de cálculo respectivo. Recuerde la ley de los gases ideales.

Volumen total de los frascos (ml):

Tabla 2. Biosensor de glucosa.

Glucosa Final
[H2O2]
A540nm (mg/ml)
0%
1.5%

Los puntos experimentales serán entregados digitalmente.