UNIVERSIDAD NACIONAL

DE SAN AGUSTÍN

FACULTAD: INGENIERÍA DE PROCESOS

ESCUELA: INGENIERÍA QUÍMICA

Fragmentación de ácidos
nucleicos. Endonucleasas de
restricción
Ingeniería Genética (Capitulo 5)

DOCENTE:

ALUMNA: Quispe Chacón Estefany

AREQUIPA-PERU
2017
El término análisis proviene del griego analio significa "desatar". Todo procedimiento
de análisis implica "separar las partes de un todo hasta llegar a conocer sus principios
o elementos", es decir, supone romper, fragmentar. El caso de las moléculas de ácidos
nucleicos es un buen ejemplo: su cadena, sencilla o doble, pero siempre larga o muy
larga, tiene que ser fragmentada para convertirla en elementos estructurales más
sencillos que puedan ser estudiados por los métodos actuales.

Respecto a estos últimos, ya estudiados en el capítulo 3, conviene recordar que su

umbral •de trabajo se mueve entre el nivel del nucleótido o par de bases
(electroforesis en geles de poliacrilamida para la "lectura" de la secuencia de una
molécula), hasta el de las decenas o centenas de kilobases (geles de agarosa
desarrollados convencionalmente o en campo pulsado); rango alejado en varios órdenes
de magnitud de las dimensiones de muchas moléculas (el genoma de las bacterias tiene
entre 2 y 3 millones de pb; el de los insectos, alrededor de 109 pb; y el de algunos
anfibios llega casi a 10" pb). Es evidente, por tanto, que para llegar a conocer la
estructura de moléculas genómicas, se requiere su fragmentación. Incluso las piezas
que resultan de un proceso primario de rotura generalmente han de ser fragmentadas
una o varias veces más hasta alcanzar tamaños que puedan ser investigados de manera
total y completa (hasta llegar a determinar su secuencia de nucleótidos). Todo el
camino analítico es una continuación de etapas de rotura.

Ahora bien, es conveniente que esa fragmentación se realice por sitios específicos.
Una rotura por sitios al azar produce piezas de tamaño muy variable, cuya separación
y purificación, etapas imprescindibles para su análisis, son muy complicadas. Además,
la reordenación dé los datos parciales obtenidos a partir de esos fragmentos de
rotura es notablemente difícil. Pero el corte de la molécula nucleica por sitios
específicos facilita mucho el proceso ya que permite trabajar con fragmentos
homogéneos y definidos. Para este tipo de rotura se cuenta con unas herramientas
muy particulares: las endonucleasas de restricción, cuya aplicación ai análisis y
manipulación del DNA es extraordinariamente importante. Son actividades
enzimáticas capaces de romper una molécula de dsDNA por sitios específicos. Y esta
especificidad radica, no en el reconocimiento de una única base nitrogenada (lo que
produciría piezas de tamaño promedio de 4 nucieótidos), sino en el de secuencias de
varios pares de bases, lo que permite conseguir fragmentos mucho mayores; sobre su
uso en el análisis de DNA se pueden construir estrategias notablemente fructíferas.
5.1. Fragmentación de ácidos nucleicos. Especificidad y objetivos

En general, las moléculas de ácidos nucleicos son grandes e incluso muy grandes, Jo
que las hace sumamente frágiles: el simple pipeteo de una disolución de DNA
cromosómico es suficiente para romper sus largas cadenas, como resultado de ¡as
fuerzas de cizalla que se producen durante el paso de la disolución por el
estrechamiento que la pipeta presenta en la boca. Además de esta posibilidad de
rotura física, las moléculas de ácidos nucleicos son sensibles a condiciones químicas
más o menos extremas y, sobre todo, a la presencia de actividades enzimáticas
degradativas, denominadas genéricamente nucleasas. Los métodos de aislamiento y
manejo de ácidos nucleicos incorporan una serie de precauciones para evitar la rotura
de sus moléculas.

Sin embargo, la fragmentación de las moléculas de ácidos nucleicos, aunque temida e

indeseable en los procesos de aislamiento, resulta conveniente e incluso esencial en las
vías analíticas. La gran diferencia entre los distintos métodos de rotura de estas
moléculas la marca la especificidad en el proceso.- una rotura inespecífica producirá
una mezcla muy heterogénea de fragmentos, cada uno con distinto tamaño y extremos
diferentes; no existirán fragmentos mayoritarios en la mezcla, no .hay posibilidad de
analizar su composición ni ce reconocer a los productos de la rotura. Aun así, este tipo
de fragmentación tiene su interés en ocasiones. .

Frente a esto, la rotura de una molécula por sitios específicos lleva a una mezcla de
composición más homogénea y definida. Aunque puede resultar un gran número de
fragmentos, todos ellos aparecen en cantidades equimoleculares, son de tamaño
distinto pero con extremos definidos por la especificidad de la reacción. Esto hace
posible su análisis y, a partir de él, la localización de los sitios específicos de rotura
dentro de un esquema que represente al material original,, lo que se denomina un mapa
físico.
Los motivos por los que se puede perseguir en un determinado momento la degradación
de un DNA o de un RNA son muy diferentes. Entre ellos:

- La eliminación de un contaminante; los contaminantes naturales de un ácido nucleico

son los otros tipos de macromoléculas. La semejanza de tamaños hace más difícil la
separación, de forma que una de las etapas cruciales del método preparativo es la
separación de los componentes macromoleculares. En muchos casos resulta más rápido
y cómodo eliminar estos componentes mediante degradación química o enzimática.

-La producción de fragmentos inespecíficos, esto para facilitar su manejo, facilitar la

cinética de su desnaturalización y clonar una mezcla de fragmentos.

-La producción de fragmentos específicos, ya que es la base del análisis del tamaño de
fragmentos específicos, la construcción de mapas físicos, la determinación de la
secuencia de nucleótidos de una molécula nucleica o su caracterización definida a nivel
primario.

5.2. Métodos de rotura de ácidos nucleicos

Existen variedades de procedimientos para conseguir la fragmentación de acidos

nucleicos .Muchos de ellos explotan , de manera controlada, las causas de rotura que
tratan de evitarse en los caminos preparativos .Pueden agruparse:

a) Los métodos físicos están basados en:

-Las fuerzas de cizalla que se originan cuando se obliga a la disolución que contiene a
la (inacro)molécula nucleica a pasar a través ele una sección mucho menor; para ello se
utilizan prensas, agujas unidas a jeringuillas hipodérmicas o incluso pipetas normales.
Fuerzas análogas producidas con una batidora o agitador de aspas consiguen una
rotura semejante (quizá algo más controlada) de las largas moléculas de DNA.

•Se produce una mezcla heterogénea de fragmentos, cuyos tamaños dependen de las
fuerzas provocadas, que a su vez son función de la presión aplicada, la reducción de la
sección, la velocidad de las aspas, el tiempo de agitación, etc.

- Las ondas de presión producidas por los ultrasonidos. Los sonicadores son los
equipos que se utilizan para este propósito, y modulan tanto la frecuencia como la
intensidad de la onda; permiten por lo tanto trabajar en condiciones más controladas y
conseguir resultados bastante más reproducibles.

• Los fragmentos producidos presentan tamaños que se aproximan más a una

distribución gaussiana: la mezcla conseguida es también, por supuesto, heterogénea. El
tamaño medio depende de las condiciones y del tiempo del tratamiento.
b) Los métodos químicos,

dirigidos a la rotura, en este caso por hidrólisis, de enlaces éster fosfórico de la

cadena polinucleotídica. Esta hidrólisis puede ser:

- Hidrólisis acida, donde el catalizador de la reacción son los protones de un

ácido fuerte (clorhídrico, por ejemplo). El mecanismo de la reacción comienza por la
rotura de los enlaces que unen los restos de azúcar (ribosa o desoxirribosa) y las
bases nitrogenadas púricas (A y G), provocando la despurinización de la molécula,que
queda así inestabilizada. La continuación del tratamiento ácido conduce a la rotura ele
los enlaces fosfodiéster de la cadena por los puntos que precisamente perdieron la
base nitrogenada. Este proceso se sigue en algunos casos para facilitar la
transferencia de grandes moléculas de DNA o RNA desde geles de agarosa a soportes
sólidos es también la base de alguna de las reacciones utilizadas en el método de
secuenciación de DNA por rotura química(método de Maxam y Gilbert).

• Resulta una mezcla heterogénea de mono-, di- y oligonucleótidos, en

concentraciones relativas que dependen de la intensidad de la reacción.

- Hidrólisis básica, catalizada por los iones OH" de una base fuerte (hidróxido
sódico, por ejemplo). Es importante señalar que la hidrólisis básica sólo actúa sobre la
cadena del RNA, ya que el mecanismo de esta reacción requiere un OH en 2' tan sólo
presente en la ribosa de las moléculas de RNA.
5.3. Sistemas de restricción-modificación bacterianos (sistemas R-M]

Las endonucleasas de restricción (endoR) son enzimas nucleoiíticas que catalizan la

hidrólisis de enlaces fosfodiéster internos en las dos hebras de una molécula de DNA
bica-tenario, mayoritariamente por sitios específicos {dianas o sitios de restricción), y
que en la naturaleza se encuentran formando parte de los sistemas de restricción-
modificación bac-terianos (abreviadamente, sistemas R-M).

Estos sistemas desempeñan en la célula bacteriana una función de protección genética,

dirigida a impedir el establecimiento en su interior de material genético exógeno que
pudie¬ra codificar productos capaces de alterar la vida celular. Algunos sistemas R-M
están codi¬ficados en genes cromosómicos, otros en plásmidos e incluso en
bacteriófagos (como en el fago Pl). Básicamente, el sistema incorpora dos actividades
enzimáticas: una metilasa (metiltransferasa, actividad M) y una endonucleasa
(actividad R), ambas con una misma especificidad de secuencia. El sitio o diana de
reconocimiento es una corta secuencia de pares de bases, constituido por lo tanto por
las dos hebras. Ambas actividades van a reco¬nocer la misma secuencia en su DNA
sustrato, luego actuará una u otra en función del esta¬do de metilación de la diana:

- Si no está metiiada, la endonucleasa, más potente, cataliza la rotura de las dos

hebras del DNA.

- Si está mediada en ambas hebras (normalmente en residuos de A o de C), la

nucie-asa no actúa; la metilación protege ai DNA haciendo que los sitios específicos
sean resistentes a su acción.

- Si está metiiada únicamente en una de las dos hebras {bemimetilada), es

igualmen¬te inmune a la rotura por parte de la nucleasa; entonces la metilasa
catalizará la mei-lación de la hebra no mediada.

. La metilación es una forma de señalizar el material genético de la bacteria y evitar

su rotura por el propio sistema de restricción. Cuando el DNA cromosómico es
replicado, las dianas de restricción de las moléculas hijas están metiladas sólo en la
hebra parental (dia¬nas hemimetiiadas); en ese estado se encuentran protegidas
contra la nucleasa. Cuando estos sitios son reconocidos por el sistema R-M, la nucleasa
no actúa, pero sí la metilasa que modifica la hebra aún no metiiada para producir una
diana ya metiiada en ambas hebras. En los casos de invasión por DNA exógeno, por
ejemplo tras la infección por un bacterió¬fago, el sistema R-M lo investigará y
reconocerá en él una o varias dianas específicas del sis¬tema, que normalmente no
estarán metiladas en ninguna de las dos hebras, entonces la acción de la nucleasa se
impone a la metilasa y el DNA del fago resultará degradado.

La presencia de un sistema R-M es muy normal entre bacterias; incluso no es raro que
una estirpe posea más de uno. Sin embargo, algunos bacteriófagos han desarrollado
meca¬nismos para evitar las defensas bacterianas, tales como metilasas con la misma
especifici¬dad que el hospedador, inhibidores de la endonucleasa celular

5.4, Endonucleasas de restricción tipo II: dianas o sitios de restricción

Entre todas las actividades de los diferentes sistemas R-M, las endonucleasas de
restricción del tipo II son de una extraordinaria utilidad. Han venido a resolver el
problema de la rotura del DNA por puntos específicos y han sido la clave del
extraordinario desarrollo experimentado por Jos métodos y técnicas moleculares de
aislamiento, análisis, manipulación, amplificación y expre¬sión de regiones génicas.
Puede decirse que constituyen uno de Jos pilares en que se asienta la ingeniería
Genética actual. Estas enzimas presentan dos ventajas fundamentales:

- Son de una gran especificidad: actúan sobre una diana concreta, lo que facilita
la interpretación de los resultados de la rotura de un DNA e incluso permite ci diseño
de experimentos para la preparación de fragmentos.

- Son estructuralmente sencillas: son monómeros o dímeros, lo que facilita su

aisla¬miento, conservación y manejo.

Existe más de un millar de endonucleasas tipo II caracterizadas, aunque en muchos

casos reconocen la misma diana; aun así hoy se conocen actividades capaces de
reconocer varios cientos de sitios de restricción diferentes. Muchas de ellas son
comerciales, y en los conge-ladores de los laboratorios donde se trabaja con DNA
existe una amplia colección de ellas. En todos los manuales de laboratorio actuales, así
como en los correspondientes catálogos de las firmas que las suministran, existe una
gran cantidad de información acerca de ellas y ele las condiciones de reacción que se
recomiendan para cada una. En el cuadro 5.1 se reco¬gen algunas como ejemplo.

5.4.1. Nomenclatura *

La nomenclatura de estas endonucleasas suele acogerse a unas normas; su nombre

incluye:

- Tres letras, que corresponden, la primera, a la inicial del género y las otras dos
a las iniciales de la especie bacteriana de donde se ha aislado. Por ejemplo: Bam, de
Baci¬llus amyloiiquefaciens; Kpn, de Klebsiella pneumoniae; Pst, de Providencia stuar-
tii; Sma, de Senada marcescens.

- Una cuarta letra, en algunos casos, que identifica la estirpe o el tipo celular
origen de la actividad. Por ejemplo: iícoR y EcoN, de Escheríchia coli; fíinb, Hinz, Hiná
y Hiuf, de Haemopbilus influenzac; HgiA, HgiC, HgiE y Hgtj, de Herpetosiphon
giganteas.
- Un número, en romanos, que indica el número de orden de su aislamiento a
partir de una cepa que posea varios sistemas R-M. Por ejemplo: Hael, Haell y fíaelll, de
Haemopbilus aegyptius; Pvul y Pintll, de Proteus vulgaris.

5.4.2. Dianas de restricción •

El sustrato de estas actividades es un dsDNA: catalizan la hidrólisis simultánea de las

dos hebras de un DNA bicatenario y no actúan sobre estructuras en monohebra.

Existen muchos ejemplos de enzimas aisladas de diferentes fuentes biológicas que

reconocen y rompen la misma secuencia diana; estas enzimas que comparten el sitio de
restricción se denominan isosquizómeros. Por ejemplo, Gal y Banlll reconocen la misma
diana AT'CGAT. En algunos casos, dos isosquizómeros reconocen Ja misma secuencia,
pero catalizan la rotura de enlaces situados en diferente posición; es el caso de Smal
y Xmal: ambas reconocen el sitio ...CCCGGG..., pero Smal rompe por puntos enfrenta-
dos, por el enlace central de la diana, mientras que Xmal rompe entre la primera y la
segunda C:

5.4.6. Actividad "estrella"

En ciertas condiciones alejadas de las óptimas (por ejemplo, en medios con pH alcalino,
con baja fuerza iónica o con disolventes orgánicos), algunas endonucleasas de restric-
ción pueden cortar un DNA por sitios algo distintos a sus dianas específicas; se dice
que presentan la llamada actividad estrella, que resulta de una disminución de su
especificidad. En el caso de EcdKL, esta actividad llamada EcdRI*, Je lleva a
reconocer y cortar un DNA por Ja secuencia N'AATTN; la diana se limita a los cuatro
pares de bases centrales de su diana normal (G'AATTC). Esta reducción de la
especificidad en condiciones subóptimas es bastante frecuente y su aparición debe
tenerse siempre en cuenta.

5.5. Digestión con enzimas de restricciónr restricción in vitro de DNA

' Las endonucleasas de restricción se han hecho imprescindibles para trabajar con
DNA. Muchas de ellas ya no se aislan de su fuente bacteriana original, sino que se
producen a partir de la expresión de sus genes clonados en E. coli. La gran mayoría son
comerciales; existen numerosas compañías que compiten por ofrecer un catálogo muy
amplio de actividades. Suelen entregarse disueltas en un medio de conservación que
contiene gliceroí y se aconseja su almacenamiento a baja temperatura C-20'°C).' ■"

Para su empleo, se prepara una mezcla de incubación que incorpora (figura 5.1):

Una disolución tampón, para mantener un valor de pH constante y adecuado a las

condiciones óptimas de la enzima (generalmente, entre 7'5 >" S'O); suele ser un Tris-
HC1 entre 10 y 50 mM,
iones Mg2*, requeridos como cofactor por todas las endonudeasas, a una
concen¬tración de alrededor de 10 mM.

Agentes reductores, en cuya presencia la reacción de restricción es más eficaz; gene-

ralmente se usa 2-mercaptoetanol (2ME) o ditiotreitol (DTT).' Sal, casi siempre NaCl
o, en su lugar, acetato potásico; es uno de ¡os parámetros más variables en los medios
de digestión de jas distintas enzimas: algunas presentan su actividad óptima en
ausencia de sal, otras, sin embargo, requieren grandes concen¬traciones (hasta 150
mM), y muchas funcionan mejor en medios salinos intermedios; ciertas endonudeasas
son más activas en medios con K*, mientras que otras incluso son inhibidas por este
catión.

En algunos casos se recomienda la adición de otros compuestos, como la albúmina de

suero bovino (BSA) en digestiones prolongadas o algún detergente como el Tri¬tón X-
100.
5.6. Un caso real "Las tijeras de DNA"

El concepto de modificación y restricción del DNA se puso por primera vez de

manifies¬to cuando Werner Arber y su grupo del Laboratorio de Biofísica de la
Universidad de Gine¬bra estaban explorando los mecanismos moleculares del control
de la modificación del geno-ma del bacteriófago lambda por la bacteria Escherichia
coii(l). Estos investigadores observaron que si el DNA del fago con el que se trataba
de infectar un determinado huésped no había sido modificado por las enzimas de ese
huésped o había sido modificado inapropiadamente por las enzimas de otro huésped, la
infección era abonada o, lo que es lo mismo, la infección era restringida o limitada para
este DNA. A las actividades de las enzimas involucradas en estos procesos de
modificación/restricción se las denominó DNA metiiasas M y endonucleasas de
restricción R. Aunque se estudiaron distintas bacterias y fagos, la bacteria y el fago
sobre los que se realizaron los estudios más detallados en estos primeros momentos
fueron sin duda £ co/;'y el fago lambda y, por eso, estos dos microorganismos son
considerados como las pri¬meras estrellas del desarrollo de la Biología Molecular.

Revisando los trabajos pioneros, resulta curioso, a la vista de lo que se sabe

actualmen¬te sobre estas enzimas, que todavía en 1969 Arber escribiera en una
famosa revisión que "la restricción produce la escisión endonucleoiítica de Jas
moléculas del DNA, que presumi-blemente ocurre en sitios específicos" (2). Por
entonces, el grupo de Meselson apenas había conseguido una preparación parcialmente
purificada de la endonucleasa de restricción de E. coliK (3) y aún no se sabía cómo se
llevaba a cabo el reconocimiento del DNA por la enzima de restricción. Ahora bien, el
escaso número de fragmentos que se generaba con estas preparaciones más
purificadas era un claro indicio de que existía una cierta especifi¬cidad en la actividad
de estas enzimas. Apenas unos años más tarde se llevarían a cabo ¡os primeros
experimentos de recombinanción in vitro utilizando estas enzimas. Aunque Arber
intuía a finales de la década de los sesenta que las enzimas de restricción podrían
tener cier¬ta utilidad, ya que decía que "esta actividad podría ser usada para obtener
poblaciones homogéneas de fragmentos de DNA para estudiar la función de regiones
específicas de la molécula de DNA", posiblemente no se imaginaba la tremenda
repercusión que sus estu¬dios tendrían en el desarrollo posterior de la Ingeniería
Genética y de la moderna biotec¬nología. Por ello no es sorprendente que unos años
más tarde, en 1978, le concedieran el Premio Nobel de Medicina y Fisiología debido a
estos trabajos, demostrando una vez más cómo la investigación básica puede generar
incluso a corto plazo unos resultados con una aplicaciones prácticas tan
espectaculares.

5.7. Más sobre el tema "Otras enzimas de restricción"

En algunas ocasiones, cuando el ingeniero genético pretende hacer un mapa de un

cromosoma o de un genoma completo, necesita cortar el DNA de tal forma que
obtenga un número suficientemente pequeño de fragmentos para que el ensamblaje
sea sencillo. Para ello ha de utilizar enzimas de restricción cuya secuencia de
reconocimiento de corte sea poco abundante en el correspondiente genoma. Teniendo
en cuenta el contenido en G+C del genoma que se quiere fragmentar es posible
predecir qué enzimas producirán un menor número de cortes. Por otro lado, se conocen
algunas enzimas que reconocen secuencias, palindrómicas de más de seis nucleótidos y
que por lo tanto existen en menor frecuencia en los genomas. Más recientemente se
ha puesto a disposición de los ingenieros genéticos una nueva herramienta muy útil
para la construcción de mapas y el análisis genómico: las endonucleasas codificadas por
intrones. Desde hace tiempo se sabe que algunos intrones . nucleares, de mitocondrias,
de cloroplastos o incluso intrones de bacteriófagos codifican endonucleasas de
restricción. Se supone que desempeñan un papel en la inserción del intrón en alelos
carentes del mismo. Por otra parte, también se conoce que ciertas proteínas llamadas
internas pueden procesarse y generar endonucleasas.

En función de su origen, las nuevas endonucleasas se dividen en dos grandes grupos:las

que derivan de la traducción de fragmentos de RNA resultantes del procesamiento de
un RNA precursor, que se denominan con el prefijo "I", y las que derivan del
procesamiento de inteínas, que se denominan con el prefijo "PI". Los miembros de
ambos grupos poseen una cierta especificidad por el sitio de corte que se produce en
las dos hebras del DNA, reconociendo secuencias de 10 a 12 nucleótidos. Ambos tipos
de enzimas aceptan un cierto grado de degeneración en la secuencia de
reconocimiento del DNA que no está bien establecido en todos los casos. El número de
cortes que producen en un determinado DNA puede variar también en función del
tampón utilizado, de la concentración de enzima y del tiempo de corte empleado, lo
que significa que dependiendo de las condiciones de reacción pueden manifestar una
actividad "estrella". . •

Actualmente varias de estas enzimas pueden adquirirse comercialmente y se preparan

mediante su hiperproducción en estirpes recombinantes de Escbericbia coli. Entre
ellas se encuentran las enzimas l-Ceul, I-Ppol, PI-77Ü, Pl-Pspl o la Pl-Scel. Por ejemplo,
la enzima l-Ceul está codificada por el intrón del gen del rRNA de cioropiasto de
Chlamydomonas eugametos. Esta enzima reconoce la secuencia 5 -
TAACTATAACGGTCCTAA 'GGTAGCGA-3' y corta por el sitio marcado generando
extremos 3'protuberantes